全 文 ：药物分析杂志 C i h n J p ham rA na l 205
,
2 5 ( 9 ) 一 10 89 一
R P 一 H P L C 法测定三七叶中黄酮类成分的含量
郑莹 , 李绪文 , 金永 日 ’
(吉林大学化学学院分析化学系 长春市 1300 21 )
摘要 目的 : 对三七叶中的 2 种主要黄酮类成分山奈酚 一 3 一 O 一 p 一 D 一 半乳糖 ( 2* 1) 葡萄糖昔 ( I )与棚皮素 一 3 一 O 一 p -
D 一半乳糖 (2 * l) 葡萄糖昔 ( n )进行含量测定 。 方法 : 采用反相高效液相色谱法 ,使用 z 0 R BXA E xt en d C l: 柱 ( 250 m m x
4
.
6 ~
,
5 林m ) , 流动相为甲醇 一 0 . 巧 % 乙酸水溶液 ( 3:5 65 ) ,流速 1 . Z mL · m in 一 ’ , 检测波长 268 lun , 柱温 25 ℃ 。 结果 : 山奈
酚 一 3 一 0 一 日一 D 一 半乳糖 (2 * l) 葡萄糖昔与棚皮素 一 3 一 。 一 p 一 D 一半乳糖 ( 2~ l) 葡萄糖昔在进样量 0 . 5 一 20 林g 范围内均
有良好的线性关系 ,相关系数 厂皆为 0 . 9 99 ; I 的平均加样回收率为 97 . 5 % , RS D 为 0 . 78 % ; n 的平均加样回收率为 101 . 8% ,
RS D 为 1 . 1% 。 结论 :方法简便快捷 , 准确度高 。
关键词 :三七叶 ;黄酮 ;反相高效液相色谱法 ;含量测定
R P 一 H P L C D e t e r m i n s it o n o f F 18 v o n o id s i n ht e L e s v e S o f
aP
n ax oN t
o g in s e gn ( B
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.
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Z H E N G Y i n g
,
L l X u 一 w e n , J I N Y o n g 一 ir
( D
e part m
e n t o f an al yt i
e al Ch e而 s t叮 Of JIL i n un i v e sr iyt , C han g e h u n 13 0() 2 l , C h i n a )
A bs t ar c t O bj e e t i
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n e m a in fl a v o n o id s 1 k a e m p fe or l 3 一 0 一 ( 2
,` 一
p
一 D 一 g l u e o p万an o s y l ) 一 日一 D
一脚 a e to v畔 n o s id e a n d 1 q u e cr e t i n 3 一 O 一 ( 2 即 一 p 一 D 一 g lu e o pyr a n o s y l ) 一 p 一 D 一 g a l a e t o p yar n o s id e ) i n t h e
l e a v e s o f 夕a
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t卿sn e鳍 b y RP 一 H PL C . M e ht o ds : hT e s e p ar a t i o n w as p e for mr e d o n Z O R BA X E x t e n d C zs e o l -
u m n ( 2 5 0 m m
x 4
.
6 m m
,
5 卜m ) , u s i n g 3 5% m e t h an o l a n d 6 5% w a t e r/ a e e ti e a e id m i x ut er ( 10() / 0
.
15 v八 ) a s
m o b i l e p h a s e w iht t h e fo l l o w i n g r at e o f 1
.
2 m L
·
m i n
一 ’ a t 2 5 ℃ , th e w va e l e n gt h fo r m e a s u er m e n t w a s 2 6 8 n m . eR -
sul st
:
hT
e e al ib ar t io n e u vr e s w e r e l i n e ar in th e r an g e o f 0
.
5 一 加 林9 fo r e o m p o u n d s l ( r = 0 . 9 9 9 9 , n = 6 ) a n d l ( r
二 0
.
9 9 9 9
, n = 6 )
.
hT
e a v e ar g e r e e o v e ir e s o f e o m p o u n d 1 w a s 9 7
.
5% ( RS D
= 0
.
7 8% )
,
an d t h a t of e o m p o u n d l
w a s 10 1
.
8% ( R SD
= 1
.
10% )
.
C o n e hi s i o n : T h i s m e th o d 15 a e e u ar t e a n d r e p or d u e ib l e
.
eK y wo
r ds : l e va e s o f p a ~ 朋 ot g i snj e咭 ; fl va o on id s ; RP 一 HP L C
三七 〔aP an : No t og i sn e gn ( B u kr . ) F . H , 。h en 〕为 献对照 〔’ 」 , 2 鉴定了 6 种黄酮类化合物 ,其中山奈酚
五加科人参属多年生草本植物 ,是一种用途广泛的 一 3 一 O 一 p 一 D 一半乳糖 (2 一 l) 葡萄糖昔 ( I )与懈
中药材 。 药理研究表明 , 三七具有抗氧化 、 抗衰老 、 皮素 一 3 一 O 一 p 一 D 一半乳糖 (2 。 l) 葡萄糖昔 ( n )
抗炎 、护肝利胆 、止血 、 抗心肌缺血 、抗心律失常 、扩 皆为首次从该植物中分离得到 (结构式参见图 1 ) ,
张血管和降压等作用 。 有文献表明三七黄酮能明显 而且二者的含量约占其总黄酮含量的 95 % 以上 。
增加心肌冠脉流量 , 而且三七黄酮与皂昔合用生理 根据文献报道的相关黄酮类化合物 HPL C 含量测定
活性最强 〔’ ; 。 至今为止 , 三七 中的黄酮类成分的含 方法 [’, , 〕 ,最终确立了这两种黄酮类化合物的 R P -
量测定仅限于紫外分光光度法测定总黄酮 [’ 〕 , 单体 H PL c 含量测定方法 , 测定了三七叶中山奈酚 一 3 -
化合物的含量测定尚未见文献报道 。 我们对三七叶 0 一 日一 D 一 半乳糖 (2 一 l) 葡萄糖昔 ( I ) 与懈皮
中黄酮类成分进行 了分离 , 通过理化性质 及 IR , 素 一 3 一 O 一 日一 D 一半乳糖 ( 2、 l) 葡萄糖昔 ( n )的
UV
,
M S
, ’
H N M R
, ” e N M R等光谱数据分析 , 并与文 含量 。
* 通讯作者 ( e o er s p o n d i n g a u ht o r )
DOI : 10. 16155 /j . 0254 -1793. 2005. 09. 011
一 10 90一 药物分析杂志 h C in JPh ~ Al l己 2 (X ) 5, 25 ( 9)
ir g l 化学物 I 和 11化学结构式 ( Ch俪 e al sutr ~ of c o m op u五d l助 d l )
R t 二 0 一 日一 D 一 alG (2 * 1) 一 p 一 D 一 leG 几 一 H , 为山奈酚 一 3 -
0 一 p 一 D 一半乳糖 (2 * l) 葡萄糖昔(化合物 )I (玩m沙 m 1 3 一 0 一 ( 2”
一
p
一 D 一砂u e o p” an 佣 y l ) 一 p 一 D 一 g目朋 t o p” 叨加记e ,印m即u n d l) ;
R , = 0 一 p 一 D 一 alG ( 2* l )
一 日一 D 一 G lc R: 一 O H , 为搽皮素 -
3 一 。 一日一 D 一半乳糖 (2 。 l) 葡萄糖昔 (化合物 卫 )( qu , ` n 3 -
0 一 ( 2
仲 一
p
一 D 一 gl u e o p yar n o sy l ) 一 p 一 D 一 gal ac ot p” 旧 n ios d e
, e o m
-
Po u n d 11
1 仪器 、 样品及试剂
1
.
1 仪器与试剂 A颐len t n o S ier es 高效液相色
谱仪 , A igl en t 1 0 工作站 。 甲醇为色谱纯 , 乙酸为
分析纯 ,水为重蒸水 。
1
.
2 供试品 本实验所用的原料采 自云南省文山
州 ,经吉林大学药学院生药教研室王广树教授鉴定
确认为三七【aP ~ No to g乙sn e gn ( B u kr
.
) F
.
H
.
hc en 〕
的叶 。
1
.
3 对照品 山奈酚 一 3 一 O 一 p 一 D 一半乳糖 ( 2、
l) 葡萄糖昔 、撇皮素 一 3 一 O 一 p 一 D 一 半乳糖 ( 2、
l) 葡萄糖昔为自制 。 按本文色谱条件 ,归一化法测
得山奈酚 一 3 一 0 一 p 一 D 一 半乳糖 ( 2一 l) 葡萄糖昔
纯度为 9 . 2% , 榭皮素 一 3 一 O 一 p 一 D 一 半乳糖
( 20 1) 葡萄糖昔纯度为 9 . 0% 。
2 色谱条件
z 0 RB AX E xet nt C
l: 柱 ( 2 5 0 m m x 4 . 6 un
,
5 林m ) ,流动相为甲醇 一 0 . 15 % 乙酸水溶液 ( 35 :
6 5 )
,流速 1 . 2 m L · 而 n 一 ` , 检测波长 2 6 5 n m ,柱温 2 5
℃ 。
3 方法学考察
3
.
1 线性关系的考察 精密称定化合物 I 、化合物
n对照品适量 ,分别配制成浓度为 0 . 05 , 0 . 1 , 0 . 25 ,
0
.
5
,
1
.
0
,
2
.
0 m g
·
m L
一 ’ 的对照品溶液 , 分别取上述
对照 品溶液 or 林L , 注入液相色谱仪 , 结果表明在
0
.
5 一 2 0 哪 范围内 ,化合物 l 、化合物 n进样量 ( X ,
林g )与峰面积 ( )Y 均呈现良好的线性关系。 化合物
I
、
n 的标准曲线分别为 :
Y = 1 3 12
.
SX + 9 2
.
s r = 0
.
9 9 99
液连续进样 6 次 ,化合物 I 、 化合物 1 的 6 次进样的
峰面积的 RSD 值分别为 0 . 26 % , 0 . 4 % 。
3
.
3 重复性实验 取含量均匀的粗黄酮样品 ,精密
称定 5 份 ,测得化合物 I 含量的 RS D 值为 0 . 41 % ,
化合物 n含量的 SR D 值为 0 . 43 % 。
3
.
4 回收率实验 精密称定化合物 I 对 照 品
10
.
3 m g
、 化合物 n 对照 品 10 . 7 m g 分别放入
5 0 m L容量瓶中 , 加水溶解并稀释至刻度 。 另取已
知含量的样品 (化合物 I 的含量 21 . 79 % ,化合物 1
的含量 14 . 75 % ) 5 份 ,每份约 30 m g ,放人25 m L量
瓶中 ,每瓶分别加人化合物 I 对照 品溶液 2 . s mL ,
化合物 n 对照品溶液 3 . 75 m L 后 ,加水定容至刻度 ,
按含量测定项下方法测定 , 计算回收率 。 化合物 I
平均回收率为 97 . 5% , SR D 为 0 . 78 % , 化合物 1 平
均回收率为 101 . 8% , R SD 为 1 . 1% 。
3
.
5 样品稳定性实验 取供试品溶液 , 在 O 一 1h2
内每隔 Z h 进样一次 , 进样量均为 or 协L , 测定峰面
积 , 计算其 RSD 值 ,化合物 I 为 0 . 42 % ,化合物 1 为
0
.
5 4 %
。
4 含量测定
4
.
1 对照品溶液制备 取化合物 I 、化合物 n 对照
品适量 , 精密称定化合物 1 10 . 3 m g 、 化合物 五
10
.
7 m g 置 5 0 m L 容量瓶中 , 加水溶解并稀释至刻
度 。 分别精密量取上述溶液各 1 . 25 m L 置 同一
10 m L量瓶中 ,用水定容至刻度 ,摇匀即得 。
4
.
2 供试品溶液制备 取干燥的三七叶细粉 (过
4 0 目筛 ) 10 9 ,加 1 0 0 m L 氯仿 , 水浴 ( 6 5 ℃ ) 回流两
次 , 每次 l h ,弃去氯仿液 。 将经过氯仿回流后的三
七叶用甲醇提取三次 ,每次加人甲醇 10 m L ,水浴
( 6 5 ℃ ) 回流 , 时间分别为 2 , 1 . 5 , l h ,合并提取液 ,
蒸干溶剂后加水溶解并定容至 10 . 0 m L , 过滤 , 取
续滤液做为供试品溶液 。
4
.
3 测定 分别取上述对照品溶液和供试品溶液
各 or 林L , 注人高效液相色谱仪 , 记录色谱图 , 按外
标法以峰面积计算样品中化合物 I 与化合物 n 的含
量 (色谱图参见图 2 , 3 , 4 ) 。 结果三七叶中山奈酚 -
3 一 0 一 p 一 D 一 半乳糖 ( 2* l) 葡萄糖昔的含量为
0
.
21 %
,懈皮素 一 3 一 O 一 p 一 D 一 半乳糖 ( 2* l) 葡
萄糖昔的含量为 0 . 38 % 。
5
.
1
讨论
测定波长的选择
r = 0
.
9 9 9 9
化合物 n 皆在 268 n m
2 6 5 n m为测定波长 。
紫外光谱图显示化合物 I 、
附近有最大吸收 , 故选定
Y = 1 15 7
.
6X 一 7 5
.
3
.
2 精密度实验 取化合物 I 、化合物 n 对照品溶
药物分析杂志服 n J Ph~ n Al 2a00 5, 2 5 ( 9) 一 1 0 9 1 一
.曰口. . . . . . .口 , . . . 口
一 一 一 一0 2 4 6 8 10 12 14A 析 )实验未检测到氯仿提取液中含有上述两种成分的斑点 , 因此认为该杂质除去方法不影响甲醇提取回收率的测定 。
5
.
4 将样品 (干燥的三七叶细粉 , 40 目 )按 4 . 2 方
法提取和一次用索氏提取器回流 6 h 方法提取对比
可知 ,前者的 H P L C 测定结果略高于后者 ,但二者间
不存在显著性差异 , 因此采用 4 . 2 的方法对样品溶
液进行制备 。
5
.
5 本测定方法可以准确 、便捷地测定三七叶中黄
酮类成分 ,为三七资源的开发利用提供了理论依据 。
图2 空白( A )标准品 ( B) 供试品 ( )C 溶液色谱图
珑 2 C hlo m t o gr ar 此 Of n e g a t l v e ( A ) r e fe er n e e sub satn e e s ( B ) an d o am pl e
( C )
L 摒皮素 一 3 一 o 一 p 一 D 一 半乳糖 ( 2 、 1) 葡萄糖昔「P e ak 1 15
b犯口feP or l 3 一 0 一 ( 2
即 一
p
一 D 一 gl u e o p y r氏n o s y l ) 一 p 一 D 一 gal ac t
o p介
~
de 」 2 . 山奈酚 一 3 一 0 一 p 一 D 一 半乳糖 ( 2 0 1) 葡萄糖昔「P e ak
2 15 qu
e二 e it n 3 一 0 一 ( 2 仲 一 日一 D 一 gl u e op ” 卫 n o s yl ) 一 p 一 D 一脚 a e ot -
p” 叨 o s id e〕.
5
.
2 流动相选择 以甲醇 一 水与乙腊 一水为流动
相皆能获得较好的分离效果 , 但有拖尾现象 , 在水
中加人 0 . 巧 % 的乙酸以后峰形得到明显改善 。 考
虑到试剂的价格问题 , 故采用甲醇 一 0 . 15 % 乙酸
水溶液 ( 35 : 65 ) 作为流动相 , H PL C 色谱 图参见
图 2 。
5
.
3 氯仿回流 2 次并弃去氯仿提取液的目的是为
除去脂溶性成分 , 便于 RP 一 H P LC 分析 。 本研究分
析的两种黄酮类成分的极性很大 , 经 T L C (薄层层
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(八角莲水
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(本文于 2X() 5 年 3 月 29 日修改回 )