全 文 ：《食品工业》2015 年第36卷第 9 期 129
工艺技术
膝沟藻毒素GTX 2, 3完全抗原的合成与鉴定
欧小蕾1，张锐2，章超桦1*
1. 广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，水产品深加工广东普通高等
学校重点实验室，国家贝类加工技术研发分中心（湛江）（湛江 524088）；
2. 广东海洋大学实验教学部现代生化中心（湛江 524088）
摘 要 膝沟藻毒素GTX 2, 3是一类小分子物质, 不具备免疫原性, 欲制备其免疫血清及抗体, 则必须与偶联剂及
载体蛋白偶联形成完全抗原。运用乙二醛作为偶联剂, 分别与牛血清白蛋白 (BSA)、血蓝蛋白 (KLH) 合成免疫抗原
GTX 2, 3-glyoxal-BSA和检测抗原GTX 2, 3-glyoxal-KLH, 并对经超滤纯化浓缩后的偶联产物进行BCA蛋白浓度测
定、全波段紫外扫描、变形SDS-PAGE凝胶电泳和抗原免疫原性的鉴定。结果表明, 免疫抗原和检测抗原的蛋白
质量浓度分别为8.52 mg/mL和5.72 mg/mL; 经全波段紫外扫描和变形SDS-PAGE凝胶电泳鉴定, 半抗原GTX 2, 3-乙
二醛与载体蛋白BSA、KLH偶联成功, 偶联比约为1︰16和1︰20, 并制备出纯度较高的免疫抗原; 用制备的人工抗原
GTX 2, 3-glyoxal-BSA对Balb/C小鼠进行免疫, 通过间接ELISA检测6免后小鼠血清效价达到1︰20 000。成功制备了
具有较强免疫原性的膝沟藻毒素GTX 2, 3人工抗原。
关键词 膝沟藻毒素GTX 2, 3; 人工抗原制备; 鉴定; 免疫原性
Preparation and Identification of Complete Antigen of Gonyaulax Parlaytic
Shellfish Toxin 2 and 3 (GTX 2, 3)
Ou Xiao-lei1, Zhang Rui2, Zhang Chao-hua1*
1. College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Guangdong Provincial Key
Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety, Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic
Products of Guangdong Higher Education Institution, National Research and Development Branch Center for
Shellfi sh Processing (Zhanjiang) (Zhanjiang 524088); 2. Center of Modern Biochemistry of Experimental
Teaching Department, Guangdong Ocean University (Zhanjiang 524088)
Abstract Preparing complete antigens of paralytic shellfi sh poisoning toxins GTX 2, 3, a GTX 2, 3-glyoxal was proposed to
be used as an intermediate cross-linking with BSA or KLH, by which two artifi cial complete antigens GTX 2, 3-glyoxal-BSA
and GTX 2, 3-glyoxal-KLH, as an immunizing and detected antigen respectively, were then prepared. The successful preparation
of the two complete antigens was identifi ed by BCA, UV spectral scanning and SDS-PAGE. Four female Balb/C mice were
immunized with GTX 2, 3-glyoxal-BSA conjugates by intraperitoneal immunization and the antibody titration in immunized
mice serum was measured by indirect ELISA. The concentration of the complete antigen of GTX 2, 3-glyoxal-BSA and GTX
2, 3-glyoxal-KLH were 8.52 mg/mL and 5.72 mg/mL. The UV spectral scanning and SDS-PAGE confi rmed that the hapten GTX
2, 3-glyoxal and carrier protein had been conjugated, with the coupling ratio of 1︰16 and 1︰20 of each protein and hapten,
along with the high purity of the immunizing complete antigens. The titer of 1︰20 000 after 6 times immunization of antibody
against GTX 2, 3 in mice serum was detected in indirect ELISA. In conclusion, the synthesized complete antigens, which have
strong immunogenicity, have been successfully prepared.
Keywords GTX 2, 3; complete antigen preparation; identifi cation; immunogenicity
*通讯作者；基金项目：国家贝类产业技术体系建设专项
（CARS-48）
近年来，海洋水体富营养化致使藻类异常增殖，
释放大量藻毒素（Algae toxin），严重危害了人类的
用水安全和其他水生生物的安全[1]，其中以膝沟藻
毒素（Gonyautoxin，GTX）为主的麻痹性贝类中毒
事件引起人们更多的关注。GTX是麻痹性贝类毒素
（Paralytic shellfish poisoning，PSP）家族中的重要成员
之一，目前已发现其异构体多达60余种。膝沟藻毒素
2, 3（Gonyautoxin 2 & 3，GTX 2, 3）是我国南海水域染
毒贝类和有毒赤潮藻中PSP的主要成分之一[2-3]。互为
空间异构体的GTX 2和GTX 3的毒性大，严重威胁消
费者的食用安全及健康。因此，加强对海洋贝类中
GTX 2, 3的检测尤为重要。以单克隆抗体（Monoclonal
antibody，MAb）为主的免疫学检测技术由于具有快
速、简便、灵敏高、检测限低、特异性强等特点，广
泛应用于海洋生物毒素的快速检测。近年有关麻痹
性贝毒（特别是石房蛤毒素STX）的免疫学测定方法
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已取得了重大进展，初步建立了麻痹性贝毒的放射
免疫测定技术和酶联免疫吸附测定技术（ELISA）。
其中，Johnson等1964年首次成功制备了抗STX的多克
隆抗体[4]，Adachi M等尝试用单克隆抗体技术现场监
测产麻痹性贝毒的有毒藻[5-7]。GTX 2, 3相对分子量小
（396.36 Da）、分子结构复杂（见图1）、官能团活
性低、不具备完全抗原，免疫易造成动物中毒、偶联
难度大，且毒素分离纯化不易、标准品价格昂贵，不
易制备其完全抗原特性。试验主要运用乙二醛作为偶
联剂[8]，分别与BSA、KLH合成人工抗原，并对偶联
产物进行鉴定。
图1　膝沟藻毒素的分子结构
1　材料与方法
1.1　试剂和仪器
膝沟藻毒素GTX 2, 3标品毒素：加拿大Express公
司产品；牛血清白蛋白BSA和匙血蓝蛋白KLH、弗
氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂：美国Sigma公司；辣
根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG：美国Southern
Biotech公司；BCA测蛋白浓度试剂盒：上海生工生物
工程技术服务有限公司；乙二醛甘氨酸、丙烯酰胺
等均为国产分析纯化学试剂：广州鼎国生物技术有限
公司。
北京普析TU-1900双光束紫外分光光度计：美国
Beckmen；酶标检测仪：北京六一仪器厂；DYCZ-
24DN型迷你双垂直电泳仪：珠海黑马Hema；GSG-
2000核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统；超过滤
管：Milly Pore；酶标板：广州鼎国生物技术有限
公司。
1.2　试验动物
雌性Balb/C小鼠，6周龄，约重15~18 g/只，购自
中山大学实验动物中心。
1.3　试验方法
1.3.1　完全抗原的偶联制备[8]
1.3.1.1　免疫抗原GTX 2, 3-乙二醛-BSA的制备：
1) 量取700 μL、质量浓度为2.37 mg/mL的GTX 2,
3毒素原液在避光条件下加入175 μL 0.1 mol/L Hac-
NaAc缓冲液，轻弹混匀。
2) 往（1）制得的溶液中加入7 μL 30%乙二醛溶
液，使醛类终浓度为0.5%。
3) 避光恒温25 ℃反应72 h后转入4 ℃冰箱反应过
夜（12~20 h，即先将GTX 2, 3活化）。
4) 称取0.002 3 g BSA溶于160 μL 0.01 mol/L pH 7.6
的PBS中，再往上述反应液中加入224 μL BSA溶液。
5) 再于25 ℃避光恒温72 h后转入4 ℃冰箱反应过
夜（12~20 h）。
6) 将反应液转移到截留分子量为3 kDa的超滤离
心管中，记下溶液体积，8 933×g离心15~20 min。
7) 收集超滤外液，并向超滤管中加入适当体积的
0.01 mol/L pH 7.6的PBS；重复离心2~3次；超滤离心
未反应的毒素和乙二醛小分子。
8) 收集超滤离心3次后的超滤外液0.2 mL注射
Balb/c雌性小鼠，观察小鼠是否在10 min内死亡。若
是，则说明超滤未完全，仍需继续超滤离心；若否，
则收集管内容物，分装，-20 ℃保存。
1.3.1.2　检测GTX 2, 3-乙二醛-KLH的偶联制备
1) 量取100 μL、质量浓度为2.37 mg/mL的GTX
2, 3毒素原液在避光条件下加入25 μL 0.1 mol/L Hac-
NaAc缓冲液，轻弹混匀。
2) 往（1）制得的溶液中加入1 μL 30%乙二醛溶
液，使醛类终浓度为0.5%。
3) 避光恒温25 ℃反应72 h后转入4 ℃冰箱反应过
夜（12~20 h，即先将GTX 2, 3活化）。
4) 量取质量浓度为5 mg/mL的KLH蛋白，溶于78
μL 0.01 mol/L pH 7.6的PBS中，再往上述反应液中加
入511 μL KLH蛋白溶液。
其余的制备方法同1.3.1.1。
1.3.2　完全抗原GTX 2, 3-Gly-BSA及GTX 2, 3-Gly-
KLH的鉴定
1.3.2.1　BCA法蛋白浓度测定（酶标板法）
取质量浓度为5 mg/mL BSA标准蛋白100 μL，用
0.01 mol/L pH 7.6的PBS稀释至1 mL，配制成500 μg/
mL的蛋白母液，并用该蛋白母液在25~500 μg/mL的
蛋白质量浓度范围内绘制标准蛋白曲线。于20 μL的
蛋白溶液中加入200 μL BCA工作液，60 ℃恒温反应
30 min，冷却至室温后，在酶标仪上检测各孔的吸光
度A562，同时绘制标准蛋白曲线。取待测蛋白液20 μL
加入200 μL BCA工作液，60 ℃反应30 min，冷却至
室温后，在酶标仪上检测各孔的A562并计算其蛋白
浓度。
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1.3.2.2　全波段紫外扫描鉴定
分别运用TU-1900双光束紫外分光光度计对
BSA、KLH载体蛋白以及0.5%乙二醛偶联剂的特征峰
进行全波段紫外扫描，波长设定范围600~190 nm，然
后对超滤内及半抗原分子（GTX 2, 3-乙二醛）上机检
测，记录特征吸收波长，判断是否成功制备完全抗原
GTX 2, 3-Gly-BSA、GTX 2, 3-Gly-KLH。并根据紫外
吸光度计算完全抗原偶联比的计算公式[9]，计算免疫
抗原与检测抗原的偶联率。
1.3.2.3　免疫抗原GTX 2, 3-Gly-KLH变性SDS-PAGE
凝胶电泳鉴定
配制10%分离胶和5%浓缩胶，并对蛋白样品进行
稀释和加热变性。样品用PBS稀释至10 μL后与2.5 μL
5×SDS上样缓冲液混合，经振荡离心后将样品置于加
热仪上100 ℃加热变形4 min，待样品冷却至室温后用
微量注射器进行上样，上样体积为10 μL，上样的蛋
白量为2 μg。浓缩胶和分离胶均使用80 V的电压，当
染料至胶底0.5~1 cm时结束，关闭电源。用5倍胶体积
的考马斯亮蓝染色浸泡胶染色，50 r/min，25 ℃，摇
床染色1.5~2 h。再用5倍胶体积的甲醇-乙酸脱色液浸
泡胶摇床清洗，直至背景脱净。最后将洗好的胶放入
凝胶成像系统中拍照并分析试验数据。
1.3.3　人工抗原的免疫原性鉴定
1.3.3.1　动物免疫及小鼠免疫血清的采集
对6只8周龄的健康雌性Balb/c小鼠进行腹腔注射
免疫，其中4只小鼠注射膝沟藻毒素完全抗原GTX 2,
3-乙二醛-BSA，2只作为阴性对照注射PBS溶液。
初次免疫均与等量的弗式完全佐剂混合，用注射器
双推法使抗原完全乳化均匀，对小鼠腹腔进行注射
免疫，蛋白免疫剂量为50 μg/只。两周后用同样的
方法进行第二次免疫，与等量的弗式不完全佐剂混
合，免疫方法和蛋白免疫剂量同初免。以后每两周
免疫一次，每次均与弗式不完全佐剂混匀，免疫方
法和蛋白免疫剂量均同二免，共免疫六次。从二免
开始，每次免疫后的第7天进行断尾采血，将采集到
的小鼠全血于经过高温灭菌的1.5 mL离心管中，经37
℃孵育箱中恒温孵育0.5~1 h后，取出放入4 ℃冰箱
中过夜，使血清充分析出。经16 281×g、4 ℃离心
11 min，收集血清，并用间接ELISA法测定小鼠血清
效价。
1.3.3.2　小鼠免疫血清的效价测定（间接ELISA法检
测）[10-11]
1) 取检测抗原GTX 2, 3-乙二醛-KLH用0.05 mol/
L，pH 9.6的包被缓冲液（CB液）稀释至1 μg/mL后加
入到酶标板中，每孔100 μL，4 ℃包被过夜。
2) 弃去板孔中的包被液，并轻轻拍干。
3) 用含有3%脱脂奶粉的PBST洗涤缓冲液进行封
闭，每孔120 μL，37 ℃封闭1 h。
4) 甩干板孔中的封闭液，每孔加入350 μL PBST
洗涤，放置1~2 min，轻轻敲拍板框，弃去洗涤液，拍
干，重复洗板2次。
5) 用PBST对小鼠免疫血清进行倍比稀释，稀释倍
数分别为500，1 000，2 000，4 000，8 000，16 000，
32 000和64 000，阴性血清作相同的倍比稀释，同时
以PBS作为空白对照，分别加入到板孔中，每孔100
μL，37 ℃孵育30 min。
6) 洗板4次，操作同（5）。
7) 用PBST对1∶800克伦保存液稀释的辣根过氧化
物酶标记的羊抗鼠IgG（酶标二抗）进行10倍稀释，
每孔100 μL，37 ℃孵育30 min。
8) 洗板4次，操作同（5）。
9) 加入新配制的TMB底物工作液（现配现用），
每孔100 μL，37 ℃显色15 min。
10) 每孔加入50 μL 2 mol/L硫酸终止显色反应，
于酶标仪上测定样品的OD450。
从二免开始，每免疫一次的第7天对小鼠进行免
疫血清的采集及血清抗体效价的测定，检测小鼠中抗
体产生的情况。
2　结果与分析
2.1　BCA法检测完全抗原的蛋白浓度
试验所绘制的BSA标准蛋白曲线线性方程为
y=0.002x，R2=0.999 7＞0.99，说明所建立的蛋白标准
曲线在一定浓度范围内具有良好的线性关系。根据标
准曲线及完全抗原稀释倍数的计算，免疫抗原GTX 2,
3-Gly-BSA与检测抗原GTX 2, 3-Gly-KLH的质量浓度
分别为8.52 mg/mL和5.72 mg/mL。
图2　BSA标准蛋白浓度曲线
2.2　全波段紫外扫描鉴定结果
从紫外扫描分析图谱（图2和图3）中可看出，载
体蛋白BSA和KLH在278 nm波长处有强吸收，GTX 2,
3-Gly半抗原分子在该波长处吸收较弱，且最大吸收
峰位置与偶联剂和载体蛋白的不重叠。而合成的完全
抗原的紫外光谱扫描的特征谱线与偶联剂乙二醛、
GTX 2, 3-Gly半抗原、载体蛋白BSA和KLH的最大吸
收峰有较大的差别，初步说明试验成功偶联制备了完
全抗原GTX 2, 3-Gly-BSA与GTX 2, 3-Gly-KLH。经完
全抗原偶联比的公式计算，免疫抗原GTX 2, 3-Gly-
BSA和检测抗原GTX 2, 3-Gly-KLH的偶联比约分别为
1∶16和1∶20。
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图3　免疫抗原GTX 2, 3-Gly-BSA的紫外光谱图
图4　检测抗原GTX 2, 3-Gly-KLH的紫外光谱图
2.3　免疫抗原GTX 2, 3-Gly-KLH变性SDS-PAGE凝胶
电泳鉴定结果
免疫抗原经10%变性SDS-PAGE凝胶电泳鉴定
后，结果如图5。GTX 2, 3与载体蛋白BSA偶联后电
泳条带单一、不分散，说明所制备的免疫抗原纯度
较高，蛋白杂质影响少，并且完全抗原的电泳迁移
速率与载体蛋白的相比有比较明显的变化。利用低
分子量标准蛋白Marker在凝胶中的相对迁移率与分
子量的关系，经凝胶成像系统仪分析，绘制出标准
曲线并求出回归方程，计算出此次偶联制备免疫抗
原的蛋白分子量约为70 kDa，与载体蛋白BSA的偶联
比约为15∶1。
图5　免疫抗原变性SDS-PAGE凝胶电泳分析结果
2.4　抗GTX 2, 3小鼠免疫血清的效价测定
试验以GTX 2, 3-Gly-KLH作为检测抗原，GTX 2,
3-Gly-BSA作为免疫抗原，通过运用间接ELISA检测
经过6次腹腔注射免疫后各小鼠血清中抗GTX 2, 3抗体
的效价，检测结果如图6所示。由结果可以看出，所
制备的完全抗原GTX 2, 3-Gly-BSA偶联物能够诱导小
鼠产生抗GTX 2, 3抗体，其中以免疫6次后的小鼠1血
清中抗体效价最高，达到1∶20 000，说明试验所制备
的完全抗原具有较好的免疫原性。
图6　腹腔免疫小鼠血清抗体效价的变化曲线
3　结论
GTX 2, 3的相对分子量小（396.36 Da）、毒性
大，是典型的半抗原分子，其本身不能诱导小鼠产生
针对该分子的抗体。GTX 2, 3只有与分子量大、免疫
原性好的载体蛋白偶联后，才能制备出具有较好免
疫原性的完全抗原。试验主要是在前人的研究基础
上[8]，利用乙二醛作为偶联剂偶联制备膝沟藻毒素完
全抗原GTX 2, 3-Gly-BSA与GTX 2, 3-Gly-KLH，并通
过BCA蛋白浓度检测、全波段紫外扫描、变性SDS-
PAGE凝胶电泳和间接ELISA法检测腹腔免疫小鼠抗血
清效价对完全抗原进行免疫原性的测定等的抗原鉴定
试验，表明试验运用乙二醛作为偶联剂成功、有效地
制备出了具有较好免疫原性的GTX 2, 3完全抗原，能
够诱导小鼠产生针对GTX 2, 3的抗体，为抗GTX 2, 3单
克隆抗体的制备及GTX 2, 3免疫学快速检测方法的建
立奠定试验基础。
参考文献：
[1] BEITLER M K, LISTON J. Uptake and tissue distribution
of PSP toxins in butter clams. In: Graneli, ed[M]. New York:
Elsevier Science Publishers B V, 1990: 257-262.
[2] WANG D Z, HSIEH D P H. Dynamics of C2 toxin and
chlorophyll—a formation in the dinoflagellate Alexandrium
tamarense during large scale cultivation[J]. Toxicon, 2001,
39(10): 1533-1536.
[3] ZHOU M J, LI J, LUCKAS B, et al. A recent shellfish toxin
investigation in China[J]. Marine Pollution Bulletin, 1999,
39(1-12): 331-334.
[4] JOHNSON H M, FREY P A, ANGELOTTI R, et al.
Haptenic properties of paralytic shellfish poison conjugated
to proteins by formaldehyde treatment[J]. Proc Soc Exp Biol
《食品工业》2015 年第36卷第 9 期 133
工艺技术
Med, 1964(117): 425-430.
[5] ADACHI M, SAKO Y, ISHIDA Y. Application of
monoclonal antibodies to field samples of Alexandrium species
[M]. Japan: Nippon Suisan Gakkaishi, 1993(59): 1171-
1175.
[6] KENTARO K, YONEKAZU H, AKIRA S, et al .
Development and application of an enzyme immunoassay
based on a monoclonal antibody against gonyautoxin
components of paralytic shellfish poisoning toxins[J]. Journal
of Food Protection, 2002, 65(8): 1304-1308.
[7] MICHELI L, DI STEFANO S, MOSCONE D, et al.
Production of antibodies and development of highly sensitive
formats of enzyme immunoassay for saxitoxin analysis[J].
Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2002: 678-684.
[8] 张锐, 章超桦, 秦小明. 一种膝沟藻毒素GTX 2, 3人工抗
原制备的新方法: 中国, CN102807616 A[P]. 2012.06.15.
[9] 杜瑞雪. 多氯联苯的酶联免疫吸附分析[D]. 济南: 山东师
范大学, 2009.
[10] ZHANG R, HE J, SU H, et al. Identification of the
structural proteins of VP1 and VP2 of a novel mud crab
dicistrovirus[J]. J Virol Methods, 2011, 171(2): 323-328.
[11] CHAO-CHENG CHEN, YU-CHANG TAI, SZU-
CHUAN SHEN, et al. Detection of alkaline phosphatase by
competitive indirect ELISA using immunoglobulin in yolk
(IgY) specific against bovine milk alkaline phosphatase[J].
Food Chemistry, 2006, 95(2): 213-220.
酵母葡聚糖鲭鱼鱼丸的研制及其质构特性和
防腐效果的研究
佘文熙，曾宇，赵俐娜，刘颖，王雪娇，邹宇*
大连民族大学生命科学学院（大连 116600）
摘 要 以酵母葡聚糖和鲭鱼为主要原料, 研制酵母葡聚糖鲭鱼鱼丸, 并考察酵母葡聚糖对鲭鱼鱼丸质构特性和防
腐效果的影响。正交试验结果表明, 酵母葡聚糖鲭鱼鱼丸的最优配方为: 酵母葡聚糖添加量为0.7%, 鲭鱼鱼糜添加
量为50%, 食盐添加量为3%。以最优配方制作酵母葡聚糖鲭鱼鱼丸, 其硬度、内聚性、弹性、咀嚼性和黏性分别为
525.46 g, 0.68, 0.70 mm, 163.06 g和39.78 g·s, 这与未添加酵母葡聚糖的对照组无明显差别。酵母葡聚糖鲭鱼鱼丸贮
藏期间的菌落总数明显低于对照组, 说明酵母葡聚糖增强了鲭鱼鱼丸的防腐效果。
关键词 酵母葡聚糖; 鲭鱼; 鱼丸; 质构特性; 防腐效果
Development of Yeast Glucan Mackerel Fish Ball and Its Texture
Property and Antiseptic Effect
She Wen-xi, Zeng Yu, Zhao Li-na, Liu Ying, Wang Xue-jiao, Zou Yu*
College of Life Science, Dalian Nationalities University (Dalian 116600)
Abstract Yeast glucan and mackerel were used as the main raw material to develop fi sh ball and infl uence of yeast glucan
on texture property and antiseptic effect of mackerel fi sh ball was investigated. The orthogonal experiment results showed
the optimum formula of yeast glucan mackerel fi sh ball as followings: yeast glucan 0.7%, mackerel surimi 50% and salt 3%.
When the yeast glucan mackerel fi sh ball was produced with the optimal formulation, its hardness, cohesiveness, springiness,
chewiness and adhesiveness were 525.46 g, 0.68, 0.70 mm, 163.06 g and 39.78 g·s, respectively. These texture properties had
no signifi cant difference with the control group without yeast glucan. Colony count of yeast glucan mackerel fi sh ball was
obviously lower than that of the control group during the storage, which indicated that yeast glucan could enhance antiseptic
effect of mackerel fi sh ball.
Keywords yeast glucan; mackerel; fi sh ball; texture property; antiseptic effect
鲭鱼属鲈形目，鲭科，为暖水性中上层洄游鱼
类，广泛分布于我国沿海地区，是我国重要的经济鱼
类[1]。鲭鱼鱼肉内鱼刺较少，适合加工为鱼丸等鱼糜
制品，但鲭鱼鱼肉营养丰富，尤其是蛋白质和脂肪含
量较高，易受微生物污染而发生腐败变质，这严重影
响了鲭鱼鱼丸的货架期。