全 文 ：膝沟藻毒素 Gonyautoxins的分离纯化
缪宇平1 , 周宏农2 , 闻　韧1＊
(1.复旦大学 药学院 , 上海 200032;2.台湾大学 理学院 , 台北 10617)
摘要:目的　从微小亚历山大藻(Alexandrium mimutum Halim)Amtk 2 中分离纯化膝沟藻毒素 gonyautoxins。方法
用凝胶色谱 、离子交换色谱等方法从人工培养的微小亚历山大藻Amtk 2 酸酒精萃取物中分离纯化膝沟藻毒素。 结
果　从 100 L Amtk 2 培养液中获得(6.74±0.31)×109 个藻细胞 ,其酸酒精萃取物经凝胶色谱分离首次在国内得到膝
沟藻毒素GTX-4 ,GTX-1 , GTX-3 和 GTX-2 混合物(29.59±0.28)mg 。从此混合物中取出 4.06 mg 经两次离子交换色谱
纯化得到纯GTX-4(0.40±0.002)mg , GTX-1(5.95±0.03)×10 -2 mg , GTX-3(6.92±0.05)×10 -4 mg 和 GTX-2(0.11±
0.005)mg。结论　人工培养的微小亚历山大藻Amtk 2 酸酒精萃取物通过凝胶色谱和两次离子交换色谱分离能够得
到纯的膝沟藻毒素GTX-4 , GTX-1 , GTX-3 和 GTX-2。
关键词:微小亚历山大藻;膝沟藻毒素;凝胶色谱;离子交换色谱
中图分类号:R284.1;R284.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513-4870(2004)01-0052-04
Isolation and purification of gonyautoxins from
Alexandrium mimutum Halim
MIAO Yu-ping1 , ZHOU Hong-nong2 , WEN Ren1＊
(1 .School of Pharmacy , Fu Dan University , Shanghai 200032 , China;
2 .Institute of Fisheries Science , National Taiwan University , Taibei 10167 , China)
Abstract:Aim　To isolate and purify gonyautoxins from Alexandrium mimutum Halim Amtk2 strain.
Methods　The ethanol extracts of culture Alexandriun minutum Halim Amtk2 were isolated by means of gel
filtration chromatography , the toxin fraction obtained was then purified by ion exchange chromatography.Results
From 100 liter of cultivation liquid of Alexandrium mimutum Halim Amtk2 (6.74±0.31)×109 cells were
obtained.The ethanol extracts of Alexandriun minutum Halim purified by gel filtration chromatography obtained
gonyautoxins mixture 29.59 mg.4.06 mg of the mixture was further purified by two steps of ion exchange
chromatography , and obtained pure GTX-4 (0.40±0.002)mg , GTX-1(5.95±0.03)×10-2 mg , GTX-3
(6.92±0.05)×10-4mg and GTX-2(0.11±0.005)mg.Conclusion　Pure gonyautoxins can be obtained by
means of gel filtration chromatography and ion exchange chromatography from ethanol extracts of cultured
Alexandriun minutum Halim Amtk2 strain.
Key words:Alexandrium mimutum Halim;gonyautoxins;gel filtration chromatography ;ion exchange
chromatography
收稿日期:2003-03-18.
＊通讯作者　Tel:86-21-54237560 , E-mail:rwen@shmu.edu.cn
　　麻痹性贝毒(paralytic shellfish poisons ,PSP)是一
种神经性毒素 ,因为人们食用含有此类毒素的贝类
而产生麻痹性的中毒现象 ,故称之为麻痹性贝毒 。
该类毒素为一种水溶性的含双胍基的三环生物碱 ,
至今已陆续从含毒藻类和含毒贝类中分离出了 20
余种结构类 似的不同化 合物。膝 沟藻毒素
gonyautoxins(GTXs)是其中的一类 ,结构见图 1[ 1] 。
·52· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2004 , 39(1):52-55
DOI :10.16438/j.0513-4870.2004.01.012
Figure 1　Structure of gonyautoxins
　　膝沟藻毒素 gonyautoxins 是特异性钠离子通道
阻断剂 ,当它与钠离子通道结合后 ,将会使神经传导
发生困难 ,对人的中枢与周围神经系统产生麻痹作
用。与河豚毒素类似 ,膝沟藻毒素是生理学 、药理学
中广泛应用的一种重要工具药 ,而且它还具有高效
的镇痛 、局麻及解痉等作用 ,也可作为新药研究的先
导化合物[ 1] 。
　　由于膝沟藻毒素结构较复杂 ,其全合成至今尚
未成功。微小亚历山大藻个体极小 ,散布在水体中 ,
很难直接从天然资源中分离纯化毒素 。而且 ,不同
的藻株产毒特性也不同 ,有的产毒 ,有的不产毒 ,产
毒的不同藻株中所含 GTXs 4种组分的比例也常会
不同。目前 ,国外主要是通过人工培养含毒微小亚
历山大藻 ,从中分离纯化毒素 ,国内尚未见到有关该
毒素分离纯化方面的文献报道 。本文以新分离得到
的微小亚历山大藻(Alexandrium mimutum Halim)
Amtk2藻株为研究对象 ,通过人工培养得到藻细胞 ,
从中分离纯化膝沟藻毒素以供新药研究之用 。
材料与方法
仪器与试剂　HPLC系统为日本 Hitachi公司的
产品 ,包括 L-6000高压泵 ,F-1000萤光检测器 ,自动
进样器;Hitachi L-4200紫外-可见光检测器等 。膝沟
藻毒素标准品由加拿大国家海洋研究所提供 ,标准品
的浓度为GTX-1 6.55μmol·L-1 ;GTX-2 1.52 μmol·L-1;
GTX-3 0.52μmol·L-1;GTX-4 1.71μmol·L-1 。稀释成 5
个不同的浓度 ,绘制标准曲线。色谱用的树脂 Bio-gel
P-2(400 mesh)与 Bio-Rex 70(400 mesh)均为 Bio-Rad
(USA)的产品 。庚基硫酸钠为 Fisons (England)产
品 ,过碘酸为 Fluka (Switzerland)超纯级试剂 ,氯仿 、
甲醇 、正己烷均为 Lab-Scan(Ireland)HPLC级溶剂 。
高效液相色谱系统　高效液相色谱系统参考
Oshima 的柱后衍生化离子对反相色谱法并经改进
而来[ 2] 。色谱柱为Alletch(USA)Econosil C18 4.6 mm
(ID)×250 mm 。以 2 mmol·L-1庚基硫酸钠为阳离子
对洗脱液 ,以 10 mmol·L-1磷酸胺为缓冲系统 ,流速
为 0.8 mL·min-1 。柱后衍生系统包括氧化剂和酸化
剂两种 , 氧化剂为 0.05 mol·L-1 过碘酸 , 以 50
mmol·L-1 K2HPO4 溶液为缓冲系统 , 流速为 0.25
mL·min-1 ;酸化剂为 0.5 mol·L-1醋酸溶液 ,流速为
0.25 mL·min-1 。样品用自动进样器进样 ,荧光检测
器检测 ,荧光检测器激发光(Ex.)波长为 336 nm 、发
射光(Em.)波长为 390 nm 。采用面积归一法定量 。
微小亚历山大藻 Alexandrium minutum Halim
的培养 　本研究所使用的微小亚历山大藻
Alexandrium minutum Halim藻株编号为Amtk2。藻种
由台湾大学周宏农教授实验室分离得到。所用的培
养液为K培养液[ 3] ,经高温高压(121 ℃,20 min)灭
菌 ,待冷却后接种。于温度 24±2 ℃,照度2 000 ～
4 000 lux ,光周期 10 L·14 d 的条件下培养 。定期以
血球记数器进行藻细胞记数。每周分植一次 ,以获
得生长力旺盛的微小亚历山大藻 。
膝沟藻毒素的萃取　微小亚历山大藻培养液用
玻璃棉柱子(6 cm ID×30 cm)滤取藻细胞后 ,以95%
的酸酒精溶液(pH 2)萃取 30 ～ 60 min 。萃取液去盐
去脂后 ,置于-20 ℃下保存。
Bio-Gel P2 凝胶色谱分离膝沟藻毒素　参考
Laycock , et al .的凝胶色谱分离法[ 4] 。色谱柱选用
2.6 cm (ID)×30 cm , 填充物为 Bio-Gel P2 (400
mesh)。取干重45 g Bio-Gel P2胶体粉末浸泡于去离
子水中 ,使其充分浸润膨胀 ,脱气后充填。然后以去
离子水预洗 10 h ,流速 1mL·min-1 。取毒藻萃取物 ,
以少量去离子水溶解后上样 ,先以 400 mL去离子水
洗脱 ,流速 0.9 mL·min-1 ,随后改用 0.1 mol·L-1醋
酸溶液洗脱 ,洗脱液以分液收集器收集 ,每 15 min
收集一管 ,所收集的分液先用荧光点检验法检测[ 5] ,
有荧光反应的分液再用HPLC法检测。收集含毒分
液减压浓缩后用离子交换色谱进一步纯化 。
Bio-Rex离子交换色谱纯化膝沟藻毒素　参考
Laycock , et al .的离子交换色谱法[ 4] 。色谱柱选用
2.5 cm(ID)×20 cm ,填充物为阳离子交换树脂 Bio-
Rex 70(400 mesh)。取 Bio-Rex 70树脂 30 g ,浸泡于
180 mL去离子水中 ,以 12 mol·L-1浓盐酸滴定至 pH
1 ,脱气后填充于柱子中 ,然后以去离子水预洗至 pH
值稳定后上样 。用醋酸溶液梯度洗脱 ,醋酸溶液浓
度 120 min 内从 0变到 0.025 mol·L-1 ,每分钟收集
一管 ,用 Hitachi L-4200 紫外-可见光检测器在线检
测 ,检测波长 UV 235 nm ,同时配合高效液相色谱法
分析。收集纯的 GTX-4 ,-1 ,-3 ,-2 分液 , 保存于
·53·缪宇平等:膝沟藻毒素Gonyautoxins的分离纯化
-25 ℃冰箱中。
结果与讨论
1　膝沟藻毒素的定性定量分析鉴定
从100 L微小亚历山大藻 Amtk2培养液中共获
得(6.74±0.31)×109个藻细胞 ,以酸酒精萃取后经
去盐去脂处理得到粗萃物0.797 8 g 。取少量粗萃物
进行麻痹性贝毒的小白鼠生物检验[ 6] ,小白鼠出现
典型的麻痹性贝毒的中毒症状 。以高效液相色谱法
作定性定量分析 , GTX-4 ,GTX-1 ,GTX-3 和 GTX-2 的
保留时间分别为9.2min ,11.3 min , 15.8min和 20.5
min ,与标准品的保留时间一致 。由此可知 ,粗萃液
所含的毒素为膝沟藻毒素 。经定量分析 ,粗萃液中
含GTX-4(4.97±0.03)mg ,GTX-1(14.62±0.08)mg ,
GTX-3(5.71±0.06)mg 和GTX-2(6.94±0.05)mg 。
2　毒藻粗萃液的凝胶色谱分离
毒藻粗萃液用凝胶色谱分离 ,第 1 ～ 32 管分液
为水洗部份 ,从第 33 管分液开始改用 0.1 mol·L-1
的醋酸洗脱。所收集的分液做荧光点检验。水洗部
分第 12 ～ 15 ,19 ～ 25管有荧光反应 ,酸洗部份 41 ～
45管分液有荧光反应。有荧光反应的分液经高效
液相色谱分析 ,第 12 ～ 15 , 19 ～ 25中不含 GTXs ,第
41 ～ 45 管有 GTXs 检出 ,为 GTX-4 , GTX-1 , GTX-3 ,
GTX-2的混合物 。再取第 39 , 40 ,46管经 HPLC法分
析发现只有第 40管有微量毒素检出。由此可见 ,含
毒分液集中在第 40 ～ 45 管 ,合并这 6 管含毒分液 。
用HPLC法定量 ,结果含膝沟藻毒素(29.59±0.28)
mg ,其中GTX-4 ,GTX-1 ,GTX-3 ,GTX-2的含量分别为
(4.32±0.02)mg ,(13.87±0.05)mg ,(4.97±0.03)
mg ,(6.43±0.04)mg ,回收率为 91.78%。文献[ 4] 用
0.03 mol·L-1的醋酸溶液洗脱 ,不能将含毒分液集中
在少数几管中 ,毒素浓度低荧光反应弱 ,很难快速判
断含毒分液。作者经多次摸索后 ,改用 0.1 mol·L-1
的醋酸溶液洗脱 ,可将含毒分液集中在少数几管中 ,
毒素浓度提高增强了荧光反应 ,可以迅速简便的找
到含毒分液 ,简化了处理过程 。
3　含毒分液的离子交换色谱法分离
从经 Bio-Gel P2分离的含毒分液中取出 4.06
mg ,用 Bio-Rad 70进一步分离。从第 35管开始有毒
素被冲出 ,第 35 ～ 45 管只含单独 GTX-4 ,第 46 ～ 70
管分液 ,含 GTX-4 ,GTX-1 ,以 GTX-4为主要毒素 ,合
并后标为样品 1#,GTX-4毒素的最高峰出现在第
65 min;第 71 ～ 75管分液只含单独 GTX-1;第 76 ～ 80
管分液 ,含 GTX-1 ,GTX-3 ,以 GTX-3为主要毒素 ,合
并后标为样品2#,第 81管分液只含单独的 GTX-3;
第 82 ～ 93管分液 ,含 GTX-3 ,GTX-2 ,合并后标为样
品 3#,以GTX-2为主要毒素 ,GTX-2毒素的最高峰
出现在第90 min;93 ～ 96管只含单独 GTX-2。
将第一次离子交换色谱分离得到的样品 1#, 2
#,3#减压浓缩后进行第 2次离子交换色谱 ,结果
成功地得到较多的单一毒素 。合并两次分离得到的
纯的毒素 ,用 HPLC 定量后分别得到 GTX-4(0.40±
0.002)mg , GTX-1(5.95 ±0.03)×10-2 mg , GTX-3
(6.92±0.05)×10-4 mg , GTX-2(0.11±0.005)mg 。
分离得到的纯毒的 HPLC图谱如图 2所示 。文献[ 4]
没有用梯度洗脱 ,分离效果不好 。作者经反复摸索 ,
采用醋酸溶液梯度洗脱 ,取得了良好的分离效果 。
Figure 2　HPLC chromatogram of gonyautoxins prepared
　　由以上实验可知 ,通过人工培养微小亚历山大
藻(Alexandrium mimutum Halim)Amtk2来制备膝沟藻
毒素是可行的。新分离得到的藻株Amtk2毒素含量
约为文献[ 4] 报道的 10倍 。该法先用凝胶色谱分离
将毒藻粗萃液中的大部分杂质除去 ,然后再用两次
·54· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2004 , 39(1):52-55
离子交换色谱分离 ,可以得到纯的膝沟藻毒素GTX-
4 ,GTX-1 ,GTX-3和GTX-2 ,有较强的实用性 。
致谢:加拿大国家海洋研究所和日本东北大学贝毒监
测国家参考实验室对本文分离的 Gonyautoxins 进行定量校
正。
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