全 文 ：第 40卷 第 1期 海 洋 与 湖 沼 Vol.40, No.1
2 0 0 9 年 1 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Jan., 2009

* 上海市优秀学科带头人计划项目, 08XD14037号; 上海市青年科技启明星计划项目, 08QA1405900号; 上海市登山计划项
目, 06dz12015 号; 上海市教委重点科研项目, 科 04-131 号; 上海市重点学科建设项目, Y1101 号; 上海市教委重点学科项目,
J50701 号; 上海市优秀青年教师选拔基金项目, 科 07-10 号; 上海海洋大学博士启动基金项目, 科 06-310 号。陈桃英, 博士, 讲
师, E-mail：tychen@shou.edu.cn
① 通讯作者: 何培民, E-mail：pmhe@shou.edu.cn
收稿日期: 2007-11-17, 收修改稿日期: 2008-01-23
膝沟藻毒素液质联用快速检测及其在海洋
生物体内的累积*
陈桃英1 柳俊秀1 李水军2 刘利平 1 何培民1①
(1. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306; 2. 上海市徐汇区中心医院中心实验室 上海 200031)
提要 采用高效液相色谱-质谱联用技术分析了微小亚历山大藻中的膝沟藻毒素(Gonyautoxin,
GTX1,4和 GTX2,3)以及蒙古裸腹溞和菲律宾蛤仔摄食该藻后对膝沟藻毒素的累积状况。结果表明, 采
用高效液相色谱-质谱联用方法, 可快速(4h 内)检测出这三种海洋生物中的膝沟藻毒素, 且培养的微
小亚历山大藻每个细胞的膝沟藻毒素含量为 9.46fmol。蒙古裸腹溞摄食微小亚历山大藻 2h、18h、
24h 后, 其体内 GTX1,4的含量分别为 4.8908、12.6241、31.4968mg/g, GTX2,3的含量分别为 1.656、
3.8533、10.9026 mg/g, 且对 GTX1,4积累量比 GTX2,3高, 在 24h内 GTX1,4含量是 GTX2,3的 2.89倍。菲律
宾蛤仔摄食微小亚历山大藻 2h、24h和 48h后, 肌肉中 GTX1,4含量分别为 3.1271、3.6709和 4.6906 μg/g,
GTX2,3含量分别为 7.1874、8.1675 和 9.1476 μg/g; 内脏团中 GTX1,4含量分别为 4.7088、4.2178 和
5.5064 μg/g, GTX2,3含量分别为 7.6774、9.1476和 13.066 μg/g, 表明 GTX1,4和 GTX2,3在肌肉中含量
逐步增加, 且 GTX2,3累积量比 GTX1,4高, 在 48h 内肌肉 GTX2,3含量是 GTX1,4的 1.95 倍, 内脏团
GTX2,3含量是 GTX1,4的 2.37倍。在停食净水培养 96h后, 内脏团和肌肉对 GTX1,4消解率已达 100%, 而
肌肉和内脏团对 GTX2,3消解率分别为 16.1%和 45%。本文结果表明采用高效液相色谱-质谱联用方法能
快速测定赤潮藻、浮游动物和贝类中的膝沟藻毒素含量, 但不同生物对膝沟藻毒素有不同的累积方式。
关键词 高效液相色谱-质谱联用, 微小亚历山大藻, 蒙古裸腹溞, 菲律宾蛤仔, 膝沟藻毒素, 累积
中图分类号 X55
麻痹性贝类毒素 (Paralytic Shellfish Poisoning,
PSP)是目前已知的赤潮生物毒素中 , 发生次数最频
繁 , 对人类影响最严重的一种 (Hallegraeff, 1995;
Landsberg, 2002), 该毒素主要通过污染水产品对人
类产生影响, 目前最受关注的是双壳类。各国均已投
入了大量的人力物力进行这方面的研究 , 并制定出
了贝类卫生质量标准和相应的法律法规 , 例如美国
的 National Shellfish Sanitation Program (NSSP)计划、
欧盟的 91/492/EEC 指令等, 然而我国在此领域还相
对落后。据报道, 我国从南至北均有 PSP毒素污染的
贝类分布(Zhou et al, 1999)。而我国海洋生物毒素的
检测分析方面比较落后 , 尚未建立起有效的生物毒
素测试方法, 因此, 为保障水产品食用安全, 加强对
海洋生物毒素的检测分析工作是非常必要的。
目前 , 小鼠生物测试法和高效液相色谱是 PSP
毒素最常用的分析手段。其中小鼠生物测试法存在如
重现性差、易产生假阳性结果、耗时长等缺点, 而且
还受到动物保护人士的谴责。色谱能有效分离混合物,
但难以得到物质的结构信息。质谱能够提供物质的结
构信息, 且用样量非常少, 但其分析的样品需要进行
1期 陈桃英等: 膝沟藻毒素液质联用快速检测及其在海洋生物体内的累积 89
纯化。因此, 将色谱和质谱联接起来使用可以弥补这
两种仪器各自的缺点 , 液相色谱和质谱两种技术联
用在海洋生物毒素的检测分析已表现出强大的优势
(Tsai et al, 2005; Tsuruda et al, 2002; Oikawa et al,
2002)。本实验中主要采用高效液相色谱-质谱联用技
术初步分析了微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)
细胞中的膝沟藻毒素含量 , 溞以及蒙古裸腹 (Moina
mongolica Daday)和菲律宾蛤仔 [Ruditapes philippi-
narum (Adams et Reeve)]摄食微小亚历山大藻后对膝
沟藻毒素的累积状况, 以建立藻毒素液相色谱-质谱
技术联用快速检测技术 , 为我国水产品贝类中海洋
生物毒素的检测分析工作提供理论依据和技术指导。
1 材料与方法
1.1 实验材料
微小亚历山大藻为中国科学院海洋研究所生态
溞毒理实验室赠送。蒙古裸腹 和海水小球藻(Chlorella
spp.)由上海海洋大学海洋生物实验室提供。菲律宾蛤
仔从上海市图门路集市购买, 其壳长(3.12±0.22)cm,
体重(5.92±0.88)g。微小亚历山大藻和海水小球藻均
采用 f/2 培养液培养, 温度为(20±1)℃, 光照强度为
3000—4000 lx 溞。蒙古裸腹 用海水小球藻喂养。
1.2 微小亚历山大藻细胞毒素提取
藻毒素提取方法见文献 (张清春等 , 2005)。取
50ml 和 100ml 指数生长期的微小亚历山大藻, 于显
微镜下计数密度 , 并用超微滤膜低真空抽滤收集藻
细胞, 剪碎滤膜于 7ml离心管中, 加入 4ml 0.05mol/L
乙酸溶液, 用超声波处理破碎细胞, 6000r/min 离心
10min, 收集上清液, 用 0.22 μm超微滤膜过滤, 收集
滤液, 即为 PSP毒素提取液, 置于 4℃保存备用。
1.3 蒙古裸腹溞组织中毒素提取
用 20 μm筛绢过 溞滤收集蒙古裸腹 , 置于密度大
约为 5000cells/ml微小亚历山大藻培养液中。摄食 2h、
18h和 24h 后, 用 20 μm 溞筛绢收集蒙古裸腹 , 用滤
纸吸干水分, 置于 7ml 离心管中, 加 2ml 0.05mol/L
乙酸溶液, 用超声波处理破碎组织, 12000r/min 离心
10min, 收集上清液, 取 1ml上清液, 加 100 μl三氯乙
酸的饱和溶液, 于 12000r/min 离心 12min, 收集上清
液, 即为 PSP毒素提取液, 置于 4℃保存备用。
1.4 菲律宾蛤仔染毒及组织中毒素提取
用海水清净菲律宾蛤仔表面的泥沙 , 置于密度
大约为 5000cells/ml 微小亚历山大藻培养液中, 分别
在摄食 2h、24 h、48 h及停食后 96 h各取样 40个菲
律宾蛤仔, 所有样品均保存于－20℃。将菲律宾蛤仔
解冻, 洗干净和称重后, 取出全部组织, 并将肌肉和
内脏团分开, 分别称取 2g置于 10 ml的离心管中, 加
入 3 ml 0.05 mol/L乙酸, 剪碎并研磨至匀浆, 沸水浴
10 min, 然后冷却并 6000 r/min离心 12 min, 取上清
液, 分别加三氯乙酸饱和溶液 300 μl于上清液中以去
除蛋白质, 然后 12000 r/min离心 12 min, 取上清液即
PSP毒素提取液, 置于 4℃保存, 直至上机分析。
称取 3 份 2g 无毒的肌肉匀浆液, 其中一份加入
GTX1,4和GTX2,3的标准品各 10 μl, 一份加入GTX1,4
和 GTX2,3的标准品各 40 μl, 一份作为空白对照。
1.5 膝沟藻毒素标准品处理与质谱参数优化及藻毒
素检测
1.5.1 膝沟藻毒素标准品处理与质谱参数 将膝
沟藻毒素标准品用水稀释成 GTX1,4浓度为 0.00564、
0.0282、0.282、2.82 μmol/L和 GTX2,3浓度为 0.00628、
0.0314、0.314、3.14 μmol/L的标准液, 在负离子模式
下进行 Q1(母离子)和 Product Ion(碎片离子)质谱扫
描。然后在 MRM(多反应监测 )扫描模式下优化
GTX1,4和 GTX2,3的质谱参数, 建立二者的定量方法。
GTX1,4 的离子通道 m/z 为 410.2/367.3 和 410.2/
349.1amu, GTX2,3为 394.0/351.0和 394.0/333.1amu。
1.5.2 样品膝沟藻毒素检测 藻毒素检测方法主
要参考李爱峰等(2007)方法。采用 API3000串联四极
杆质谱仪(美国 Applied Biosystems 公司); Shimadzu
液相色谱仪(LC 20AD输液泵, SCL 10A VP控制器,
DGU 20A脱气机, 日本岛津公司); CTC PAL自动进
样器(瑞士 CTC公司)。流动相：乙腈-水(各含 0.1%甲
酸) = 2︰98; 分析柱: Capcell Pak C18 (2.1×100 mm, 5
μm, 日本资生堂精细化工); 流速: 0.25 ml/min; 进样
量：10 μl。
2 结果
2.1 标准品 GTX1,4 与 GTX2,3液-质联用检测
采用负离子扫描以及碎片离子扫描标准品
GTX1,4 和 GTX2,3 的质谱结果表明, 可以采用负离子
扫描对膝沟藻毒素 GTX1,4与 GTX2,3进行定性定量检
测。
2.2 微小亚历山大藻细胞毒素含量快速分析
通过显微镜计数 , 培养的微小亚历山大藻细胞
浓度为 9330cells/ml。通过采用高效液相色谱-质谱分
析, 50ml微小亚历山大藻中, GTX1,4 和GTX2,3含量分
别为 1.08 和 0.48 μmol/L; 100ml 微小亚历山大藻中
90 海 洋 与 湖 沼 40卷
GTX1,4 和 GTX2,3含量分别为 2.03 和 0.92 μmol/L。
表明培养的微小亚历山大藻细胞毒素含量为
9.46fmol/cell。从微小亚历山大藻收集到高效液相色
谱-质谱检测出膝沟藻毒素全过程所需时间为 150min,
其中真空抽滤收集藻细胞大约需 30min, 用超声波细
胞破碎仪破碎藻细胞提取 GTX 粗毒素大约需要
60min, 高效液相色谱 -质谱联用检测 GTX 需要
60min。
2.3 蒙古裸腹溞摄食微小亚历山大藻后GTX的累积
溞蒙古裸腹 能摄食微小亚历山大藻 (陈桃英 ,
20061))。由图 1 可知, 在 24h 内, 随着摄食时间的延
长 , 溞蒙古裸腹 对微小亚历山大藻细胞中的膝沟藻
毒素 GTX1,4和 GTX2,3的累积量逐步增加, 且 GTX1,4
溞在蒙古裸腹 体内的积累量比 GTX2,3更高, 摄食 24h
后, GTX1,4 和 GTX2,3 累积量分别为 31.4968mg/g 和



图 1 溞蒙古裸腹 对微小亚历山大藻 GTX毒素的累积
Fig.1 The gonyautoxin content of M. mongolica exposed to A.
minutum for 2h, 18h and 24h
10.9026mg/g, GTX1,4的累积量是 GTX2,3的 2.89 倍。
溞从蒙古裸腹 收集到高效液相色谱-质谱检测出膝沟
藻毒素全过程所需时间为 150min, 其中收集染毒的
溞蒙古裸腹 大约需 30min, 用超声波细胞破碎仪破碎
藻细胞提取 GTX 粗毒素大约需 60min, 高效液相色
谱-质谱联用检测毒素需 60min。
2.4 菲律宾蛤仔摄食微小亚历山大藻后GTX的累积
菲律宾蛤仔能摄食微小亚历山大藻 , 从其粪便
团中可见大量聚集成团、没被很好消化的微小亚历山
大藻细胞(图 2)。菲律宾蛤仔肌肉累积微小亚历山大
藻的膝沟藻毒素结果见图 3。由图 3 可知, 菲律宾蛤
仔对微小亚历山大藻毒素有很强的累积能力。摄食
2h后, 肌肉中已经开始累积GTX毒素, 在 48h内, 随
着摄食时间延长, GTX1,4和GTX2,3毒素在肌肉中含量
逐步增加, 并且 GTX2,3 在菲律宾蛤仔组织中累积量
高于 GTX1,4, 且内脏团毒素积累量比肌肉更高, 其中
在 48 h后, 肌肉中 GTX1,4和 GTX2,3毒素含量分别为
4.6906 μg/g和 9.1476 μg/g, GTX2,3毒素含量是 GTX1,4
的 1.95 倍; 而内脏团中 GTX1,4和 GTX2,3毒素含量分
别为 5.5064 μg/g和 13.068 μg/g, GTX2,3毒素含量是
GTX1,4的 2.37倍。在停食净水培养 96h后, 在内脏团
和肌肉中均不能检测到 GTX1,4, 而 GTX2,3 仅稍微降
低 , 表明菲律宾蛤仔停食 96h 后肌肉和内脏团对
GTX1,4 的消解率达到 100%, 而肌肉和内脏团对
GTX2,3的消解率分别为 21.4%和 40%。
从收集染毒菲律宾蛤仔到高效液相色谱-质谱检



图 2 菲律宾蛤仔对微小亚历山大藻的摄食
Fig.2 Feeding of R. philippinarum on A. minutum
注：比例尺 = 500 μm。右图表示菲律宾蛤仔摄食微小亚历山大藻, 左图表示粪便团中未被消化的微小亚历山大藻
____________________________
1) 陈桃英, 2006. 溞亚历山大藻对海产贝类胚胎和蒙古裸腹 的影响及致毒机制研究. 中国科学院海洋研究所博士学
位论文, 67
1期 陈桃英等: 膝沟藻毒素液质联用快速检测及其在海洋生物体内的累积 91


图 3 菲律宾蛤仔对微小亚历山大藻毒素含量的累积
Fig.3 The gonyautoxin content of R. philippinarum exposed to
A. minutum for 2h, 24h, 48h and starve for 96h

测出膝沟藻毒素 , 全过程所需时间大约为 240min,
其中 , 分离菲律宾蛤仔肌肉和内脏团组织需要
60min(50 只贝/人), 组织均浆需 30min, 粗毒素提取
需 90min, 高效液相色谱 -质谱联用检测毒素需
60min。
3 讨论
3.1 液相色谱-质谱联用技术对海洋生物毒素的检测
目前已有文献报道了应用液 -质联用技术分析
PSP 毒素, 如 Jaime 等(2001)通过使用离子交换色谱
与电喷雾离子化质谱联用定量分析 PSP 毒素 ,
Dell’Aversano 等(2005)采用此方法一次性同步分析
PSP 毒素中的所有衍生物。采用液-质联用技术除对
PSP 毒素进行分析外, 对河豚毒素(TTX)、腹泻性贝
毒(DSP)、记忆缺失性贝毒(ASP)、神经性贝毒(NSP)、
西家鱼毒(CFP)以及 AZP、YTX毒素、PTX毒素等毒
素都进行了比较系统的分析 , 在新型海洋生物毒素
的发现、结构鉴定等方面, 液-质联用技术也发挥着非
常重要的作用(Oikawa et al, 2002; Tsuruda et al, 2002;
Vale et al, 2008a, b; Fonfría et al, 2008)。由于 PSP毒
素极性强, 成分复杂, 异构体化合物较多, 对色谱分
离条件要求苛刻, 这方面的应用分析发展比较缓慢。
在本文中, 作者对此进行了初步尝试, 发现采用高效
液相色谱-质谱联用能对微小亚历山大藻、蒙古裸腹
溞和菲律宾蛤仔组织中的膝沟藻毒素都能进行分析,
这可以减少标准品的使用 , 对保障水产品的食用安
全、水产养殖业的健康发展都非常有意义。
3.2 微小亚历山大藻的膝沟藻毒素含量以及在生物
体内的积累与消解
张清春等(2005)在试验中通过高效液相色谱检
测, 测得微小亚历山大藻每个细胞毒素含量在 3.57—
18.64fmol之间, 本文中所测得的含量为 9.46fmol/cell,
这一毒素含量在上述范围之内 , 表明试验结果是可
靠的。本文中发现, 在微小亚历山大藻中, GTX1,4 的
含量约为 GTX2,3含量的 2.3倍, 溞而在蒙古裸腹 组织
中, GTX1,4的含量约为 GTX2,3含量的 3倍, 表明蒙古
溞裸腹 对 GTX1,4 有较强的累积能力。贝类能储存毒
素达好几个月 , 但毒素组成在其排毒阶段会发生显
著的变化, 其中一个最显著的变化就是 GTX1,4 的减
少(傅萌等, 2000)。菲律宾蛤仔摄食微小亚历山大藻
后, 从图 3 可以看出, 在肌肉和内脏团中, GTX2,3的
含量比 GTX1,4 要高很多, 表明菲律宾蛤仔对 GTX2,3
有较强的累积能力。江天久等(2006)发现中国龙虾
(Panulirus stimpsoni)对 GTX2,3也有较强的累积能力,
他们认为是发生了 GTX2,3向 GTX1,4转换的过程, 因
为这种还原转化在双壳类和甲壳类的动态代谢中常
有发生(Oikawa et al, 2005)。据报道, PSP沿着食物链
向高营养级传递时, 更易发生这类还原反应(Oikawa
et al, 2002, 2005)。关于这一现象, 研究者们认为这可
能是发生了 GTX1,4还原成 GTX2,3的过程, 这可能与
生物体内的天然还原剂如谷胱甘肽和半胱氨酸诱导
的化学转化或细菌诱导的生物转化有关(江天久等 ,
2006; 傅萌等, 2000; Oikawa et al, 2002)。至于蒙古裸
溞腹 在累积藻类毒素的过程中 , 并没有出现与贝类
和甲壳类相似的情况 , 这可能是不同生物对有害赤
潮不同的响应所导致的, 但究竟是何种机理, 有待进
一步的研究。
目前有关加速贝类体内 PSP毒素排出的方法有：
将贝类转移至清洁水中使其自净, 温度刺激法, 臭氧
法、烹饪法、罐头加工以及盐度刺激法、电刺激法等
(Lawrence et al, 1994; 傅萌等, 2000)。本文中作者将
摄食微小亚历山大藻 48h 的菲律宾蛤仔停食净水净
化 96h 后, 肌肉和内脏团中 GTX1,4都降为 0, GTX2,3
也有一定程度的下降 , 这表明将菲律宾蛤仔转移至
清洁水体中可较快的降解掉 GTX1,4。但这种方法需要
将贝类大量转移, 这是一件劳动强度大、耗资也大的
工作, 因此采用这种方法净化藻毒素需要酌情考虑。
3.3 色谱法对膝沟藻毒素(GTX)的检测时间
在水产品的藻毒素检测中 , 检测时间是例行监

92 海 洋 与 湖 沼 40卷
测中的重要指标。本文中应用高效液相色谱-质谱联
用检测技术 , 从赤潮藻体和枝角类中检测出膝沟藻
毒素全过程需要 1.5h, 从贝类中检测出藻毒素全过程
需要 4h。本文中从生物体中提取膝沟藻毒素的方法
主要参考张清春等(2005)所在实验室采用高效液相色
谱分析 PSP方法, 因此采用高效液相色谱法分析膝沟
藻毒素和采用高效液相色谱-质谱联用分析膝沟藻毒
素所需要的时间相近 , 但高效液相色谱法一直需要
膝沟藻毒素的标准品, 目前标准品的获取相当困难,
且价钱不菲, 而高效液相色谱-质谱联用对标准品使
用量很少, 因此, 本方法更具有实际应用价值。
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1期 陈桃英等: 膝沟藻毒素液质联用快速检测及其在海洋生物体内的累积 93
GONYAUTOXIN: HPLC-MS DETECTION AND ACCUMULATION IN MARINE
ORGANISMS
CHEN Tao-Ying1, LIU Jun-Xiu1, LI Shui-Jun2, LIU Li-Ping1, HE Pei-Min1
(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai, 201306;
2. Central Laboratory, Shanghai Xuhui Central Hospital, Shanghai, 200031)
Abstract The gonyautoxins (GTX, including GTX1,4 and GTX2,3) in Alexandrium minutum, Moina mongolica Daday,
and Ruditapes philippinarum, which fed with A. minutum, were analyzed by HPLC-MS (High Performance Liquid Chro-
matography coupled with Mass Spectrometry). The results showed that the GTX content in these species could be detected
with HPLC-MS. The GTX content per cell in A. minutum was 9.46fmol. In M. mongolica fed with A. minutum for 2h, 18h
and 24h, GTX1,4 content was 4.8908, 12.6241, 31.4968mg/g, and GTX2,3 content at 1.656, 3.8533, 10.9026 mg/g, respec-
tively, which indicates that GTX content in M. mongolica increased with the exposure time to A. minutum, and GTX2,3 was
2.89 times of GTX1,4 content. In R. philippinarum fed with A. minutum for 2h, 24h, and 48h, the GTX1,4 content in muscles
was 3.1271, 3.6709, and 4.6906 μg/g, GTX2,3 content at 7.1874, 8.1675 and 9.1476 μg/g, and GTX1,4 content in viscera was
4.7088, 4.2178 and 5.5064 μg/g, respectively, indicating that the GTX content in R. philippinarum increased with the ex-
posure time to A. minutum, and GTX2,3 was accumulated more than GTX1,4; and GTX content in viscera was greater than
that in mussel: the GTX2,3 content in muscles in 48h was 1.95 times of that GTX1,4, and the GTX2,3 content in viscera was
2.37 times of that GTX1,4. After animals were starved for 96h, the GTX1,4 content in muscles and viscera reduced to 0, and
GTX2,3 content reduced by 16.1% and 45%, respectively. The results indicate that HPLC-MS can be used to detect rapidly
the GTX in alga, zooplankton, and shellfish. The accumulation of GTX was different in higher trophic-level organisms.
Key words HPLC-MS, Alexandrium minutum, Moina mongolica, Ruditapes philippinarum, Gonyautoxin, Accumulation