全 文 ：书第 41 卷 第 9 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 41 No． 9
2013 年 9 月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Sep． 2013
1)国家自然科学基金(30972083) ;吉林省科技发展计划项目
(20090574)。
第一作者简介:胡薇，女，1966 年 1 月生，吉林农业大学生命科
学学院，副教授。
收稿日期:2012 年 12 月 11 日。
责任编辑:程 红。
鹿茸顶端组织端粒酶活性检测及 TEＲT基因的差异表达1)
胡 薇 李 沐 李 婷 田玉华 孟星宇 刘 宁
(吉林农业大学，长春，130118)
摘 要 为了检测梅花鹿鹿茸顶端组织不同部位的端粒酶活性及端粒酶逆转录酶(TEＲT)基因的 mＲNA 表
达水平，分离鹿茸顶端组织的茸皮层、间充质层及软骨层，并进行细胞培养，利用 TＲAP 银染法测定不同部位的端
粒酶活性。再利用 TＲIzol试剂法分别提取茸皮层、间充质和软骨细胞的总 ＲNA，逆转录合成 cDNA。根据 Gen-
Bank已发表的相关序列设计梅花鹿 TEＲT基因部分序列特异引物并克隆 TEＲT基因，采用相对荧光定量 Ｒeal－time
PCＲ法检测 TEＲT在鹿茸顶端不同部位细胞的表达丰度。结果表明:在鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层和软骨层
均检测到了端粒酶活性，其中间充质层的端粒酶活性最高，软骨层次之，茸皮层端粒酶活性最低;而体外培养的不
同代数间充质细胞的端粒酶活性无明显差异。成功获得了鹿茸组织 TEＲT基因部分编码区 cDNA序列，该基因长
915 bp，编码 305 个 AA;与牛、羊 TEＲT基因进行同源性分析显示，核苷酸序列分别为 94． 89%和 94． 31%;氨基酸序
列分别为 92． 16%和 92． 11%。相对荧光定量 PCＲ差异分析发现，TEＲT基因在鹿茸顶端不同部位组织均有表达。
其中，在间充质组织的表达水平高于软骨和茸皮层组织。
关键词 梅花鹿;鹿茸;端粒酶;端粒酶逆转录酶;荧光定量;差异表达
分类号 Q786
Detecting Telomerase Activity and Differential Expression Analysis of TEＲT Gene in Antler Tip Tissue /Hu Wei，
Li Mu，Li Ting，Tian Yuhua，Meng Yingyu，Liu Ning(Jilin Agriculture University，Changchun 130118，P． Ｒ． China)/ /
Journal of Northeast Forestry University． －2013，41(9)． －113 ～ 118
In order to detect the telomerase activity of different parts of top tissue of sika deer antler and mＲNA expression of
TEＲT gene，the skin of antler，mesenchymal layer and layer of cartilage were separated from the antler tip tissue and cul-
tured． TＲAP silver staining was improved to detect the telomerase activity of different parts． And total ＲNA of cartilage
layer and the skin layer of antler and mesenchymal layer were isolated by TＲIzol reagent to use reverse transcription for
synthesizing the cDNA． According to the correlation sequences that GenBank published，sika TEＲT gene partial sequence
special primers were designed and the gene was cloned． The relative fluorescence quantitative real-time PCＲ was used to
detect the expression abundance of TEＲT in the cell，which is in the different parts of the antler top． The telomerase activi-
ty was detected on skin of antler，mesenchymal layer and layer of cartilage from the antler tip tissue respectively． Com-
pared with their telomerase activity，the telomerase activity of mesenchymal is the highest，the telomerase activity of the
layer of cartilage is the higher and the telomerase activity of the antler cortex is the lowest． Telomerase activity of different
generation mesenchyma cells cultured in exterior has no significant difference． We obtained the partial coding cDNA se-
quence of TEＲT gene． The gene length is 915 bp，encoded with 305-amino-acids-long peptide． Compared with other two
species，the homology of TEＲT to cattle and sheep are 94． 89% and 94． 31%，respectively，but the homology of protein
are 92． 16% and 92． 11%，respectively． By fluorescence quantification，TEＲT cDNA is distinctly up-regulated in skinlay-
er，mesenchyme layer and cartilage layer from growing antler tip． In the mesenchymal tissue，the expression level of TEＲT
gene is higher than in the cartilage tissue and the antler skin tissue．
Keywords Sika Deer;Antler;Telomerase;Telomerase reverse transcriptase;Fluorescence quantification;Differen-
tial expression
鹿茸是梅花鹿的雄性第二性征，每年可周期性
的脱落与再生，是哺乳动物中唯一的可再生器官，它
的生长发育受特定的分子机理调控。国内外研究发
现，鹿茸再生与其它低等生物的断肢再生不同，是一
个依赖于干细胞的过程［1－3］。此外，在哺乳动物中，
鹿茸的生长速度也是其他组织器官所无法比拟的，
在鹿茸生长最旺盛阶段，它以 1 ～ 2 cm /d 的速度快
速生长，其顶端增殖区细胞的增殖速度比肿瘤细胞
还快，但与肿瘤不同的是鹿茸的生长受到了很好的
调控，在维持高速生长的同时并未出现任何癌变迹
象［4－5］。鹿茸的这些独特之处使它成为了肿瘤医学
和再生医学的研究热点。端粒酶是一种逆转录酶，
它由 3 个亚单位构成，即 ＲNA亚单位(TＲ) ，端粒酶
催化亚单位(TEＲT)和端粒酶蛋白亚单位(TEP1)。
端粒酶能以自身 ＲNA 为模板，催化合成端粒末端
(TTAGGG)n序列，使端粒延长，从而延长细胞的寿
命甚至使其永生。利用 TＲAP法可以检测到端粒酶
在肿瘤细胞及干细胞中的高活性表达，但在正常细
胞中却检测不到端粒酶活性［6］。目前研究表明，有
端粒酶活性的细胞几乎均存在 TEＲT 的表达，但在
正常细胞中虽有 TＲ 和 TEP 的表达，却没有 TEＲT
的表达，这说明端粒酶活性主要由 TEＲT 的表达水
平的高低决定［7－8］。TEＲT 是端粒酶的主要组成部
分，TEＲT 基因 mＲNA 表达水平与端粒酶活性存在
良好的相关性［9－10］。因此，本研究旨在采用 TＲAP
法检测鹿茸顶端增殖区各组织部位的端粒酶活性，
以及检测体外不同培养代数鹿茸间充质干细胞的端
粒酶活性。在此基础上克隆了梅花鹿 TEＲT 基因的
部分序列，利用相对荧光定量 PCＲ 技术分析 TEＲT
基因在鹿茸顶端增殖区的表达水平，探讨鹿茸的再
生发育与端粒酶活性的关系，期望为深入研究鹿茸
生长调控的分子机理提供新思路。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
新鲜东北梅花鹿鹿茸于 2012 年 6 月采自吉林
农业大学试验鹿场 1 头 4 岁左右的健康雄鹿，保存
于液氮中带回实验室备用。胰蛋白酶、透明质酸酶、
胶原酶 I、胶原酶 II 购自 Sigma;胎牛血清和 DMEM
高糖培养基购自 Hyclone;TＲIzoL 试剂购自 Invitro-
gen公司，pMD－18T vector、Ex Taq DNA聚合酶、Oli-
gdT、dNTPs、AMV逆转录酶、限制性内切酶 XbaⅠ和
HindIII、DL － 2000 Marker 购自 TaKaＲa 公司，Ｒeal
Master Mix购自长春宝泰克公司。
1． 2 鹿茸细胞培养
按照 Li等的取材方法［11］，在解剖显微镜下定
位并分离鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层和软骨层。
采用酶消化法，将不同部位组织剪成约 1 mm 的小
块，用胶原酶Ⅰ和透明质酸酶 37 ℃消化 1． 5 h，再加
入胶原酶Ⅱ继续消化 3 h。当观察到大量细胞从组
织块中游离出来时，1 000 r /min离心 5 min。将离心
收集的细胞与组织块加入含 10%血清的 DMEM 培
养液，置于培养箱中 37 ℃、5%的 CO2 继续培养。
1． 3 鹿茸细胞端粒酶活性检测
取对数生长期的茸皮层细胞、间充质细胞和软骨
细胞，当细胞丰度达到 80%时，用胰蛋白酶消化并离
心收集细胞，向细胞沉淀加入 CHAPS 裂解液 200 μL
(预先加入 PMSF和巯基乙醇) ，冰浴裂解 30 min。4
℃、12 000 r /min离心 30 min，吸取上清并分装。
以小鼠 MA782 细胞的端粒酶提取液为阳性对
照，采用端粒重复扩增(TＲAP)法［12］检测端粒酶活
性，引 物 序 列 分 别 为 5 － TCACCTTGTAATC-
CGTCGAGCAGAGTT－3(TF)和 5 －CAACAT CTC-
CACTACCTTCTAACCGTAACC－ 3(TＲ)。TＲAP 反
应体系为 50 μL 其组分为 10 ×TＲAP 缓冲液(200
mmol /L Tris－HCl，pH = 8． 3，15 mmol /L MgCl2，1%
Tween－ 20(V /V) ，630 mmol /L KCl，10 mmol /LEG-
TA)5． 0 μL、dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 50 μmol
(采用蜡封的方式将 dCTP 与总体系分开) ，TF 引物
和反向引物 TＲ各 15 pmol，Taq聚合酶 2 U，模板 2． 0
μL，加入无菌 DEPC 处理的水至 50． 0 μL。反应条
件为 25 ℃保温 20 min，反转录合成端粒酶产物，90
℃加热 3 min灭活端粒酶(在此期间将石蜡熔化以
便 dCTP进入总反应体系) ，PCＲ扩增(94 ℃ 30 s，64
℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30 个循环)。通过 12%非变性
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 PCＲ产物。
1． 4 不同培养代数鹿茸间充质干细胞端粒酶活性
的检测
用含有 10%胎牛血清的 DMEM 培养鹿茸间充
质干细胞，当细胞丰度达到 80%时即可传代，分别
收集 1 代至 5 代的鹿茸间充质干细胞，提取端粒酶
并用 TＲAP法检测端粒酶活性。
1． 5 鹿茸细胞总 ＲNA提取与双链 cDNA的合成
待鹿茸细胞丰度达到 80%以上时收集细胞，按
照 Trizol操作手册分别提取茸皮层细胞、间充质细胞
和软骨细胞样品总 ＲNA，1． 0%琼脂糖凝胶电泳检测
总 ＲNA质量。以提取的总 ＲNA为模板，以 Oligo－dT
为引物，以逆转录酶 AMV反转录合成双链 cDNA。
1． 6 梅花鹿 TEＲT基因部分序列的克隆与序列分析
参照 GenBank中相关序列，设计 TEＲT 基因特
异性引物(上游引物:GCCAGAGTCGTG CAGAGG和
下游引物:CTTTGACGAACCCTTGGT) ，以 cDNA 为
模板进行 PCＲ 扩增，利用 DNA 凝胶回收试剂盒回
收 PCＲ产物，将回收产物连接到 pMD18－T载体上，
转化大肠杆菌 DH5α中，涂板并于 37 ℃培养。挑取
转化菌落，接种于 LB液体培养基，37 ℃振荡培养过
夜，采用碱裂解法小量提取质粒并将鉴定正确的重
组质粒送北京三博远志公司测序。并将测序结果分
别与 GenBank 中 牛 (NM _ 001046242)和 羊
(EU139124． 1)的序列进行同源性分析。
1． 7 相对荧光定量 PCＲ 法检测鹿茸细胞 TEＲT 基
因的表达水平
合成用于 TEＲT基因的特异引物(上游引物 5－
CTGCGCCTACCAGGTGTGT － 3 和下游引物 5 －
CCGTGGCAGCCTTTCG－3，扩增片段长度为 96 bp，
荧光探针:FAM － CGCCGCTCTACGAC CTCCGC －
TAMＲA。以鹿的持家基因 actin(GenBank 登录号:
AY345228)作为内参基因，合成 actin 引物(上游引
物 5－TGACCCTTAA GTACCCCATCGA－3和下游引
物 5－TTGTAGAAG GTGTGGTGCCAGAT－3) ，扩增
片段 长 度 为 85 bp，荧 光 探 针:FAM － CACG-
GCATCGTCACCA ACTGGGA－TAMＲA。
以鹿茸细胞 cDNA为模版，PCＲ分别扩增 TEＲT
和 actin。PCＲ 体系:cDNA 模板 6． 00 μL，上下游引
物各 1． 00 μL，dNTP 2． 00 μL，10×Ex Taq buffer 2． 50
μL，Ex Tag 0． 25 μL，加去离子水至 25 μL。反应条
件:94 ℃预变性 5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃
30 s，进行 40 个循环。采用 Ｒeal Master Mix 试剂和
7500 Ｒeal Time PCＲ System 分析 TEＲT 基因在茸皮
层细胞、间充质和软骨细胞中的表达水平。Ｒeal －
time PCＲ体系:1ng总 ＲNA反转录的 cDNA，上下游
引物各 5 pmol，10 μL real Master Mix，总体积为 25
411 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41 卷
μL。反应条件:94 ℃激活 DNA 聚合酶 3 min;94 ℃
变性 30 s;59 ℃复性 30 s;68 ℃延伸 45 s;进行 40 个
循环。使用 StepOne Software v2． 1 软件分析 TEＲT
相对内参 actin基因的差异表达 C t 值(C t 为荧光达
到荧光阈值的循环数)。
2 结果与分析
2． 1 鹿茸顶端不同组织细胞的端粒酶活性检测
TＲAP法检测结果(图 1)显示，在鹿茸顶端增
殖区茸皮层细胞、间充质细胞及软骨细胞中均检测
到端粒酶活性，与小鼠 MA782 细胞相比，端粒酶活
性在间充质细胞、软骨细胞和茸皮层细胞中依次降
低，其中，间充质干细胞中端粒酶活性最高。
1、5．阳性对照(小鼠 MA782 细胞) ;2．茸皮层细胞;3．软骨层细胞;4．
软骨层细胞。
图 1 鹿茸顶端不同组织细胞的端粒酶活性检测结果
2． 2 不同培养代数鹿茸细胞的端粒酶活性检测
采用 TＲAP法进行端粒酶活性的测定。与对照
组小鼠乳腺癌细胞相比，不同代数间充质干细胞端
粒酶活性变化无明显差异。说明鹿茸再生过程与端
粒酶活性呈一定的相关性，端粒酶可能是研究鹿茸
再生机理的一个很重要的方向(图 2)。
1．阳性对照(小鼠 MA782 细胞) ;2． 培养 1 代间充质细胞;3． 培养 2
代间充质细胞;4．培养 3 代间充质细胞;5． 培养 4 代间充质细胞;6．
培养 5 代间充质细胞。
图 2 体外培养 1 代至 5 代的间充质细胞端粒酶活性
2． 3 鹿茸顶端组织总 ＲNA的提取
各样品总 ＲNA经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，
28S、18S和 5S 3 条带清晰可见(图 3) ，表明所提取
的茸皮层、间充质和软骨组织总 ＲNA质量符合定量
PCＲ分析用标准，未发生 ＲNA明显降解。
1．茸皮层细胞总 ＲNA;2．间充质细胞总 ＲNA;3．软骨细胞总 ＲNA。
图 3 鹿茸顶端组织 ＲNA提取结果
2． 4 TEＲT基因部分序列的克隆
TEＲT基因 PCＲ扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳
得到约 915 bp的 1条特异性条带(图 4) ，与预期结果
相符。提取重组质粒，用 XbaⅠ和 HindIII 双酶切质粒
pMD－18T－TEＲT(图 5)。从图 4 中可看出，可获得与
目的带大小相符的电泳条带 915 bp，表明克隆成功。
1． PCＲ产物;2． DL2000 maker。
图 4 TEＲT基因部分序列克隆 PCＲ鉴定结果
1． PCＲ产物;2．双酶切产物;3． DL2000 maker。
图 5 TEＲT基因部分序列克隆双酶切鉴定结果
511第 9 期 胡 薇等:鹿茸顶端组织端粒酶活性检测及 TEＲT基因的差异表达
2． 5 TEＲT基因的部分 cDNA序列分析
梅花鹿 TEＲT基因部分序列与 GenBank 中牛和
羊的核苷酸和氨基酸序列 Blast分析结果显示:梅花
鹿 TEＲT基因编码区部分 cDNA为 915 bp，核苷酸序
列与牛、羊的同源性分别为 94． 89%和 94． 31%(图
6) ;氨基酸序列同源性分别为 92． 16%和 92． 11%
(图 7)。
2． 6 TEＲT基因在鹿茸顶端组织中的表达水平
以鹿茸顶端组织 cDNA 为模版，PCＲ 分别扩增
actin和 TEＲT。actin扩增长度为 85 bp，TEＲT 扩增
片段长度为 105 bp，见图 8。利用 Ｒeal time PCＲ 的
方法，使用梅花鹿 actin 作为内源参照基因，每个样
本做 3 个重复，检测 TEＲT 基因在鹿茸组织不同部
位的表达丰度。通过 ＲT－PCＲ 和 Ｒeal time PCＲ 检
测分析发现，在鹿茸顶端组织不同部位 TEＲT 基因
mＲNA表达水平存在明显的表达差异，其中茸皮层
细胞、软骨细胞和间充质细胞中 TEＲT 基因的表达
量呈递增趋势(图 8 和表 1)。
．代表与梅花鹿核苷酸相同;－代表核苷酸缺失。
图 6 梅花鹿、牛、羊 TEＲT基因核苷酸序列分析结果
611 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41 卷
．代表与梅花鹿氨基酸相同;－代表氨基酸缺失。
图 7 梅花鹿、牛、羊 TEＲT基因氨基酸序列分析结果
1 ～ 3．间充质、茸皮和软骨中 actin 的 ＲT－PCＲ 产物;M． 标准核酸分
子量 DL2000;4 ～ 6．间充质、茸皮和软骨中 TEＲT基因的 ＲT－PCＲ产
物。
图 8 鹿茸顶端组织不同部位 TEＲT 基因及 actin 基因 ＲT－
PCＲ结果
表 1 鹿茸组织 TEＲT基因表达丰度检测结果(n=3，珋x±s)
顶端
组织
actin扩增循
环数(Ct1)
IGF1 扩增循
环数(Ct2)
相对定量结
果(2－ΔΔCt)
以茸皮层表达
量为 1 标准化
茸 皮 23． 09±0． 413 30． 57±0． 295 0． 000 1 1． 000
软 骨 18． 59±0． 178 24． 78±0． 143 0． 000 2 2． 445
间充质 16． 84±0． 042 21． 46±0． 167 0． 000 6 7． 260
注:Ct 为荧光达到荧光阈值的循环数，2－ΔΔCt为目的基因相对于
内参基因的定量。
3 结论与讨论
己有大量的证据显示，鹿茸的再生建立与来源
同特定位置的组细胞有关，也就是生茸区骨膜中的
干细胞，即鹿茸的再生包含大量间充质干细胞的形
成。由于鹿茸的独特性质，更深入地了解鹿茸再生
对于再生医学的研究十分重要。因此，不断地深入
探索鹿茸再生过程内部的调控机制是目前研究者的
共同目标。端粒酶是一种逆转录酶，它以自身 ＲNA
为模板合成富含脱氧单核糖鸟苷的端粒 DNA序列，
从而弥补因有丝分裂而消耗的端粒长度，在延长细
胞寿命上起着重要作用。近年来许多学者对端粒酶
的研究结果表明，端粒酶调控着细胞增殖活性和细
胞寿命，是决定基因扩增和稳定的主要因素。端粒
酶在大部分正常的体细胞中活性受到明显的抑制，
在大多数肿瘤细胞及干细胞等增殖旺盛的细胞中则
可检测到高活性的端粒酶，而鹿茸细胞在快速生长
期的增殖速度比肿瘤细胞还快。Lee等［13］体外研究
表明，端粒酶的过表达能提高胚胎干细胞的增殖、分
化能力。Flores等［14］研究小鼠的表皮干细胞，发现
其端粒长度和端粒酶的活性影响着表皮干细胞的增
殖、迁移和分化;端粒的缩短可抑制干细胞的动员，
从而抑制表皮干细胞的体外增生。顶端增殖区是梅
花鹿鹿茸的生长中心，已有研究显示，鹿茸的再生是
一个基于干细胞的过程，而间充质就是鹿茸再生的
干细胞储备层［15］。因此，开展鹿茸细胞端粒酶活性
的相关研究，对于探讨鹿茸周期性再生发育机理是
一个重要的新思路。
本研究从鹿茸顶端增殖区分离培养了茸皮层、
间充质层和软骨层细胞，并采用 TＲAP 法检测其端
粒酶活性。结果显示，在这 4 种细胞中均表现出不
同程度的端粒酶活性，其中间充质层细胞的端粒酶
711第 9 期 胡 薇等:鹿茸顶端组织端粒酶活性检测及 TEＲT基因的差异表达
活性明显高于其他组织层细胞，端粒酶活性在增殖
区的各层中呈现递减的趋势，随着细胞逐渐分化成
熟，端粒酶活性逐渐降低。这也支持了间充质细胞
是鹿茸生长过程中的干细胞来源这一说法。此外，
本研究同时利用 TＲAP法检测了体外培养不同代数
的间充质细胞的端粒酶活性，结果显示，在体外培养
的不同代数间充质细胞端粒酶活性并没有明显变
化。这一结果进一步证明，在鹿茸快速生长阶段，其
顶端生长中心表达了端粒酶，端粒酶在鹿茸的生长
发育中可能具有重要的作用。这与孙浩然等［15］推
断，在生长速度极快的鹿茸中很可能表达端粒酶，以
维持高速的增殖分化，端粒酶可能参与调控鹿茸的
生长发育的结果基本一致。
在端粒酶组分中，端粒酶逆转录酶具有反转录
酶活性，TEＲT 基因在调节端粒酶活性中起决定作
用。TEＲT是端粒酶发挥作用的重要限速步骤。本
研究初次获得了梅花鹿 TEＲT 基因的部分 cDNA 序
列，并发现与牛和羊的 TEＲT基因的同源性较高，说
明该基因进化程度比较保守。以此设计探针利用荧
光定量 PCＲ技术检测鹿茸顶端不同组织部位 TEＲT
基因的表达水平。结果表明，在间充质细胞中 TEＲT
基因的 mＲNA表达量最高，其次为软骨细胞和茸皮
层细胞，TEＲT 在增殖区的各层中的表达量呈现递
减的变化，与端粒酶活性变化模式相一致，这一结果
验证了 TＲAP法检测端粒酶活性结果的可信性。
目前，鹿茸细胞中端粒酶活性的研究才刚刚起
步。Kierdorfu等［16］研究显示，鹿茸再生是是由于角
柄末梢的骨膜干细胞受到激活，从而完成鹿茸的再
生。近年来，Li等［17－18］对赤鹿生茸骨膜的发育进行
了大量的研究，认为具有极强的分化能力的骨膜可
能是出生后仍保留的胚胎组织。随着鹿茸的生长，
骨膜组织向间充质组织转化，而其中的间充质细胞
仍然具有干细胞的特征，在体内可以向软骨组织转
化［19－20］。但是由于鹿种的差别，在梅花鹿中骨膜很
薄，要想从骨膜中将细胞层从纤维层中剥离开来很
难，因此，选择分离仍然具有干细胞特征的间充质干
细胞为主要研究对象，分析鹿茸间充质干细胞端粒
酶活性和 TEＲT 基因的表达水平。由此，推测鹿茸
干细胞的永生化能力和端粒酶活性的相关性，以及
端粒酶在鹿茸的生长规律和再生调节机制等方面可
能具有的重大意义，这些问题国内外研究甚少，研究
结果说明，在鹿茸的快速生长期，其顶端增殖区的各
层组织中均表达了不同活性的端粒酶，并且端粒酶
活性与细胞的分化状态有关，细胞分化程度越低端
粒酶活性越高，说明端粒酶可能参与调控鹿茸细胞
的增殖与分化，可能是鹿茸快速生长的原因之一，这
也给人们带来了许多新的思考，笔者将通过课题的
不断深入开展和探索，为鹿茸再生机理的阐明提出
一些新的观点。
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811 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41 卷