全 文 ： 第 28卷第 3期
2008年 6月
惠州学院学报(自然科学版)
JOURNALOFHUIZHOUUNIVERSITY
Vol.28.No.3
Jun.2008
收稿日期:2008-02-10
基金项目:国家自然科学基金研究项目(40376030)
作者简介:罗辉武(1982-),男 ,湖南永州人 ,助教 ,硕士 ,研究方向为免疫学及工程抗体研究。
膝沟藻毒素 GTX2 , 3完全抗原的 HPLC及免疫学鉴定
罗辉武1, 2 , 向军俭2
(1.惠州学院 生命科学系 , 广东 惠州 516007;2.暨南大学 生命科学学院 , 广东 广州 510632)
摘 要:通过醛化法将膝沟藻毒素(GTX2, 3)分别与血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联制备完全抗原 ,
高效液相色谱法(HPLC)检测醛化反应前后游离 GTX2, 3的浓度 , 完全抗原免疫 Balb/C小鼠 , 间接酶免疫吸附试验
检测免疫后血清中抗体效价。 GTX2, 3与 KLH及 BSA偶联反应前溶液中毒素的浓度分别为 760μg· mL-1和 660μg
· mL-1 , 偶联反应后毒素的浓度分别为 191μg· mL-1及 256μg· mL-1 , Balb/C小鼠经过 5次免疫后血清的效价为
1:500。结果表明 ,反应后游离的 GTX2, 3的浓度降低 ,制备的 GTX2, 3完全抗原免疫小鼠后小鼠产生抗 GTX2, 3抗
体 , 说明 GTX2, 3与载体蛋白发生偶联反应 , 偶联物具有免疫原性。
关键词:膝沟藻毒素;完全抗原;制备;鉴定
中图分类号:R392 文献标识码:A 文章编号:1671-5934(2008)03-0009-04
麻痹性贝类毒素(PSP)是最常见的赤潮毒素之一。 PSP的毒性作用机理为阻断细胞钠离子通道 ,引起神经系
统信号传导障碍而产生麻痹作用 ,严重者导致呼吸困难甚至威胁生命 [ 1] 。 PSP毒素种类较多 ,目前已经发现的就
有 20多种。膝沟藻毒素 GTX2, 3是我国沿海赤潮藻和染毒贝类中常见的麻痹性贝类毒素之一 ,南北海域均有发
现 [ 2, 3] 。随着海洋环境污染的加剧 ,赤潮的发生也越来越频繁 ,麻痹性贝类毒素也极大地威胁着人们对于海洋贝
类食品的食用安全。因此 ,加强对海产品中毒素的检测就显得尤为重要。免疫学检测方法因其快速 、灵敏 、方便
的特点而倍受人们的关注。 GTX2, 3分子量为 396 Da,是典型的半抗原 ,欲制备其抗体并建立起快速的免疫学检
测方法 ,首先就要将 GTX2, 3与载体蛋白偶联制备出完全抗原。 GTX2, 3分子结构简单 ,毒性强 、提取困难 ,本身
无紫外吸收 ,这给其完全抗原的制备及检测带来了困难。本研究通过高效液相色谱法 (HPLC)检测 GTX2, 3与载
体蛋白反应前后的毒素的浓度变化 ,并将完全抗原免疫 Balb/C小鼠 ,证明制备得到的完全抗原能够诱导 Balb/C
小鼠产生抗体 ,为免疫学检测方法的建立奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
Balb/C小鼠 ,雌性 , 8周龄 ,购自中山大学实验动物中心。
1.2 试剂和仪器
膝沟藻毒素 GTX2, 3由香港科技大学 Hsieh教授惠赠;GTX2, 3标准品购自加拿大海洋生物研究所;弗氏完全
及不完全佐剂购自 Sigma公司;酶标板是深圳金灿华公司产品;葡萄糖氧化酶(GOX)购于上海生工生物工程有限
公司 ,其余试剂均为分析纯。 ThermoLabsystems酶标仪 ,日本岛津高效液相色谱仪。
1.3 GTX2, 3与载体蛋白偶联物的制备
免疫抗原 GTX2, 3-KLH及 GTX2, 3-BSA偶联物的制备按照 Kentaro及 Micheli方法进行 [ 4 , 5] 。将反应溶液
转移到截留分子量为 5000 Da的超滤管中 ,并记下溶液的体积 , 4000 rpm离心 10 min;收集超滤外液 ,并向超滤管
中加入适当体积的 1mmol· L-1的醋酸溶液。重复离心 2次 ,将超滤管倒转离心 , 4000 rpm离心 5 min,收集管内容
物 ,分装 , -20℃保存。
惠州学院学报(自然科学版) 2008年第 28卷
1.4 HPLC检测偶联反应前后 GTX2, 3溶液浓度
庚基磺酸钠 -磷酸溶液作为 HPLC流动相 ,磷酸氢二钾 -高碘酸溶液作为氧化剂 , 0.5mol· L-1的醋酸溶液作
为酸化剂 , HPLC分别检测 GTX2, 3标准毒素 、GTX2, 3毒素反应溶液 ,及 GTX2, 3与 KLH及 BSA反应后游离毒素
浓度。
1.5 Balb/C小鼠免疫及免疫后血清中抗体的检测
首次免疫将反应得到的 GTX2, 3-KLH完全抗原与弗氏完全佐剂混合 ,小鼠腹部皮下注射。首次免疫 2周后
取完全抗原与弗氏不完全佐剂混合 ,小鼠腹部皮下多点免疫。免疫三次后小鼠断尾放血 ,分离血清 ,以浓度为
40μg· mL-1的 GTX2, 3 -BSA作为检测抗原 ,间接 ELISA检测血清中抗体效价。
2 实验结果
2.1 HPLC检测 GTX2, 3与载体蛋白 KLH及 BSA反应前后毒素的浓度
分别用 HPLC先后检测 GTX2, 3标准毒素 、GTX2, 3毒素反应溶液及 GTX2, 3与 KLH及 BSA反应后游离毒素
浓度。以 GTX2, 3标准毒素的 HPLC检测峰面积作为标准计算各检测结果。
GTX2, 3标准毒素([ GTX2] =2.37μg· mL-1 , [ GTX3] =0.58μg· mL-1)的 HPLC检测结果如图 1所示 , GTX2
和 GTX3的保留时间分别约为 15.5 min和 12 min,峰面积分别为 27.5和 79.9。
图 1 GTX2, 3标准毒素的 HPLC分析
HPLC分析 GTX2, 3毒素工作溶液的结果如图 2。在保留时间分别为 12 min和 15.5 min时出现两个峰 ,分别
为 GTX3和 GTX2,面积分别为 124.2和 451,根据两个峰面积与图 1中标准毒素的峰面积之比计算得到毒素工作
液中 GTX2和 GTX3的浓度分别为 0.74mg· mL-1和 1.9mg· mL-1 , GTX2, 3总浓度为 2.64mg· mL-1 。
图 2 GTX2, 3毒素工作液的 HPLC分析
图 3 GTX2, 3-KLH偶联物超滤外液的 HPLC分析
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第 3期 罗辉武等:膝沟藻毒素 GTX2, 3完全抗原的 HPLC及免疫学鉴定
GTX2, 3 -KLH偶联物超滤外液 1:50稀释后的 HPLC分析结果如图 3。
GTX2和 GTX3的峰面积分别为 108.5和 6.37,同上可以计算得到该反应后两毒素的浓度分别为 184μg·
mL-1和 6.7μg· mL-1 ,与反应开始时毒素的浓度 760μg· mL-1相比 ,毒素浓度降低 ,故可以初步判断有一部分毒
素结合到载体蛋白上。
GTX2, 3 -BSA偶联物超滤外液 1:40稀释后的 HPLC检测结果如图 4,同理计算得到 GTX2, 3 -BSA偶联物超
滤外液中 GTX2的浓度为 249μg· mL-1 , GTX3的浓度为 6.5μg· mL-1 ,与反应前 GTX2, 3的浓度 660μg· mL-1相
比 ,浓度降低。
图 4 GTX2, 3-BSA偶联物超滤外液 HPLC分析
图 5 五次免疫后小鼠血清的 ELISA检测
2.2 Balb/C小鼠免疫后血清中抗 GTX2, 3抗体的检测
以 GTX2, 3-BSA作为检测抗原 ,间接 ELISA检测各免疫小鼠血清中抗 GTX2, 3抗体 ,检测结果如图 5所示。
由结果可以看出 , GTX2, 3与 KLH反应后的偶联物能够诱导小鼠产生抗 GTX2, 3的抗体 ,免疫 5次以后 2#小鼠血
清中抗体效价约为 1:500。
3 讨论
GTX2, 3分子量只有 396Da,是典型的半抗原 ,其本身不能诱导小鼠产生针对该分子的抗体。 KLH分子量大 、
免疫原性好 ,是常用的载体蛋白 ,且制备得到的抗体与载体蛋白的交叉反应少。之前本实验室尝试利用醛化法将
GTX2, 3与载体蛋白 BSA偶联免疫小鼠 ,制备的抗体与载体蛋白之间存在一定的交叉反应。
GTX2, 3分子本身没有紫外吸收特性 ,故不能通过紫外吸收光谱法检测 GTX2, 3与载体蛋白偶联反应结果。
Kralovec等通过毛细管电泳法检测偶联反应前后游离毒素的量的变化来定性判断反应的发生及定量检测偶联反
应的发生程度 [ 6] ,国内近期也有利用毛细管电泳检测 GTX2, 3的报导 [ 7] 。与毛细管电泳检测法相比 , HPLC检测
方法更为成熟和简便。本研究中由 HPLC法检测结果计算得到反应后 GTX2, 3的量减少 ,表明 GTX2, 3与载体蛋
白发生偶联反应。
GTX2, 3分子结构简单 ,免疫原性较弱 ,需要多次长时间免疫才能诱导小鼠产生较强的免疫应答。 Kentaro等
将 GTX2, 3与 KLH偶联免疫小鼠 ,免疫次数达到 7次 ,免疫周期更是长达 19周 ,小鼠才产生较强的免疫应答 [ 4] 。
本研究利用 GTX2, 3-KLH偶联物作为免疫原经过五次免疫小鼠血清中抗体效价为 1:500,这也表明制备的
GTX2, 3 -KLH具有免疫原性。
本研究利用甲醛法将膝沟藻毒素 GTX2, 3与载体蛋白偶联 , HPLC法检测反应前后游离毒素的量表明 GTX2,
3与载体蛋白 KLH及 BSA发生反应 ,得到的 GTX2, 3 -KLH具有免疫原性 ,能够诱导小鼠产生针对 GTX2, 3的抗
体 ,为 GTX2, 3免疫学检测方法的建立奠定了基础。
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惠州学院学报(自然科学版) 2008年第 28卷
参考文献:
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【责任编辑:王国莉】
TheIdentificationofGTX2, 3ImmunogenbyHPLCandImmuno-methods
LUOHui-wu1 , 2 , XIANGJun-jian2
(1.DepartmentofLifeScience, HuizhouUniversity, Huizhou516007 , GuangdongChina;
2.CouegeofLifeScience, JiNanUniversity, Guangzhou510632 , GuangdongChina)
Abstract:GTX2, 3 wasconjugatedwithcarrierproteinandKLHandBSAbythemethodsofformaldehyde.Theconcentrationof
GTX2, 3 beforeandafterthereactionwasdetectedthroughHPLC.Balb/CmicewereimmunizedwithGTX2, 3-KLHconjugatesand
theantibodytitrationinimmunizedmiceserumwasdetectedbyindirectenzyme-linkedimmunoassay.Beforetheconjugationreaction,
theconcentrationofGTX2, 3was760μg· mL-1 and660μg· mL-1 separatelybeforereactingwithKLHandBSA.Afterthereaction,
thecorrespondingconcentrationwas191μg· mL-1 and256μg· mL-1.TheantibodytitrationagainstGTX2, 3 inmiceserumwas1:
500 after5 timesimmunization.TheimmunogenofGTX2, 3 wereproducedsuccessfulythroughthemethodsofformaldehyde, andthe
synthesizedGTX2, 3-KLHconjugateswereimprovedfortheantibodyproductionofGTX2, 3 asimmunogen.
Keywords:gonyautoxin;GTX2, 3;immunogen;production;identification
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