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基础医学
文章编号:1006 －6233(2014)12 －1937 －05
HPLC － UV法测定草决明中五种蒽醌类化合物含量
及其指纹图谱的建立
*
何永志， 严治学， Ernestina Amponsem， 任晓亮， 常艳旭
(天津中医药大学中药学院， 天津 300193)
摘 要:目的:建立一种同时测定草决明中五种蒽醌类化合物含量的 HPLC方法及草决明 HPLC
指纹图谱。方法:采用 Hypersil C18 色谱柱(4． 6mm ×250mm，5μm)，以乙腈 － 0． 05%甲酸水溶液为流
动相，梯度洗脱;流速 1． 0mL /min，柱温:30℃，检测波长 254nm。采用评价软件(2004A)进行数据分
析，对来自加纳和中国 13 个地区，共 22 种生、炒草决明建立了 HPLC 指纹图谱，并进行相似度计算。
结果:方法的灵敏度、线性、精密度以及准确度均符合方法学验证的要求。分别在生品中检出 16 个共
有峰，在炮制品检出 8 个共有峰;与对照样品(加纳的生品)相比，中国的两个样本相似系数分别为 0．
577(南京)和 0． 565(武汉)。结论:所建立的草决明指纹图谱的方法稳定可靠，适用于草决明质量评
价，两个国家的草决明质量有明显差异。
关键词: 蒽 醌; 草决明; 指纹图谱; 加 纳; HPLC
文献标识码: A doi:10． 3969 / j． issn． 1006 －6233． 2014． 12． 001
Determination of Five Anthraquinones and Establishment of a Fingerprint
of Cassia Occidentalis Seeds by HPLC with UV Detection
HE Yongzhi， YAN Zhixue， Ernestina Amponsem， et al
(Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China)
Abstract:Objective:To establish a simultaneous determination of five cassia anthraquinones content by HPLC，and
HPLC fingerprint method of grass cassia ． Method:Hypersil C18 column (4． 6 mm × 250 mm，5 μm)，acetonitrile － 0． 05
% formic acid as a mobile phase． The flow rate was 1． 0 mL /min，the temperature was 30℃，and the detection wave length
was 254 nm． Using chromatographic fingerprint evaluation software (2004 A)for data analysis，from Ghana and China ，estab-
lished HPLC fingerprint and similarity calculation ． Ｒesult:The sensitivity，linearity ，precision and accuracy of the method
are in line with the requirements of method validation ． 16 and 8 common peaks were detected in crude drug and processed one
respectively，compared with the control sample (Ghana raw goods ) ，similar coefficients of two samples from China were 0．
577 (Nanjing )and 0． 565 (Wuhan ) ，indicating significant difference between two areas of grass Cassia in quality ． Con-
clusion:Cassia HPLC fingerprint method established stable and reliable ，and suitable for quality evaluation Cassia herbs ．
Key words: Anthraquinones; Cassia occidentalis; Fingerprint; Ghana; HPLC
决明子是一味众所周知的具有润肠通便功能的中药［1］，具
有调节血液和胆固醇作用，可用于治疗高血压、糖尿病、月经不
调、水肿等疾病。望江南在中国称为草决明，在中国南方局部
地区用于肠道和皮肤等病的治疗［2］。而在加纳，草决明则用于
治疗高血压、疟疾、伤寒、咳嗽等疾病［3，4］。现代研究表明，草决
明含有多种化学成分，如蒽醌类(番泻叶苷 A，B和 C，芦荟大黄
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第 20 卷 第 12 期
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河 北 医 学
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* 基金项目:国家自然科学基金(青年基金)，编号:81102732
书素，大黄酚，大黄素，大黄酸等)，三萜类、鞣质、黄酮类、油脂、毒
白蛋白素和多糖等［5］。有学者对源自湖北省和南京市的草决
明的蒽醌含量进行了研究，发现湖北省的草决明蒽醌含量最
高，且炮制时间和温度会影响挥发性成分的含量［6，7］，而在加纳
北方邦西部也出现过儿童因过量食用草决明而引起中毒的相
关报道［8］。目前对于决明子质量控制研究往往集中一个或几
个成分的定性或定量分析，或采用双波长 HPLC 指纹图谱结合
化学计量分析法鉴别炒决明子、生决明子和小决明子。而以多
组分为基础的测定草决明的化学计量学分析方法研究尚未见
报道。为控制药材质量，保证用药安全，本文根据草决明所含
化学成分特性，对来自加纳和中国不同产地的 22 个草决明子
样本中五种蒽醌类成分进行含量测定，并建立 HPLC指纹图谱，
为草决明的全面质量评价提供参考。
1 仪器与试药
1． 1 仪器:岛津(日本东京)二元 LC － 20AT泵，SIL20A自动进
样器，CTO － 10ASvp柱温箱，SPD － 20A紫外检测器，CMB － 20A
系统控制器。
1． 2 试药:芦荟大黄素(＞ 98． 0%)，大黄酸(＞ 98%)，大黄素
(＞ 99%)，大黄酚(＞ 99%)和大黄素甲醚(＞ 98． 4%)购自中
国药品生物制品检定所。草决明样品产自加纳 11 个不同地区
以及中国两个地区(武汉和南京)，并经李天祥副教授鉴定，标
本保存于天津中医药大学实验室标本部(见表 1)。乙腈和甲醇
(色谱纯)购自天津江天化工有限公司;甲酸(分析纯)购自天津
柯伟有限公司。纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司。
表 1 草决明样品
样品编号 收集地点 地区 /国家 样品种类 收集日期
1 Darkuman 大阿克拉 －加纳 炒品 ＆ 生品 2010． 10
2 Okponglo 大阿克拉 －加纳 炒品 2010． 10
3 Okponglo － sonitra 大阿克拉 －加纳 炒品 2010． 10
4 Legon campus 大阿克拉 －加纳 炒品 2010． 10
5 Ahinsan 阿善堤地区 －加纳 炒品 ＆ 生品 2010． 9
6 Asafo Brisco 阿善堤地区 －加纳 炒品 ＆ 生品 2010． 9
7 Physic garden － KNUST 阿善堤地区 －加纳 炒品 2010． 9
8 Anum asuogyaman 东部地区 －加纳 炒品 ＆ 生品 2010． 10
9 Anyinam 东部地区 －加纳 炒品 ＆ 生品 2010． 9
10 Adum － Banso 西部地区 炒品 ＆ 生品 2010． 10
11 Dominase 西部地区 炒品 ＆ 生品 2010． 10
12 武汉 中国，湖北省 炒品 ＆ 生品 2010． 10
13 南京 中国，江苏省 炒品 ＆ 生品 2010． 9
注:样品 22 个，炒品 13 个，生品 9 个
2 方法与结果
2． 1 色谱条件:采用 Hypersil C18 色谱柱(250mm × 4． 6mm，
5μm，P． Ｒ)，流动相:0． 05%甲酸(A)－乙腈(B)，梯度洗脱:0 －
50min，5% B － 90% B;流速 1． 0mL /min，检测波长 254nm，柱温
30℃，进样量 20μL。生品(NＲ)、炒品(Ｒ)和 5 个标准品混合物
HPLC色谱图如图 1 所示。
2． 2 溶液的制备:标准品溶液的制备:取芦荟大黄素(1mg)、大
黄酸(1mg)、大黄素(1mg)、大黄酚(1mg)和大黄素甲醚(5mg)
精密称定，分别置于 10mL 的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制
成芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别为
100μg /mL、 100μg /mL、 100μg /mL、 100μg /mL、 100μg /mL、
500μg /mL的标准品溶液。
图 1 生品(NＲ)、炒品(Ｒ)和 5 个标准品混合物
(1．芦荟大黄素 2．大黄酸 3．大黄素 4．大黄酚 5．大黄素甲
醚)的 HPLC色谱图
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样品溶液的制备:采用传统炒制法进行炮制，在预热的平底锅
(170 － 190℃)中将 80g草决明种子煨炒 4min，粉碎，过 4 号筛。
取草决明粉末样品(0． 2g)精密称定，置 10mL容量瓶中加甲醇 /
水(4∶ 1)10mL。记录容量瓶质量，室温下将混合物超声萃取
40min，补足失重。提取液经微孔滤膜(0． 45m)过滤，取续滤液，
待用。
2． 3 方法验证:精密量取 5 个蒽醌类化合物的标准品溶液适
量，混合均匀，并逐级稀释绘制标准曲线，采用最小二乘法对每
个蒽醌类化合物进行线性回归分析，结果表明线性范围内线性
关系良好(Ｒ2 ＞ 0． 996)。精密度由同一天同一样品重复进样 6
次测定，峰面积和保留时间的相对标准偏差(ＲSD，n = 6)分别
小于 2． 5%和 0． 1%(表 3)。重复性通过分析 6 个平行制备的
样品进行评价。稳定性通过分析相同混合标准溶液在室温下
24h的含量进行评价。加样回收试验结果表明，方法回收率介
于 95． 6% － 104． 1%之间，ＲSD小于 6． 2%。结果见表 2。
表 2 方法验证结果 (ＲSD %)
化合物
精密度(n = 6)
保留时间 峰面积
稳定性(n = 6)
保留时间 峰面积
回收率(n = 6)
回收率%(mean ± SD)
芦荟大黄素 0． 04 0． 46 0． 05 1． 70 101． 26 ± 2． 7
大黄酸 0． 07 0． 36 0． 07 2． 77 99． 34 ± 4． 42
大黄素 0． 05 2． 49 0． 07 3． 07 101． 84 ± 5． 13
大黄酚 0． 05 2． 33 0． 09 2． 86 104． 14 ± 10． 06
大黄素甲醚 0． 06 2． 34 0． 08 2． 38 95． 61 ± 12． 26
2． 4 含量测定:按“2． 2”项下方法制备样品溶液，经微孔滤膜 (0． 45μm)过滤，进样分析。结果见表 3。
表 3 不同产地样品中蒽醌含量测定结果 (μg /mL)
编号 样品 芦荟大黄素 大黄酸 大黄素 大黄酚 大黄素甲醚 蒽醌总浓度
1 Dominase 62． 703 182． 508 1． 418 1． 193 12． 825 260． 65
2 Darkuman 30． 775 69． 845 0． 375 1． 742 8． 122 110． 86
3 Anum asuogyaman 23． 673 132． 140 0． 022 0． 151 1． 923 157． 91
4 Asafo Brisco 25． 705 125． 990 0． 876 2． 761 3． 777 159． 11
5 Anyinam 42． 555 140． 072 1． 030 1． 001 5． 731 190． 39
6 Ahinsan 40． 560 86． 272 0． 705 1． 095 2． 922 131． 55
7 Adum Banso 48． 109 149． 745 1． 821 1． 661 11． 132 212． 47
2． 5 草决明的 HPLC指纹图谱的建立:按“2． 2”项下方法分别
制备 22 个草决明药材的样品溶液，并按“2． 1”项下方法进样分
析。比较各样品色谱图发现，不同样品具有相似的化学成分，
在 HPLC指纹图谱中，指认了 5 个色谱峰:①芦荟大黄素，②大
黄酸，③大黄素，④大黄酚和⑤大黄素甲醚，保留时间分别为
31． 7，32． 5，38． 1，43． 7，46． 7min。色谱峰 9 在色谱图上响应最
高且保留时间适宜，因此选取作为参比峰。其中 7 个产自加纳
的生品均有相应炮制品，分析生品(1 组)和炮制品(两组)色谱
图，除了产自 Adum Banso 和 Ahinsan 的样品，每组 5 个样品都
显示了大量共有色谱峰的存在，因此采用软件进行色谱峰匹
配，结果 5 个生品样品显示有 16 个共有峰，5 个炮制样品显示
有 8 个共有峰。如图 2 所示。
采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004 A)”，对产
自加纳 5 个生品及与中国产生品进行相似度判别，结果见表 4、
5。
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书表 4 共有峰相对峰面积和保留时间及 5 个样品的相似度
样本
共有峰的相对峰面积
1 2 3 4 5 6 7 8
保留时间(min) 11． 2 12． 7 13． 7 15． 8 19． 1 20． 1 22． 1 22． 9
Dominase 0． 453 2． 265 0． 767 1． 046 0． 455 0． 208 0． 360 0． 290
Darkuman 0． 831 1． 085 2． 435 1． 087 0． 130 0． 424 0． 470 0． 213
Anum Asuogyaman 0． 269 0． 590 0． 600 0． 446 0． 102 0． 158 0． 257 0． 147
Asafo Brisco 0． 243 0． 371 0． 658 0． 360 0． 050 0． 156 0． 160 0． 043
Anyinam 0． 220 0． 282 0． 568 0． 391 0． 048 0． 145 0． 218 0． 177
样本
共有峰的相对峰面积
9 10 11 12 13 14 15 16 相似度
保留时间(min) 23． 6 24． 1 24． 5 25． 2 27． 3 31． 4 32． 2 35． 6
Dominase 1． 000 0． 451 0． 292 0． 365 0． 201 1． 287 2． 028 1． 289 0． 720
Darkuman 1． 000 0． 417 0． 136 0． 811 0． 129 0． 326 0． 496 0． 295 0． 911
Anum Asuogyaman 1． 000 0． 205 0． 227 0． 265 0． 048 0． 092 0． 460 0． 227 0． 969
Asafo Brisco 1． 000 0． 035 0． 039 0． 190 0． 029 0． 063 0． 261 0． 136 0． 98
Anyinam 1． 000 0． 196 0． 112 0． 242 0． 046 0． 126 0． 279 0． 189 0． 969
表 5 加纳和中国草决明生品指纹图谱的相似性
S1 － Ｒef1 S2 －南京(中国)S3 －湖北(中国)
S1 1 0． 577 0． 565
S2 0． 577 1 0． 885
S3 0． 565 0． 885 1
3 讨 论
本实验建立了一种对草决明中的多个蒽醌类成分进行质
量控制的简单可靠的 HPLC 法，同时建立的草决明指纹图谱标
准，为该药材的质量控制提供依据。
3． 1 色谱条件的优化和提取方法的选择:为全面反映草决明
药材 HPLC信息，对提取溶剂和提取时间进行了考察，结果表明
采用甲醇水溶液提取效果较好，并通过 L9(34)正交试验，考察
甲醇 /水在 20∶ 80、50∶ 50、80∶ 20 时超声提取效果。同时对色
谱条件进行优化，比较甲醇、乙腈、甲酸、磷酸和水以不同比例
作为流动相，结果表明乙腈比甲醇有更好分离效果;检测波长
在 254nm和 278nm时具有相似的色谱图，但 278nm下大黄素甲
醚响应较弱，因此选取 254nm 作为检测波长;流速为 1mL /min
时，50min内具有良好分离效果。
3． 2 指纹图谱的应用:产自 Okponglo sonitra 的炮制品在加纳
的 11 个样品中蒽醌类化合物含量最高。与产自土壤条件相似
的 Physic garden (KNUST)样品相比，相似度可达 0． 955;与两个
产自中国的炮制品相比，相似系数分别为南京(0． 215)、武汉
(0． 335)。表明产自两个国家的样品具有显著的差异。
3． 3 生品和炮制品的使用的差别:比较生品和炮制品的色谱
峰的差别，结果色谱图上共有 34 个色谱峰。其中 5 个色谱峰为
生品特有，但炒制后都消失。炒制后产生 19 个新的色谱峰，其
它有 8 个色谱峰吸收增强，2 个色谱峰吸收下降。推测新色谱
峰可能是在炒制过程中经氧化或分解产生。
参考文献:
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医药科技出版社，2010． 134 － 135．
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pharamacol，1987，19(2):201 － 212．
文章编号:1006 －6233(2014)12 －1941 －04
不同频率的周期性压力对兔软骨细胞影响的生物学研究
*
黄 正， 杨松滨， 刘益杰， 褚立希＊＊， 冯 伟， 陈世宣
(上海中医药大学康复医学院， 上海 201203)
摘 要:目的:通过观察不同频率的周期性压力对兔软骨细胞增殖及整合素 α1β1 分泌量的影
响，研究不同频率的力学刺激对软骨细胞产生的生物学影响。方法:取兔四肢关节的软骨细胞，在体
外进行培养。表型稳定的第 3 代细胞进行研究，设置常压培养 A组和周期性压力 B组，并将 B组在压
力为 172kPa按照加压频率分组，加压频率 B1 组为 0． 2Hz，B 两组 0． 5Hz，B3 组 1Hz，B4 组 2Hz，B5 组
5Hz。B组每天干预 2h，连续干预 3d。检测 A 和 B 组软骨细胞增殖情况和整合素 α1β1 的含量。结
果:OD值 A组为 1． 08 ± 0． 13，B1 组为 1． 19 ± 0． 11，B 两组为 1． 23 ± 0． 08，B3 组为 1． 35 ± 0． 06，B4 组
为 1． 45 ± 0． 09，B5 组为 1． 37 ± 0． 12。加压各组与对照组比较 OD值升高，差异有统计学意义。B组各
组间差异有统计学意义，峰值出现在 B4 组。A 组整合素 α1β1 水平为 3． 02 ± 0． 26pg /mL，B1 组为 3．
28 ± 0． 19pg /mL，B两组为 3． 43 ± 0． 11pg /mL，B3 组为 3． 77 ± 0． 24pg /mL，B4 组为 4． 01 ± 0． 09pg /mL，
B5 组为 3． 94 ± 0． 13pg /mL。加压各组与对照组比较整合素 α1β1 含量均有升高，差异有统计学意义
差异(P ＜ 0． 05)。B组各组间整合素差异有统计学意义，峰值出现在 B4 组。结论:相同大小(172kPa)
不同频率的周期性压力刺激兔软骨细胞，均能促进软骨细胞增殖和增加整合素含量的作用，但并非频
率越高作用越强。本实验中以 2Hz频率的周期性压力作用最强。
关键词: 骨关节炎; 软骨细胞; 周期性压力; 细胞增值; 整合素 α1β1
文献标识码: A doi:10． 3969 / j． issn． 1006 －6233． 2014． 12． 002
Effect and Mechanism of Cyclical Pressures of Different
Frequencies on Ｒabbit Chondrocytes
HUANG Zheng， YANG Songbin， LIU Yijie， et al
(School of Ｒehabilitation Medicine，Shanghai University of Traditional
Chinese Medicine，Shanghai 201203，China)
Abstract:Objective:By observing cyclical pressures of different frequencies on rabbit chondrocyte proliferation and se-
cretion of integrin α1β1，to study the effects and mechanism on rabbit chondrocytes． Method:Isolated fetal rabbit articular
chondrocytes，the third － generation cells were seeded in plates． Set control group A (normal culture)and group B of different
frequencies pressure (pressure 172kPa，frequency group B1 0． 2Hz，group B2 0． 5Hz，group B3 1Hz，group B4 2Hz，group B5
5Hz)． Pressure intervention of different frequencies 2 hours per day，3 consecutive days after the intervention，to detect the
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河 北 医 学
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Vol． 20，No． 12
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＊＊
基金项目:国家自然科学基金项目，编号:(81173357);上海市浦东新区卫生系统重点学科群建设资助项目，编号:
(PWZxkq2011 － 01);上海市医学重点专科项目，编号:(ZK2012a25)
通讯作者，Email:chulix12@ 126． com