全 文 ：DOI:10．11895 / j．issn．0253-3820．150744
分子印迹固相萃取联用高效液相色谱分离测定
海水中的膝沟藻毒素 GTX1，4
梅晓颀 何秀平 王江涛*
(中国海洋大学 海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室，青岛 266100)
摘 要 采用分子印迹技术，以鸟嘌呤核苷为虚拟模板，本体聚合，合成 GTX1，4的分子印迹聚合物(MIP)。
傅里叶红外变换光谱(FT-IＲ)和扫描电子显微镜(SEM)的结果显示，MIP 具有分布均匀、大小均一的孔穴。
平衡吸附实验表明，分子印迹聚合物(MIP)比非分子印迹聚合物(NIP)具有更高的结合容量，对膝沟藻毒素
GTX1，4 有更好的选择性。用 MIP 填充固相萃取小柱(MISPE) ，以 0．1 mol /L 乙酸溶液为淋洗液，甲醇-水
(95 ∶ 5，V /V)溶液为洗脱液时回收率最高，达到 85．0%。用优化后的淋洗洗脱条件测定微小亚历山大藻和塔
玛亚历山大藻藻液中的 GTX1，4，分别为 1．10和 0．99 μg /L，ＲSD分别为 3．3%和 4．4%，说明本方法具有较好的
检测限和较高的测定精密度。
关键词 膝沟藻毒素 GTX1，4;分子印迹固相萃取;分离富集;微小亚历山大藻;塔玛亚历山大藻
2015-09-19收稿;2015-12-04接受
* E-mail:jtwang@ ouc．edu．cn
1 引 言
麻痹性贝毒(Paralytic shellfish poisoning，PSP)是一类以石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)为骨架，具有
四氢嘌呤结构的生物碱分子。根据取代基的不同，可将其分为四类化合物［1］:氨基甲酸酯类毒素
(Carbamate toxins)、N-磺酰胺甲酰基类毒素(N-Sulfocarbamoyl toxins)、脱氨甲酰基类毒素(Decarbamoyl
toxins)以及脱氧脱氨甲酰基类毒素(Deoxydecarbamoyl toxins)。膝沟藻毒素 1，4(GTX1，4)就是一类氨
基甲酸酯类毒素，是赤潮发生时海水中存在的主要藻毒素之一，其产毒藻种主要有亚历山大藻属
(Alexandrium)的 A．tamarense、A．minutum，膝沟藻属(Gonyaulax)的 G． tamarensis，裸甲藻属(Gymnodi-
nium)的 G．catenatum，以及旋沟藻属(Prodinium)的 P．bahamense var．compressum等属种［2～5］。同时，由于
PSP 在贝类中大量富集，人类误食后易中毒，其毒性机理是:PSP 的活性部位与神经细胞膜上 Na+通道
位点 1 的氨基酸残基高度结合，阻断了 Na+通道，从而产生麻痹作用［6，7］，使人头疼、头晕，呼吸困难，甚
至死亡［8］，因此研究一种快速高效测定 PSP 的方法非常重要。
目前，检测 PSP 的方法主要有生物检测法和色谱法等，其中色谱法是现在最普遍的方法。生物检
测法包括小鼠生物测试法(Mouse bioassay，MBA)［9，10］和酶联免疫法(Enzyme linked immunosorbent
assay，ELISA)［11，12］;色谱分析法主要是高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)［13］，包括柱前衍生［14］和
柱后衍生［15］。虽然 HPLC-MS具有高选择性和灵敏度、检测限低等优点，但存在费时、成本高且技术要
求高等缺点，限制了其广泛应用。
分子印迹固相萃取技术(MISPE)作为一种常见的分离富集技术，能够选择性地吸附目标物质，再通
过合适的淋洗、洗脱步骤，使目标物质分离富集。该技术具有高选择性、高特异性结合能力、高灵敏度和
高回收率等优势，且成本低，耗时少，技术要求不高，已逐渐成为分离富集及检测微量、痕量物质的普遍
方法。
本研究采用本体聚合法，以 GTX1，4结构类似物鸟嘌呤核苷为模板，甲基丙烯酸(MAA)为功能单
体，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，合成了分子印迹聚合
物，对该聚合物的性质进行了相关分析，并测定了塔玛亚历山大藻和微小亚历山大藻藻液中 GTX1，4 的
浓度。
第 44卷
2016年 2月
分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
第 2期
212～217
2 实验方法
2．1 仪器、试剂与材料
日立 Hitachi D-2000 Elite高效液相色谱，L-2485荧光检测器;Nicolet Avatar-360 傅里叶变换红外光
谱(FT-IＲ) ;日立 Hitachi S-4800 冷场发射扫描电镜(SEM) ;Millipore Milli-Q超纯水仪。
GTX1，4标准品(GTX1浓度为(60．4±3．1)μmol /L，GTX4 浓度为(19．7±1．6)μmol /L，加拿大国家
海洋研究所) ;鸟嘌呤核苷(99%，上海阿拉丁生化科技) ;MAA(99%，天津博迪化工) ;EGDMA(98%，上
海阿拉丁生化科技) ;AIBN(分析纯，天津市大茂化学试剂厂) ;高碘酸(电泳纯，Sigma-Aldrich 公司) ;甲
酸铵(HPLC纯，Sigma-Aldrich 公司) ;冰醋酸(HPLC 纯，天津市科密欧化学试剂公司) ，甲醇、乙腈
(HPLC纯，Merck公司) ;塔玛亚历山大藻、微小亚历山大藻(国家海洋局第一海洋研究所)。
2．2 分子印迹聚合物(Molecular imprinted polymer，MIP)的合成
参照文献［16］的方法合成 MIP:将 0． 1416 g(0． 5 mmol)鸟嘌呤核苷溶于 15 mL 二甲基亚砜
(DMSO) ，加入 170．5 μL(2 mmol)MAA，超声 15 min，进行预聚合;加入 1．8824 mL(10 mmol)EGDMA和
30 mg AIBN，搅拌溶解;将得到的溶液倒入 250 mL 三口烧瓶中，通 N2气 15 min，60℃下，在恒温电磁搅
拌器中本体聚合 24 h，得到白色块状固体;将固体研碎，以 150 mL 甲醇-乙酸(9∶ 1，V /V)溶液为提取液，
索氏提取 48 h，去除模板分子，每隔一段时间用液相色谱检测洗脱液中的模板分子，直至色谱图中无模
板分子峰出现，说明洗脱已完全;用甲醇和水反复洗涤固体 3 次，烘干，研磨过筛，收集 40～75 目(200 ～
450 μm)之间的固体。非分子印迹聚合物(Non-molecular imprinted polymer，NIP)在相同条件下合成，只
是没有加入模板分子。
2．3 聚合物形态结构表征
聚合物的分子结构通过傅里叶变换红外光谱测定(KBr 压片法) ，聚合物形态通过扫描电镜表征，
表征之前需要喷金处理。
2．4 平衡吸附实验
称取 20 mg MIP 和 NIP 各 5份，分别加入到含 2 mL GTX1，4 标准品溶液的离心管中(浓度分别为
0，25，50，100和 200 μg /L)。将离心管置于恒温振荡器中，25℃下避光振荡 24 h。用注射器取上层液
体，过 0．22 μm滤膜，再取 100 μL过滤后的溶液于液相瓶中待测。
2．5 分子印迹固相萃取柱(Molecular imprinted solid-phase extraction，MISPE)
MISPE的装柱过程参考文献［17］的方法。称取 50 mg MIP 或 NIP 进行湿法装柱，氮气吹干备用。
过柱前先用 5 mL甲醇和 5 mL水活化柱子，然后分别进行上柱、淋洗和洗脱，探索最佳淋洗与洗脱条件，
每两步之间都须氮气吹干。分别收集上柱液、淋洗液和洗脱液，进液相色谱测定。
2．6 柱前衍生条件及液相色谱条件
2．6．1 衍生剂的制备及衍生过程 参考文献［18］的衍生方法，分别配制 0．03 mol /L 高碘酸溶液、
0．3 mol /L甲酸铵溶液和 0．3 mol /L磷酸氢二钠溶液。分别取上述溶液各 5 mL混合于烧杯中，用1 mol /L
NaOH调至 pH 8．2，备用。衍生过程中在 100 μL待测溶液中加入 500 μL衍生试剂，室温下反应至少 1
min。随后加入 5 μL冰醋酸终止反应。
2．6．2 液相色谱条件 参考文献［19］的液相色谱条件:流动相为 0．1 mol /L 甲酸铵溶液(含 2%乙腈) ，
流速为 1．1 mL /min;色谱柱为 Agela Technologies Venusil XBP C18(2) (250 mm×4．6 mm) ，柱温为 30℃;
荧光检测器激发波长为 340 nm，发射波长为 390 nm。
2．6．3 海水中 GTX1，4的测定 取进入稳定期的微小亚历山大藻和塔玛亚历山大藻藻液，经 0．45 μm
滤膜过滤，各取 50 mL通过 MISPE，在最佳淋洗条件下进行淋洗、洗脱，进液相色谱测定。
3 结果与讨论
3．1 聚合物形态结构表征
FT-IＲ用于观察聚合物的分子结构并确定模板分子是否成功被洗脱下来(图 1)。图 1 为未经过索
312第 2期 梅晓颀等:分子印迹固相萃取联用高效液相色谱分离测定海水中的膝沟藻毒素 GTX1，4
氏提取的 MIP、索氏提取后的 MIP 及 NIP 的红外光谱图。在图 1a 中，1540 cm!1有一个峰，这是 C N
的特征吸收峰，证明模板分子已经成功印迹到 MIP 中;而图 1b 和 1c 几乎没有区别，说明经过索氏提取
后，MIP 中已经没有模板分子残余。3550～3400 cm!1是 O H 和 N H 的伸缩振动，3000和2958 cm!1
分别为 C C H 和 C H 的伸缩振动，1732 cm!1为 C O 的伸缩振动，1640 cm!1为 C C 的伸缩
振动，1265 cm!1为羧基中 C O 的伸缩振动，证明聚合物中存在 MAA，1158 cm!1为酯基中 C O 的伸
图 1 分子印迹聚合物的 FT-IＲ
Fig．1 FT-IＲ of MIP and NIP
a:未经索氏提取的 MIP，b:索氏提取后的 MIP，c:NIP。
a:MIP before Soxhlet extraction，b:MIP after Soxhlet extrac-
tion，c:NIP．
缩振动，证明聚合物中存在 EGDMA。
SEM 用于观察聚合物的表面及内部结构
(图 2)。图 2a 和 2c 是 MIP 的表面和内部结构，
图 2b和 2d 是 NIP 的表面和内部结构。从图 2a 可
见，MIP 具有较多分布均匀紧密、孔径大小均一的孔
穴，而 NIP 不仅孔穴少，且分布不均，这是由于 NIP
缺少模板分子，而多孔结构的形成与致孔剂和模板
分子的作用有关，且在索氏提取中也能形成大量孔
穴。这种多孔结构提高了目标分子进入 MIP 的速
率，也增大了 MIP 的吸附容量。同时，从图 2c 与 2d
中也可见 MIP 比 NIP 具有更多分布均匀的孔穴。
3．2 平衡吸附实验
准确移取适量 GTX1，4 标准储备液，用水稀释。
按照 2．5节的方法。采用 HPLC 测定吸附后溶液中
剩余的 GTX1，4的浓度，根据吸附前后溶液中 GTX1，
图 2 MIP 和 NIP 的表面及内部 SEM图
Fig．2 SEM images of MIP (a． surface structure;c，inner stracture)and NIP (b，surface structure;
d，inner structure)
4的浓度计算 MIP 和 NIP 对 GTX1，4的结合量 Q(ng /g) ，其计算公式如下:
Q = (C0 － Ce)V /m
其中，C0为吸附前的初始浓度(μg /L) ;Ce 为吸附后的平衡浓度(μg /L) ;V 为标准溶液的体积(mL) ;
412 分 析 化 学 第 44卷
M为聚合物的质量(g)。
以峰面积(y)对 GTX1，4浓度(x)绘制标准曲线，曲线方程式为 y = 230．25x－1220．5，Ｒ2 = 0．9980。
以溶液中 GTX1，4的初始浓度为横坐标，相应的结合量 Q为纵坐标，绘制平衡吸附曲线(图 3)。从图 3
可见，随着 GTX1，4初始浓度增加，MIP 和 NIP 对 GTX1，4 的吸附量都呈现不断增加的趋势，但 MIP 的
吸附量远大于 NIP，且随着浓度的增加效果更明显，说明 MIP 比 NIP 具有更高的吸附容量和对 GTX1，4
更强的结合能力。当初始浓度达到最大(200 μg /L)时，MIP 的吸附量为 8560 ng /g，远大于 NIP
(6293 ng /g) ，这是由于模板分子的存在，形成的印迹聚合物内部具有与 GTX1，4 在空间结构上相互匹
图 3 MIP 和 NIP 的平衡吸附曲线
Fig．3 Static equilibrium adsorption curve of MIP and NIP
配的结合位点，使 MIP 的结合量远大于 NIP。
3．3 标准溶液的MISPE
以 50 μg /L GTX1，4标准溶液为上柱液，淋洗
液和洗脱液的选择参考文献［17］的方法。以
1 mL标准溶液为上柱液，当 1 mL 0．1 mol /L 乙酸
溶液通过 MISPE 或 NISPE 时，溶液中几乎没有
GTX1，4被洗下来(图 4a) ，说明经过淋洗过程后，
大部分杂质被洗了下来，而绝大部分 GTX1，4被保
留了下来。而当1 mL不同比例的甲醇-水溶液通
过固相萃取柱时，可观察到 GTX1，4的液相色谱峰
(图 4b)。本研究以0．1 mol /L 乙酸溶液为淋洗剂，
探讨不同比例的甲醇-水溶液作为洗脱剂的洗脱效
果见表 1。从表 1可以看出，随着甲醇-水比例的上升，MISPE 和 NISPE 的回收率都呈先下降后上升的
趋势，在甲醇∶水体积比为 5∶ 5时，达到最小(分别为 63．4%和 45．5%) ，在甲醇-水体积比为 95∶ 5 时达到
最大(分别为 85．0%和 59．9%)。因此，本研究选择 0．1 mol /L 乙酸溶液为淋洗剂，甲醇-水(95 ∶ 5，V /V)
溶液为洗脱剂。同时，从表 1 可见，在相同的洗脱条件下，MISPE 的回收率都远大于 NISPE，也验证了
MIP 比 NIP 具有更高的结合容量和选择性。
图 4 0．1 mol /L乙酸溶液淋洗液(a)和甲醇-水(95∶ 5，V /V)洗脱液(b)色谱图(50 μg /L)
Fig．4 Chromatogram of gonyautoxins 1，4 (GTX1，4)washed by 0．1 mol /L acetic acid (50 μg /L) (a)and
methanol-water (95∶ 5，V /V) (50 μg /L) (b)
表 1 不同比例甲醇-水作为洗脱液的 GTX1，4回收率
Table 1 Ｒecovery of GTX1，4 using different ratio of methanol and water as elution solution
甲醇-水
Methanol-water
(V /V)
MIP
初始浓度
Initial
concentration
(μg /L)
洗脱浓度
Elution
concentration
(μg /L)
回收率
Ｒecovery
(%)
NIP
初始浓度
Initial
concentration
(μg /L)
洗脱浓度
Elution
concentration
(μg /L)
回收率
Ｒecovery
(%)
1 ∶ 9 50 39．51 79．0 50 26．23 52．6
5 ∶ 5 50 31．70 63．4 50 22．73 45．5
9 ∶ 1 50 37．58 75．2 50 25．79 51．6
95 ∶ 5 50 42．52 85．0 50 29．94 59．9
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3．4 MISPE对海水中 GTX1，4的富集作用
将培养到稳定期的微小亚历山大藻和塔玛亚历山大藻(藻密度分别为 2．4×104和 2．2×104)的藻液
过滤后，通过 MISPE富集 50倍，即将 50 mL 藻液通过 MISPE 后，分别用 1mL 淋洗液和洗脱液进行处
理，收集洗脱液通过 HPLC进行检测，得到的色谱图见图 5a 和图 5b，在微小亚历山大藻和塔玛亚历山
大藻藻液中都检测到了 GTX1，4，其浓度分别为 1．10 和 0．99 μg /L，ＲSD 分别为 3．3%和 4．4%，说明
HPLC的精密度良好，可用于 GTX1，4的测定。
图 5 微小亚历山大藻(a)和塔玛亚历山大藻(b)洗脱液色谱图
Fig．5 Elution chromatograms of Alexandrium minutum (a)and Alexandrium tamarense (b)
4 结 论
利用本体聚合法，以 DMSO为溶剂，鸟嘌呤核苷为模板，MAA 为功能单体，EGDMA 为交联剂，AIBN
为引发剂 60℃下热引发合成了分子印迹聚合物。通过 FT-IＲ 和 SEM 发现 MIP 具有较多分布均匀紧
密、孔径大小均一的孔穴。平衡吸附实验表明，MIP 比 NIP 具有更高的结合容量和对 GTX1，4 的选择
性。以 0．1 mol /L 乙酸溶液为淋洗液，甲醇-水(95∶ 5，V /V)溶液为洗脱液，可以有效分离富集 GTX1，4，
回收率达到 85．05%。同时，在此淋洗条件成功的检测出了微小亚历山大藻和塔玛亚历山大藻藻液中的
GTX1，4，说明此方法可有效用于分离富集海水中的 GTX1，4，为检测海水中的 GTX1，4 提供了一种新思
路。
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Separation and Determination of Gonyautoxins 1，4 in Seawater by
Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction Coupled with
High Performance Liquid Chromatography
MEI Xiao-Qi，HE Xiu-Ping，WANG Jiang-Tao*
(Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology Ministry of Education，
Ocean University of China，Qingdao 266100，China)
Abstract A kind of molecular imprinted polymer (MIP)was synthesized by bulk polymerization using
guanosine as dummy template molecule． The results of Fourier transform infrared spectrometer (FT-IＲ)and
scanning electron microscope showed that MIP had homogenous and uniform-sized cavities． It was confirmed
that MIP had higher binding affinity and selectivity towards gonyautoxins 1，4 (GTX1，4)than NIP according
to the static equilibrium adsorption． The solid phase extraction columns were packed with MIP． The maximum
recovery (85．05%)of MISPE was achieved using 0．1 mol /L acetic acid as washing solution and ethanol-water
(95∶ 5，V /V)as elution solution． Then the concentrations of GTX1，4 from culture solution of Alexandrium
minutum and Alexandrium tamarense were determined to be 1．10 and 0．99 μg /L，respectively，under the
optimum conditions of washing and elution，and ＲSD was 3．3% and 4．4%，respectively，indicated good LOD
and higher precision．
Keywords Gonyautoxins 1，4; Molecularly imprinted solid phase extraction; Separation and
preconcentration;Alexandrium minutum;Alexandrium tamarense
(Ｒeceived 19 September 2015;accepted 4 December 2015)
櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫
《化工生产中有毒物质污染与防治技术》
本书在简述有毒化合物相关知识以及典型化工行业生产过程中有毒化合物产生情况的基础上，系统介绍了当前化
工生产中的清洁生产技术，化工行业废水中有毒污染物防治技术，有毒化合物实用处理技术与生物可降解性研究等内
容。另外，还以具体案例分析的形式详细介绍了化工生产中各类有毒物质的污染与实用防治技术。
书号:9787122252692 定价:88．0元
开本:16 出版日期:2016年 1月 化学工业出版社出版
712第 2期 梅晓颀等:分子印迹固相萃取联用高效液相色谱分离测定海水中的膝沟藻毒素 GTX1，4