全 文 ：2014 第十六卷 第十一期 ★Vol.16 No.11
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2014-11-05
修回日期：2014-11-15
＊ 科学技术部国家重大新药创制专项（2014ZX09304307001-021）：中药新药安全性检测技术与标准研究-中药原料药混伪品分子基因鉴定
技术与标准，负责人：胡志刚；国家自然科学基金委重点项目（81130069）：道地药材形成的生物学实质，负责人：陈士林。
＊＊ 通讯作者：张秀桥，教授，博士生导师，主要研究方向：中药的品种、质量及资源开发研究；胡志刚，博士，副教授，主要研究方向：中药资源
与分子鉴定。
ITS2序列鉴定“功劳叶”药材及其近缘混伪品＊
夏 叶 1，周 红 2，向 丽 3，张秀桥 1＊＊，胡志刚 1, 3＊＊
（1. 湖北中医药大学药学院 武汉 430065；
2. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所 北京 100193；
3. 中国中医科学院中药研究所 北京 100700）
摘 要：目的：中药材同名异物现象对临床安全用药造成了潜在的威胁。本研究对两种“功劳叶”药材
及其近缘混伪品进行分子鉴定，以确保临床准确用药。方法：本实验收集枸骨、阔叶十大功劳和细叶十大
功劳及其近缘混伪品共 9 个物种 45 份实验样品，用改良的 CTAB 法提取总 DNA，扩增 ITS2 序列并双向
测序，采用 CondonCode Aligner V 4.2.4 对测序峰图进行拼接，应用 MEGA 6.0 进行序列变异分析，计算种
内种间 Kimura 2-Parameter（K2P）遗传距离，构建系统邻接（NJ）树。结果：基于 ITS2 序列的序列变异、最近
距离法和系统邻接树分析结果均表明，冬青属枸骨以及十大功劳属阔叶十大功劳和细叶十大功劳均能与
其混伪品很好地区分开。结论：ITS2 序列可有效区分两种“功劳叶”药材及其近缘混伪品，为临床准确用
药提供依据。
关键词：枸骨叶 功劳叶 ITS2 序列 分子鉴定 近缘混伪品
doi: 10.11842/wst.2014.11.013 中图分类号：R284.1 文献标识码：A
中国幅员辽阔，中药材种类繁多，长期以来都
存在着严重的同名异物现象，以致中药品种混淆、
用药错乱，对临床安全用药造成了极大威胁[1]。“功
劳叶”是一种典型的同名异物中药材，临床所用
“功劳叶”既有冬青科植物枸骨 Ilex cornuta Lindl.
et Paxt. 的干燥叶，也有小檗科植物阔叶十大功劳
Mahonia bealei（Fort.）Carr.、细叶十大功劳 Mahonia
fortunei （Lindl .） Fedde 和华南十大功劳 Mahonia
japonica（Thunb.）DC.的干燥叶 [2]，二者都以“功劳叶”
为别名或正名收载于古今本草著作中 [3]。据 2010 版
《中国药典》记载，冬青科植物枸骨 I.cornuta 的干燥
叶为枸骨叶 [ 4 ]，小檗科植物阔叶十大功劳 M.Bealei
和细叶十大功劳 M.Fortunei 的干燥茎为功劳木 [4]，
未收载功劳叶。但许多地区仍沿用古籍记载，在临
床上将它们作为“功劳叶”入药，于是造成了两种
“功劳叶”严重混用的乱象。然而，二者化学成分不
同，临床疗效也不同 [5，6]，在实际应用中应区别对待，
以消除临床安全隐患。一直以来，不少学者试图区
分这两种“功劳叶”，但方法多限于性状、理化及显
微鉴别等方面 [7-10]，在以上物种及其近缘混伪品鉴
定方面存在着一定的局限性。
随着 DNA 条形码（DNA barcoding）分子鉴定技
术的迅速发展，越来越多的实例证明，它与传统的
鉴定方法相比，更具特异性，更稳定且简单有效，非
常适合区分药材、近缘种及其混伪品 [11]。DNA 条形
码技术是利用基因组中一段公认的、相对较短的
DNA 片段来进行物种鉴定的分子生物学技术，具有
快速准确、简单有效的特点，是传统生物鉴定方法
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种名 拉丁名 来源 Genbank 登录号
枸骨 Ilex cornuta 河北安国、安徽宣城、湖南长沙、湖北武汉、北京药店
KP056792-KP056795，KP072056，
KP072061，KP072064-KP072067
Genbank EF690541-EF690543，GQ434382-GQ434384
刺叶冬青 Ilex bioritsensis 湖北恩施、神农架 KP056783-KP056791
Genbank FJ394662
猫儿刺 Ilex pernyi 湖北恩施、神农架 KP056796-KP056801
Genbank KF113870
阔叶十大功劳 Mahonia bealei 湖北武汉、神农架 KP056802-KP056806
细叶十大功劳 Mahonia fortunei 湖北武汉、神农架 KP056811-KP056815
华南十大功劳
细柄十大功劳
鄂西十大功劳
峨眉十大功劳
Mahonia japonica
Mahonia gracilipes
Mahonia decipiens
Mahonia polydonta
Genbank
Genbank
湖北恩施
湖北恩施
湖北神农架
Genbank
AY383476，GQ434795，GQ434796，FJ980428
AY383468
KP056817-KP056819
KP056807-KP056810
KP056820，KP056821
AY383464
表 1 两种“功劳叶”药材及其近缘混伪品 ITS2 序列信息
的有效补充 [12，13]。在中药 DNA 条形码筛选确定的过
程中，先后有研究者提出了不同的序列组合 [14，15]，其
中，Chen S L 等 [16]提出将 ITS2 序列作为药用植物鉴
定标准 DNA 条形码序列得到了广泛认可 [17]。据文献
报道，ITS2 序列对葶苈子 [18]、牡丹皮 [19]、金沸草 [20]、桃
仁 [21]等药材及其混伪品皆能起到很好的鉴定作用。
为了更好地将本草记载“功劳叶”药材的主要来源
枸骨 I.cornuta、阔叶十大功劳 M.Bealei 和细叶十大
功劳 M.Fortunei 等物种区分开，本研究利用 ITS2 序
列鉴定“功劳叶”药材及其近缘混伪品，以期为临床
安全、准确用药提供依据。
1 材料
本实验收集冬青属 3 个物种 25 份样品，以及十
大功劳属 6 个物种 20 份样品，经湖北中医药大学
生药教研室张秀桥教授鉴定，另从 Genbank 中下载
14 条序列，植物材料来源及 Genbank 登录号详见
表1。
2 方法
2.1 DNA 提取、PCR 扩增及测序
分别取实验材料的干燥叶片 30 mg，用球磨仪
（Retsch MM400，Germany）研磨 3 min（28 次/s），然
后用改良的 CTAB 法 [22]提取植物总 DNA。采用通用
引物、PCR 反应条件及扩增程序 [23]对样品总 DNA 进
行 ITS2 序列扩增，琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增
情况。应用 ABI 3730XL 测序仪（Applied Biosystems
Co.，USA）对条带单一且清晰的 PCR 产物进行双向
测序。
2.2 数据分析
应用 CondonCode Aligner V 4.2.4（CondonCode
Co，USA）软件对测序峰图进行校对拼接，基于隐马
尔可夫模型的 HMMer 注释方法去除两端 5.8S 和
28S 区段，获得 ITS2 间隔区序列 [ 24 ]。利用 MEGA
（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）6.0 进行序
列比对分析 [25]，计算种内、种间 Kimura 2-Parameter
（K2P）遗传距离，构建系统邻接（Neighbor Joining，
NJ）树 [26]。
3 结果与分析
3.1 “功劳叶”药材及其近缘混伪品序列变异分析
枸骨 ITS2 序列共 16 条，序列长度均为 235 bp，
只在 33 bp 处有 1 个变异位点（C-T 变异）；冬青属
3 个物种共 33 条 ITS2 序列，序列长度均为 235 bp，
共产生 8 个变异位点。
阔叶十大功劳和细叶十大功劳 ITS2 序列分别
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为 10 条和 5 条，序列长度均为 223 bp，两个物种种
内 ITS2 序列相同；十大功劳属 6 个物种共 26 条
ITS2 序列，序列长度均为 223 bp，共产生 13 个变异
位点。
3.2 “功劳叶”药材及其近缘混伪品遗传距离分析
基于 ITS2 序列的遗传距离分析结果表明，枸骨
种内最大 K2P 距离为 0.004，平均 K2P 距离为
0.001；枸骨与混伪品种间最小 K2P 距离为 0.026，
平均 K2P 距离为 0.234。
阔叶十大功劳和细叶十大功劳种内最大 K2P
距离均为 0；阔叶十大功劳与混伪品种间最小 K2P
距离为 0.005，平均 K2P 距离为 0.238；细叶十大功
劳与混伪品种间最小 K2P 距离为 0.023，平均 K2P
距离为 0.262。十大功劳属其他物种华南十大功劳、
细柄十大功劳、鄂西十大功劳、峨眉十大功劳种内
以及与其他物种种间 K2P 遗传距离见表 2。
3.3 “功劳叶”药材及其近缘混伪品 NJ 树鉴定
基于 ITS2 序列构建两种“功劳叶”药材及其近
缘混伪品系统 NJ 树（见图 1）。从所构建的 NJ 树可
以看出，冬青属和十大功劳属分别聚为两大支；冬
青属枸骨单独聚为一支；十大功劳属 6 个物种各自
聚为一支。枸骨、阔叶十大功劳和细叶十大功劳均
能与其近缘混伪品很好地区分开。
4 讨论
4.1 总 DNA 提取方法的选择
常用的植物总 DNA 提取方法为使用试剂盒提
取，具有快速、方便、避免有机溶剂污染等优点，但
是成本偏高；且根据曹琳等 [27]的研究，试剂盒通常
仅适合新鲜的植物叶和动物肌肉类 DNA 的微量提
取，对 DNA 降解严重的中药材并不适用。本研究采
用改良的 CTAB 法提取 45 份（包括药材和新鲜植
物）实验样品总 DNA，PCR 成功率达 100%，测序峰
图质量好，表明 CTAB 法经过改良既能提取新鲜植
物的 DNA，对中药材 DNA 的提取同样适用；在保障
实验结果准确性的同时，节约了实验成本。
4.2 两种“功劳叶”药材与其近缘混伪品的鉴定
通过对 ITS2 序列变异分析可以看出，枸骨、阔
叶十大功劳和细叶十大功劳各物种遗传信息均较
稳定，枸骨种内仅有一个变异位点，而阔叶十大功
劳和细叶十大功劳种内未产生变异位点。3 者种内
最大 K2P 距离均远小于其与混伪品的种间最小
K2P距离。NJ树结果也表明枸骨能独立分为一支，阔
叶十大功劳和细叶十大功劳各自分为一支，均能与
混伪品很好地区分开。与枸骨同为冬青属的猫儿刺
和刺叶冬青因都只在 218 bp 处存在一个不稳定的
变异位点，导致建树结果比较混乱，二者难以区分。
4.3 ITS2 序列在十大功劳属物种中的鉴别能力
通过对遗传距离的分析，十大功劳属 6 个物种
的种内最大 K2P 距离均远小于与其他物种种间最
小 K2P 距离；从系统邻接树结果可知，该属 6 个物
种各自聚为一支。以上结果表明，ITS2 序列不仅可
以把阔叶十大功劳和细叶十大功劳与其近缘混伪
品准确区分开，也能很好地鉴定本文收载的该属其
它物种。基于以上分析，ITS2 序列在十大功劳属物
种分子鉴定中具备较大潜力。
5 结论
中药同名异物现象直接影响着中药质量及临床
用药安全，是目前中药领域亟待解决的一个难题。
本研究采用改良的 CTAB 法成功提取 45 份实验样
品总 DNA，在保证实验质量的同时，降低了实验成
类别 K2P 遗传距离（平均） 类别 K2P 遗传距离（平均）
枸骨 0-0.004（0.001） 枸骨与混伪品种间 0.026-0.383（0.234）
细叶十大功劳种内 0（0） 细叶十大功劳与混伪品种间 0.023-0.386（0.262）
阔叶十大功劳种内 0（0） 阔叶十大功劳与混伪品种间 0.005-0.383（0.238）
华南十大功劳种内 0（0） 华南十大功劳与其它物种种间 0.005-0.374（0.222）
细柄十大功劳种内 0（0） 细柄十大功劳与其它物种种间 0.005-0.373（0.223）
鄂西十大功劳种内 0（0） 鄂西十大功劳与其它物种种间 0.014-0.391（0.243）
峨眉十大功劳种内 0-0.005（0.003） 峨眉十大功劳与其它物种种间 0.023-0.401（0.240）
表 2 各物种种内及其与混伪品种间 K2P 遗传距离分析
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图 1 基于 ITS2 序列构建“功劳叶”药材及其近缘混伪品的 NJ 树
注：bootsrap 1 000 次重复，仅显示支持率≥50%的分支。
本。序列变异分析、遗传距离法和 NJ 树结果均表
明，ITS2 序列能有效区分两种“功劳叶”药材及其近
缘混伪品。该研究为有效解决中药同名异物现象和
保障临床准确用药提供了参考。
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Identification of “Gonglao Leaf” and Its Sibling Adulterants Based on ITS2 Sequence
Xia Ye1, Zhou Hong2, Xiang Li3, Zhang Xiuqiao1, Hu Zhigang1,3
(1. College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China;
2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union
Medical College, Beijing 100193, China;
3. Institute of Chinese MateriaMedica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)
Abstract: Objective: The Phenomenon of different species with the same name has created potential threats to
cinical safety of medication. Because of that, two kinds of “gonglao leaf” and their sibling adulterants have been
identified by molecular methods in this study, to secure its safety in medication. Methods: Ilexcornuta,
Mahoniabealei, Mahoniafortuneiand their sibling adulterants total of 9 species 45 samples were collected in this
experiment,Total genomic DNA was extracted from them by the method of improved CTAB, ITS2 sequences were
amplified, and the PCR products were sequenced. Sequence assembly and consensus sequence generation were
performed by the CodonCode Aligner V 4.2.4.. The genetic distances were computed by MEGA 6.0 in accordance
with the Kimura 2 -Parameter (K2P) model and the phylogenetic tree constructed by the neighbor -joining (NJ)
method. Results: The analysis results of the genetic distances, variable sites and the NJ phylogenetic tree showed that
Ilexcornuta, Mahoniabealei, Mahoniafortunei were seperated from their sibling adulterants obviously. Conclusion: ITS2
sequence was able to identify two kinds of “gonglao leaf” and their sibling adulterants which can provide a basis for
clinical accurate medication.
Keywords: Ilex cornuta, gonglao leaf, ITS2 sequence, molecular identification, sibling adulterants
（责任编辑：张丰丰 张志华，责任译审：王 瑀）
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