全 文 ：DOI:10． 13463 / j． cnki． cczyy． 2016． 03． 008
siＲNA沉默胸腺素 β4对鹿茸间充质干细胞增殖的影响
谢红梅1，孟祥宇1，孙天霞1，张丽轩1，赵 雨1，曲 毅1，2*
(1．长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心，长春 130117;2．吉林省食品药品安全监测中心，长春 130033)
摘要:目的 利用 siＲNA干扰技术研究胸腺素 β4(Tβ4)基因沉默对鹿茸间充质干细胞(MSC)增殖的影
响。方法 鹿茸 MCS分为阴性对照组、siＲNA-Tβ4 转染组 2 组。MTT检测 MSC 增殖的变化，Ｒeal-time PCＲ检
测 ILK、AKT及 CyclinD1 mＲNA表达量差异变化，Western blot检测 AKT及 P-AKT蛋白含量变化。结果 siＲ-
NA-Tβ4 转染组 MSC增殖受到显著抑制(P ＜ 0. 01) ;siＲNA-Tβ4 转染组 ILK、CyclinD1 mＲNA 表达量下调，AKT
mＲNA表达量不变;siＲNA-Tβ4 转染组总 AKT蛋白含量无变化，P-AKT 蛋白含量减少。结论 Tβ4 基因沉默
能显著抑制 MSC增殖，并可能通过下调 ILK、P-AKT及细胞周期相关蛋白 CyclinD1 从而抑制 MSC细胞增殖。
关键词:ＲNA干扰;Tβ4;间充质干细胞;ILK /AKT信号通路
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标志码:A 文章编号:2095 － 6258(2016)03 － 0462 － 03
基金项目:吉林省科技发展计划项目(20140622003JC) ;吉林省科技发展计划项目(20130101142JC)。
作者简介:谢红梅(1989 －) ，女，硕士研究生，主要从事中药学研究。
* 通信作者:曲 毅，女，博士，助理研究员，电话 －(0431)86172331，电子信箱 － quyi1229@ 163． com
Effect of siＲNA-mediated thymosin β4 silence on proliferation in mesenchymal stem cell
XIE Hongmei1，MENG Xiangyu1，SUN Tianxia1，ZHANG Lixuan1，ZHAO Yu1，QU Yi1，2*
(1． Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Ｒesearch and Development Center，Changchun
University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China;
2． Jilin Safety Monitoring Center for Food and Drug，Changchun 130033，China)
Abstract:Objective To investigate the effects of siＲNA-mediated thymosin β4(Thymosin β4，Tβ4)silence on
proliferation in activated mesenchymal stem cell(mesenchymal stem cell，MSC)and discuss the possible mechanism．
Methods MSC cells were divided into 2 groups:negative control group and siＲNA-Tβ4 transfection group． The siＲ-
NA-Tβ4 was transfected into MSC cells and cell proliferation was measured by MTT，Ｒeal-time PCＲ detection ILK，
AKT and CyclinD1mＲNA expression quantity change，Western blot detection AKT and P-AKT protein content chan-
ges． Ｒesults MSC proliferation was significantly inhibited in siＲNA-Tβ4 transfection group(P ＜ 0． 01) ;Expression of
the ILK，CyclinD1 mＲNA of MSC transfected with siＲNA-Tβ4 is reduced，AKT quantity remains the same(P ＜
0． 01) ;The siＲNA-Tβ4 transfection group no change in total AKT protein，P-AKT protein content decreased． Conclu-
sion The siＲNA-mediated Tβ4 silence significantly inhibits MSC proliferation by up regulating the ILK，p-AKT and
CyclinD1expression in MSC．
Keywords:ＲNA interference;Tβ4;mesenchymal stem cell;ILK /AKT signaling pathway
鹿茸具有强壮机体、抗衰老、增加机体免疫力、
抗炎、抗肿瘤、抗溃疡、增强中枢神经系统和心脑血管
系统等药理作用［1-4］。前期研究［5-8］发现，在鹿茸快
速生长时期，Tβ4 高度表达。Tβ4 是一个由 43 个氨
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长 春 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Changchun University of Chinese Medicine
Vol. 32 No． 3
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基酸组成的小分子多肽，存在于大多数哺乳动物细胞
中，可以促进内皮细胞迁移、加速血管生成、降低炎症
反应、抑制凋亡和氧化损伤。鹿茸的生长依赖于鹿茸
间充质干细胞(MSC)的增殖与分裂。本研究以 MSC
为模型，通过 ＲNA干扰技术，沉默 MSC 的 Tβ4 基因，
观察 MSC 增殖及 ILK /AKT 信号通路相关蛋白表达
的变化，探讨 Tβ4 沉默对 MSC 增殖的影响及其可能
的机制，旨在为鹿茸快速生长研究探索新的途径。
1 材料
1. 1 主要试剂 鹿茸间充质干细胞由本实验室保
存。Tβ4 小干扰 ＲNA(siＲNA-Tβ4)和 CY3-阴性对照
小干扰 ＲNA均为上海吉玛基因股份有限公司设计合
成。MTT为美国 Amresco 公司产品。DMEM 高糖培
养基、胎牛血清为美国 Gibco 公司产品。兔来源 p-
AKTser473 一抗和兔来源 AKT1 一抗均购买于 Cell
Signaling公司。鼠来源 Tublin一抗、兔二抗和鼠二抗
均购买 Abcam公司。ECL显色剂购自碧云天公司。
1. 2 siＲNA 的合成 据前期获得的鹿茸 Tβ4 mＲNA
序列和 siＲNA设计原则，鹿茸 Tβ4 mＲNA的 siＲNA序
列为:正义链 GCAUAGGGCGCAUAUATT;反义链
UAUAUGCGCGCUCCUAUGCTT;阴性对照为吉玛公
司提供的错义 siＲNASCＲ序列。
2 方法
2. 1 MSC 细胞株的培养及转染 MSC 细胞用含
10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养基置于 37 ℃、5%
CO2 细胞培养箱中培养，待细胞生长密度达到
70% ～80%时，0. 25%胰酶消化，离心去胰酶。并用
无血清无抗性的 DMEM 稀释细胞，调整细胞浓度为
5 × 104 cells /L，应用电转法进行电转染，siＲNA 浓度
为 100 nmol /L。转染后细胞分别接种 96 孔和 6 孔
板，用于后续的细胞增殖检测和信号通路研究。96
孔培养板每孔 100 μL，每组 6 个复孔。6 孔培养板每
孔 2 mL，每组 3 个复孔。
2. 2 MTT 检测细胞增殖抑制率 转染 6 h 后，更换
为含 10%胎牛血清的 DMEM培养基。实验分为阴性
对照组和 siＲNA-Tβ4 转染组。转染 48 h后每孔加入
20 μL MTT溶液，培养箱内继续孵育 4 h 后置于酶标
仪上，在 490 nm 波长下测各组吸光度(A)值。
2. 3 Ｒeal-time PCＲ检测 ILK、AKT及 CyclinD1 mＲNA
表达量差异变化 用 TＲIzol 法提取 MSC 细胞总
ＲNA，反转录 cDNA 为模板，Tβ4 以 F:AAAACG-
GAAACGCAAGA、Ｒ:GATTTCACTGTCGTCCCAC;内
参 基 因 β-Actin 以 F:CACCACAGCCGAGCGG-
GAAAT、Ｒ:CCGTGTTGGCGTAGAGGT 为扩增引物进
行 Ｒeal-time PCＲ扩增，在进行 Ｒeal-time PCＲ时对照
组和实验组均设置 3 组平行，利用 2-Ct方法计算 Tβ4
基因在对照组和实验组相对表达量。Ｒeal-time PCＲ
检测重复 3 次。
2. 4 Western blot检测 AKT及 P-AKT 蛋白含量变化
提取细胞总蛋白后，经 SDS-PAGE 电泳后转至
PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭 1 h后，一抗 37 ℃孵
育 2 h，加入二抗室温孵育 1 h，ECL 避光显色，检测
AKT及 P-AKT蛋白的表达，Tubulin为内参。
2. 5 统计学分析 数据分析用 SPSS 19. 40 统计软
件，采用独立样本 t检验进行差异显著性检验。
3 结果
3. 1 MTT检测 siＲNA-Tβ4 转染 MSC 后增殖影响
结果表明，siＲNA-Tβ4 转染组 MSC 增殖受到显著抑
制，抑制率为(18. 450 1 ± 0. 401 7)%。与阴性对照
组比较，P ＜ 0. 01。
3. 2 Ｒeal-time PCＲ 检测 siＲNA-Tβ4 转染 MSC 后
AKT、CyclinD1 及 ILK 表达影响 结果表明，Ｒeal-
time PCＲ 检测 siＲNA-Tβ4 转染组 ILK、CyclinD1 mＲ-
NA表达量明显下调，与阴性对照组比较，P ＜ 0. 01;
AKT表达量变化与阴性对照组比较，无统计学意义。
3. 3 Western blot 检测 AKT 及 P-AKT 蛋白含量变化
结果显示，siＲNA-Tβ4 转染组相对于对照组总的
AKT蛋白含量无明显变化，而 P-AKT 明显减少，说明
siＲNA-Tβ4 干扰的 Tβ4 表达促使磷酸化的 AKT减少。
4 小结
本实验用 siＲNA干扰 MSC 中 Tβ4 表达后，发现
MSC的增殖被明显抑制，表明 Tβ4 和 MSC 增殖密切
相关，Tβ4 在鹿茸快速生长中可能起重要调控作用。
在 ILK /AKT信号通路中，当 ILK被激活时，将引
起下游分子 PKB、AKT或 GSK-3 的磷酸化效应，产生
级联反应影响下游基因表达，最终对细胞增殖和存活
产生影响［9-10］。本研究表明 Tβ4 被沉默后，MSC中的
ILK和 CyclinD1 mＲNA 表达量明显下调，而 AKT 尽
管在 mＲNA水平未发生表达变化，但翻译后蛋白的
磷酸化水平明显下降。
本实验结果进一步表明，Tβ4 可以促进 MSC 增
殖，可能的机制为激活 ILK，进而活化 AKT，促进下游
CyclinD1 的表达。此研究为后续鹿茸快速生长机制
研究了奠定基础。
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DOI:10． 13463 / j． cnki． cczyy． 2016． 03． 009
人参亲环素蛋白原核表达及其抗真菌活性
李帅军1，才可新1，张楠楠1，孙天霞1，赵 雨1，曲 毅1，2*
(1．长春中医药大学中医药与生物工程研究开发中心，长春 130117;2．吉林省食品药品安全监测中心，长春 130033)
摘要:目的 研究人参亲环素蛋白(pgCyP)体外抗真菌活性。方法 采用 ＲT-PCＲ 技术，扩增人参 cyclo-
philin(pgCyP)基因片段，构建原核表达质粒并转入大肠杆菌中，利用 IPTG 诱导表达目的蛋白，通过亲和纯化
获得 pgCyP蛋白，纸片扩散法验证目的蛋白的抗菌活性。结果 人参 CyP基因全长为 522 个碱基，编码 174 个
氨基酸;目的蛋白经纯化后，SDS-PAGE分析显示单一条带;抑菌试验表明该重组蛋白可明显抑制疫霉菌菌丝
的生长。结论 成功克隆并表达具有抗菌活性的 pgCyP蛋白，为进一步研究 pgCyP在人参抗真菌中的作用机
制奠定了基础。
关键词:亲环素;人参;原核表达;纯化;抗真菌活性
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标志码:A 文章编号:2095 － 6258(2016)03 － 0464 － 03
基金项目:吉林省经济结构战略调整引导资金专项项目(2014N155)。
作者简介:李帅军(1987 －) ，男，硕士研究生，主要从事中药学研究。
* 通信作者:曲 毅，女，博士，助理研究员，电话 －(0431)86172300，电子信箱 － quyi1229@ 163． com
Prokaryotic expression of ginseng cyclophilin and the detected of antifungal activity
LI Shuaijun1，CAI Kexin1，ZHANG Nannan1，SUN Tianxia1，ZHAO Yu1，QU Yi1，2*
(1． Traditional Chinese Medicine and Biotechnology Ｒesearch and Development Center，Changchun
University of Traditional Chinese Medicine，Jilin Changchun 130117，China;
2． Jilin Safety Monitoring Center for Food and Drug，Changchun 130033，China)
Abstract:Objective We investigated the antifungal activity of panax ginseng cyclophilin (pgCyP)
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in vitro．
参考文献:
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