全 文 ：吉林农业大学学报 2016，38(1) :92 ～ 96，106 http:/ / xuebao． jlau． edu． cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@ vip． sina． com
梅花鹿 Thymosin beta 10 基因 ＲNAi 慢病毒载
体的构建及其对鹿茸干细胞增殖的影响
*
张 伟，褚文辉，路 晓，董 振 ，王权威，李春义＊＊
中国农业科学院特产研究所，特种经济动物分子生物学省部共建国家重点实验室，长春
130112
摘 要:利用慢病毒干扰系统，对梅花鹿生茸区骨膜干细胞(Antlerogenic periosteum cells，AP 细胞)Thymosin
beta 10(Tβ10)基因进行 ＲNA干扰(ＲNA Interference，ＲNAi)，并初步研究该基因对细胞增殖的影响。结果表
明:试验设计的 3 条针对梅花鹿 Tβ10 基因的 shＲNA序列与载体质粒 pLVTHM连接成功，与 pSPAX2、pMD2． G
质粒共转染 HEK 293T细胞，获得的重组慢病毒成功感染了 AP细胞;荧光定量 PCＲ检测结果表明，ＲNA干扰
后 Tβ10 基因的 mＲNA水平下调，MTT试验结果显示 Tβ10 基因的下调可以抑制 AP细胞增殖。试验成功构建
了针对梅花鹿 Tβ10 基因 ＲNAi 载体，并成功干扰了 Tβ10 基因在 AP 细胞中的表达，基因下调最高可达
35. 6%，并初步确定 Tβ10 基因下调可抑制 AP细胞的增殖。
关键词:鹿茸;Thymosin beta 10(Tβ10);ＲNA干扰;增殖
中图分类号:S825 文献标识码:A 文章编号:1000-5684(2016)01-0092-05
DOI:10． 13327 / j． jjlau． 2015． 2626
引文格式:张伟，褚文辉，路晓，等．梅花鹿 Thymosin beta 10 基因 ＲNAi慢病毒载体的构建及其对鹿茸干细胞
增殖的影响［J］．吉林农业大学学报，2016，38(1):92-96，106．
Construction of ＲNAi Lentiviral Vector for Thymosin beta 10 and
Effects of Its Introduction on Proliferation of Antler Stem Cells in Si-
ka Deer
ZHANG Wei，CHU Wenhui，LU Xiao，DONG Zhen，WANG Quanwei，LI Chunyi＊＊
State Key Laboratory for Molecular Biology of Special Economic Animals，Institute of Special Animal
and Plant Sciences of CAAS，Changchun 130112，China
Abstract:Thymosin beta 10 (Tβ10)gene of antlerogenic periosteum cells of Chinese sika deer was
interfered by using ＲNAi lentiviral vector system，and effects of the system introduction on prolifera-
tion of antler stem cells were primarily studied． The results showed that: (1)Three sequences of
small interfering ＲNAs，targeting Tβ10 gene of sika deer，were successfully ligated into the lentivi-
ral plasmids (pLVTHM) ; (2)AP cells were successfully infected by recombinant lentivirus，which
was obtained by each plasmid co-transfection into HEK 293t cells，together with the plasmids pS-
PAX2 and pMD2． G; (3)The expression level of Tβ10 mＲNA in the infected AP cells was signifi-
cantly decreased through ＲT － PCＲ measurement，and the interference of Tβ10 played a role in the
＊
＊＊
基金项目:“十二五”国家高技术研究发展计划(863)项目(2011AA100603) ，国家自然科学基金项目(31170950) ，中国农业科学
院特产研究所创新工程专项经费
作者简介:张伟，男，在读硕士，研究方向:鹿茸生物学;褚文辉，男，助理研究员，研究方向:鹿茸生物反应器。
褚文辉与张伟同为第一作者。
收稿日期:2015-04-15
通讯作者
张伟等:梅花鹿 Thymosin beta 10 基因 ＲNAi慢病毒载体的构建及其对鹿茸干细胞增殖的影响
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
suppression of proliferation of AP cells through MTT assay． Therefore，in this study we successfully
interfered Tβ10 gene in the AP cells with the efficiency of 35. 6% compared to the control，and ob-
tained preliminary results for the role of Tβ10 in AP cells．
Key words:deer antler;Thymosin beta 10(Tβ10) ;ＲNAi;proliferation
Thymosin beta 10(Tβ10)是 Thymosin beta 家
族的主要一员，是一类肌动蛋白结合因子，已知
Tβ10 参与调控细胞增殖、细胞凋亡及细胞迁移等
在内的多种细胞活动。同时，有研究报道 Tβ10
参与调控血管形成、炎症发生以及早期器官发育
等过程［1-2］。值得注意的是，该因子在肿瘤发生以
及肿瘤恶化过程中均高度表达，且与部分肿瘤的
恶化分级具有相关性，是肿瘤发生及恶化的一个
重要预判指标，同时也是现今兴起的一个治疗肿
瘤的靶向位点［3-4］。但是，目前对 Tβ10 的研究比
较分散并且缺乏系统性，因此亟需一个能够全面
研究该因子的新型研究模型。中国农业科学院特
产研究所特种经济动物干细胞创新团队前期研究
结果发现，Tβ10 在鹿茸组织中存在高度差异表
达，因此鹿茸有望成为一个研究 Tβ10 的新模型。
鹿茸是哺乳动物器官中唯一后天发育的并可
完全再生的特例，它是包括血管、皮肤、神经、软骨
及骨在内的多种组织形成的器官。由于其能够周
期性再生，因而可以用于多种生物医学研究，如再
生生物学、干细胞生物学、肿瘤生物学等［5-6］。鹿
茸在生茸期生长非常迅速，最快时每天能达到 1
～ 2 cm，在其过程中鹿茸保持着旺盛的细胞增殖
并伴随着高水平的细胞凋亡，同时鹿茸中血管组
织也快速生长。鹿茸的这些特性与肿瘤某些特性
高度相关，但是鹿茸却不会发生癌变。研究发现，
鹿茸的发生起源于生茸区骨膜(AP) ，其中包含了
约 330 万个细胞，这些细胞具有干细胞的特性，能
分化成多种成体细胞并表达 Nanong、OCT4 等多
种胚胎干细胞标记物［7-9］。前期研究发现，Tβ10
特异性表达于鹿茸组织的血管壁上并高度富集。
因此，推测其与鹿茸的血管新生及侵入相关，从而
保证鹿茸的快速生长。
本试验利用慢病毒介导的 ＲNAi 途径［10］，靶
向沉默 AP 细胞 Tβ10 基因，并进一步探究 Tβ10
的 ＲNAi 对 AP 细胞增殖的影响，为下一步研究
Tβ10 在鹿茸以及其他模式动物中的功能作用奠
定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
AP细胞、感受态细胞 DH5α、细胞株人胚肾
细胞 293T、载体质粒 pLVTHM、包膜质粒 pMD
2． G、包装质粒 pSPAX2 均由中国农业科学院特产
研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室
保藏。限制性内切酶 ClaⅠ、MluⅠ(NEB，中国) ，
T4 DNA连接酶(Takara，日本) ，小量质粒提取试
剂盒(Transgen，中国) ，大量质粒 DNA 提取试剂
盒(Promega，美国) ，琼脂糖凝胶回收试剂盒(E．
Z． N． A，美国) ，100 bp DNA Marker(Takara，日
本) ，DMEM、Trypsin(life tech，美国) ，标准胎牛血
清(Clack，澳大利亚) ，X-treme GENE HP(Ｒoche，
瑞士) ，ploybrene(Millipro，美国) ，其他试剂均为
国产或进口分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 梅花鹿 Tβ10 shＲNA 的重组慢病毒载体
的构建及鉴定 根据中国农业科学院特产研究所
特种经济动物干细胞创新团队 cDNA文库中的基
因序列，及一定的筛选法则选择了 3 条针对梅花
鹿 Tβ10 基因的高分 ＲNAi 靶序列，并将筛选的
ＲNAi靶序列在 NCBI 中进行序列同源性比对，以
确保 ＲNAi序列不会脱靶。在筛选好的 ＲNAi 序
列两端加上酶切位点、内成环结构、终止信号等，
送上海生工合成。设计 3 对 shＲNA序列(下划线
部分为内切酶及终止信号，方框部分为内成环结
构) :
T1: cgcgtcccc-TTCATTAATCATACAAATA
ATTT ttcaagaga AAATTATTTGATTAATGAA-tttttg
gaaat;T2:cgcgtcccc-GCCTTATCGAAGCTGTTGATT
TC ttcaagaga AAATCAACAGCTTCGATAAGGC-ttt
ttggaaat;T3:cgcgtcccc-ACAATTCGAGAAGTTCCG
CT tcaagaga GCGGAACTTCTCGAATTG-tttttggaa
at; Tc: cgcgtcccc-ACCTGCTTACATACGTGAA
ttcaagaga TTCACGTATGTAAGCAGGT-tttttg gaaat。
Tc为无意义链，作为阴性对照。合成的序列
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吉林农业大学学报 2016 年 2 月
Journal of Jilin Agricultural University 2016，February
经退火形成双链 Oligo DNA，与经过 ClaⅠ、MluⅠ
双酶切后形成的 pLVTHM 载体连接，转化 DH5α
大肠杆菌扩增。挑选重组阳性克隆菌株，利用小
提试剂盒小量提取质粒后，按如下引物进行 PCＲ
鉴定:5-ctggg aaatcaccataaacg-3;5-ttat tcccatg
cgacgg tat-3。
对 PCＲ鉴定阳性的质粒进行测序鉴定(上海
生工生物工程有限公司)。测序正确后利用 Pro-
mega大量质粒提取试剂盒大量制备，同时对 pS-
PAX2 和 pMD2． G进行大提以备后用。
1. 2. 2 重组慢病毒包装 利用 0. 8%胰酶消化
293T细胞并计数，接种于 10 cm 细胞皿中，添加
10 mL DMEM［含 10 %标准胎牛血清(FBS) ，不含
抗生素］，使 293T 细胞在转染日融合度 ＞ 80%。
使用 1． 5 mL opti-MEM 稀释 13. 5 μg DNA ［m
(pLVTHM)∶ m(Pspax2)∶ m(pMD2． G )= 3. 0∶
4． 5∶ 6. 0］，同时添加 22 μL X-treme GENE HP转
染试剂后，在室温下孵育 25 min 后，将复合物加
到细胞培养皿中，轻轻摇动培养皿以混匀。
37 ℃，5%的 CO2，孵育 12 h ，然后更换完全培养
基。24 h 后倒置荧光显微镜下，检测荧光蛋白
GFP的表达情况以确定转染效率。转染后 24 h
收集细胞培养皿中上清于 50 mL 离心管中。
1 000 g 离心5 min ，弃去细胞碎片沉淀，然后经
超滤管浓缩后用 1. 5 mL EP管分装，－ 80 ℃保存
待用。
1. 2. 3 重组慢病毒感染 AP 细胞 消化并重悬
一定的 AP细胞，准确计数后，添加 2 × 104个细胞
于 6 孔板中央，添加 2 mL 完全培养基。6 h 后对
AP细胞进行重组慢病毒感染，首先弃去 6 孔板中
培养基，替换 2 mL DMEM 培养基含有病毒
200 μL(滴度 1. 5 × 106 TU /L)及 polybrene(2 μL)
的混合液，12 h 后更换完全培养基，24 h 后观察
AP细胞荧光蛋白 GFP 的表达情况。并将成功携
带 pthvm-T1、T2、T3 及 Tc 的 AP 细胞命名为 AP-
T1、AP-T2、AP-T3 及 AP-Tc。
1. 2. 4 ＲT － PCＲ 检测 AP 细胞 ＲNAi 效率 取
感染后的 AP 细胞，利用 life 提取试剂盒提取总
ＲNA，并利用酶标仪测定 ＲNA 浓度及纯度后，利
用 Takara cDNA反转录试剂盒反转录总 ＲNA，然
后利用 Ｒoche SYBＲ试剂盒进行荧光定量 PCＲ反
应，选择 GAPDH 作为内参基因，对结果进行校
正，每组试验设 3 个重复，同时设空白对照，以
AP-Tc细胞作为对照，反应条件:95 ℃ 预变性
15 min;94 ℃变性 15 s ，57. 3 ℃退火 30 s ，72 ℃
延伸 1 min ，共 40 个循环;72 ℃ 5 min，4 ℃保存。
自动获取 Ct值后，利用 2 － ΔΔCt算法进行定量分析。
针对 Tβ10 设计的荧光定量 PCＲ 上下游引物:5-
CACATCACGGCTAAGGTC-3; 5-GAGACGCAGG
AGAAGAAC-3。
针对 GAPDH 内参基因设计的上下游引物:
5-ATGTTTGTGATGGGCGTGAAC-3; 5-CAGTA
GAAGCAGGGATGATGTT-3。
1. 2. 5 MTT 试验检测 AP 细胞增殖情况 消化
AP-T1、T2、T3 及 Tc细胞并准确计数，将细胞浓度
调整为 5 × 104 mL，取 200 μL细胞悬液于 96 孔板
中，设立 6 个重复，统计分析时去掉最高值及最低
值取 4 个重复进行，接种 1，2，3，4 d 后，每孔添加
20 μL MTT试剂，继续培养 4 h 后，停止培养，小
心弃去上清后，加入 150 μL DMSO 溶解，摇床避
光反应 10 min 后，利用酶标仪在 490 nm 处测定
吸光度。利用单因素方法分析，计算差异显著性，
然后以时间为横坐标、吸光度为纵坐标绘制细胞
增殖曲线。
2 结 果
2. 1 重组阳性载体质粒 plvthm的鉴定
空白质粒 plvthm 的 PCＲ 扩增片段大小为
105 bp ，而阳性克隆为 172 bp(插入片段为
67 bp) ，PCＲ鉴定结果(图 1)显示，阴性对照中
(图 1 中 5 号泳道)扩增片段靠近 100 bp Marker，
而阳性克隆(图 1 中 1 ～ 4 号泳道)扩增片段略小
于 200 bp Marker，与预期结果相符，表明挑选的
阳性克隆正是试验所需。测序结果最终确定阳性
克隆中正确插入了所需的 shＲNA，即 ＲNAi 靶位
点序列，4 种阳性质粒分别命名为 plvthm-T1、
plvthm-T2、plvthm-T3 和 plvthm-Tc。
M． Maker;1． plvthm-T1;2． plvthm-T2;3． plvthm-T3;4．
plvthm-Tc;5． plvthm空质粒
图 1 重组质粒 PCＲ鉴定结果
Fig． 1． Identification of recombinant plasmids by
PCＲ
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张伟等:梅花鹿 Thymosin beta 10 基因 ＲNAi慢病毒载体的构建及其对鹿茸干细胞增殖的影响
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2. 2 重组慢病毒三质粒共转染 293T细胞效果
在 293T 细胞中进行 X-tremeGENE HP 介导
的 plvthm、pSPAX2 和 pMD2． G 3 质粒共转染 24 h
后，在倒置荧光显微镜下观察到大量的 GFP 荧
光，荧光均匀分布于视野中，明暗交替呈无规则状
(图 2-A)。在可见光下观察，293T 细胞生长旺盛
紧密排列，细胞呈不规则多边形，无死细胞或细胞
碎片漂浮于上清中(图 2-B)，表明质粒成功共转
染 293T并包装成慢病毒颗粒，经测定所得慢病毒
滴度为 1. 5 × 106 TU /L。
A．倒置荧光显微镜下荧光表达情况;B．倒置相差显微镜下
细胞形态
图 2 3 质粒共转染 24 h后的 293T细胞
Fig． 2． Transfection of 293T cells by three plasmids
after 24 h
2. 3 重组慢病毒感染梅花鹿生茸区骨膜 (AP)
细胞
用包装成功的慢病毒感染 AP细胞，约 2 d后
在倒置荧光显微镜下观察。由图 3 可见，感染慢
病毒的 AP细胞，有大量绿色荧光分布于视野中，
在可见光下可看到 AP细胞生长状况良好。
2. 4 荧光定量 PCＲ检测 Tβ10 基因下调效率
以插入阴性序列(无意义链)的 AP细胞(AP-
Tc)作为对照进行荧光定量 ＲT － PCＲ，通过溶解
曲线可知，GAPDH基因和 Tβ10 基因均被特异性
扩增。利用 2 － ΔΔCt分析方法进行数据分析，AP-
T1，AP-T2，AP-T3，AP-Tc 相对表达量分别为
77. 20，74. 80，64. 40，100. 00。与阴性对照 AP-Tc
相比，AP-T1、AP-T2 及 AP-T3 的 Tβ 基因都有所
下调。因此，可确定携带 plvthm-T1、T2 及 T3 的
载体能够有效沉默 Tβ10 基因的表达，沉默效率
分别为 22. 8%、25. 2%及 35. 6%，其中最高沉默
效率可达 35. 6%。
A．倒置荧光显微镜下荧光表达情况;B．倒置相差显微镜下
细胞形态
图 3 重组慢病毒感染的 AP细胞(48 h)
Fig． 3． Infected AP cells by lentivirus (48 h)
2. 5 MTT法测定不同 AP细胞增殖活力
胰酶消化 AP-T1、T2、T3 及 Tc细胞(图 4)。
图 4 MTT试验生长曲线
Fig． 4． Growth curve by MTT assay
由图 4 可见，进行 4 d 的 MTT 试验后，AP-
T1、T2 及 T3 的增殖程度较对照 AP-Tc 弱(P ＜
0. 05)，AP-T1、AP-T2 及 AP-T3 的生长曲线基本
一致，几乎不出现增殖情况，并且在 4 d 时，AP-Tc
的吸光度达到 1. 24，与之相比 AP-T1、T2 及 T3 的
吸光度仅为 0. 49、0. 59 及 0. 64，此时，AP-Tc 的增
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殖速度较 ＲNAi抑制组高 2 倍以上，说明 Tβ10 的
ＲNAi使 AP细胞的增殖程度受到一定抑制。
3 讨 论
鹿茸由于其具有诸多特性，如周期性再生、干
细胞依赖性、生长迅速、天然的软骨内成骨等，因
此，是一个新兴的哺乳动物器官生物医学模型。
Tβ10 不仅参加细胞活动还参与血管形成以及早
期器官发育等［11-12］。此外，尤其是在肿瘤以及炎
症发生和恶化过程中均检测到 Tβ10 的差异表
达［13-15］。因此，研究 Tβ10 的功能及其作用机理
显得尤为重要。鹿茸与肿瘤组织具有某些共同
点，例如生长迅速、富含血管组织、基于干细胞
(某些肿瘤中发现癌症干细胞) ，但鹿茸却是结构
井然有序的正常组织而不癌化［16-20］。利用鹿茸
这个独特的模型进行 Tβ10 的功能研究，尚处空
白，国内外未见报道。本研究通过 ＲNAi 途径靶
向沉默了 Tβ10 在 AP 细胞中的表达，为研究
Tβ10 基因提供了一种有效途径。
Shiotsuka等［21］研究发现在小鼠胚胎时期进
行 Tβ10 siＲNA处理能够显著抑制小鼠牙胚的增
殖及发育。本试验利用慢病毒介导的 ＲNAi 技
术，靶向沉默了 Tβ10 在 AP 细胞中的表达，MTT
研究发现 Tβ10 的沉默也能够显著抑制 AP 细胞
的增殖，由于 AP 细胞属于鹿茸干细胞，本试验
中，受到初始接种浓度以及干扰效率的影响，致使
在 MMT试验中不能准确判定 ＲNAi组间的差异，
但是 ＲNAi 各组与对照组间存在显著差异(P ＜
0. 05) ，数据显示:对照组 AP-Tc 的增殖能力非常
快速，在 4 d 时吸光度达到 1. 24，但是 Tβ10 的干
扰组(AP-T1、T2、T3)在 4 d的吸光度却约为 0. 5。
因此，说明该因子在 AP 细胞增殖中扮演着重要
角色，下一步可以进一步分析 Tβ10 在鹿茸组织
中，特别是对鹿茸软骨细胞增殖影响和对鹿茸软
骨柱周围血管壁细胞的作用及相互关系。
此外，研究发现 Tβ10 的差异表达还与许多
器官的早期发育相关，如唾液腺、小脑以及肾脏
等［22-24］。鹿茸是一个在雄鹿进入青春期后才开
始萌生的器官，现有早期器官的研究都是基于胚
胎水平，因此研究受到种种限制。鹿茸则是后生
的可以周期性再生的哺乳动物器官，且对称生长，
可以为科学研究提供了天然对照组。因此，下一
步可以利用鹿茸这一模型，探索 Tβ10 在早期器
官发育中的作用。
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(责任编辑:林海涛)
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(责任编辑:林海涛)
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