全 文 ：第 44 卷 第 10 期
2 0 0 8年 10 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol.44 , No.10
Oct., 2 0 0 8
草决明荚枯病病原鉴定＊
刘会香1　赵新兰1　牛福芳1　潘彦平2　刘爱新1
(1.山东农业大学植保学院　泰安 271018;2.北京市林业局保护站　北京 100029)
摘　要:　2006—2007 年在山东农业大学中药材试验站栽培的药用植物草决明上发现一种新病害 ,定名为草决明
荚枯病。该病主要危害荚果 ,荚果受害后均从尖端开始发病 , 使受害部分变褐枯死 ,不能正常结籽。 从多个发病荚
果中共分离到 11株相同真菌分离物 , 针刺法接种荚果后均可引起荚果发病。根据该病原菌形态学特征 、培养性状
并结合 rDNA-ITS 序列分析 ,将引起草决明荚枯病的病原鉴定为葡萄座腔菌 , 这也是首次在草决明荚果上发现由
该种病菌引起的病害。
关键词:　草决明荚枯病;症状;病原鉴定;Botryosphaeria dothidea
中图分类号:S763.15　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-7488(2008)10-0094-04
收稿日期:2008-07-04。
基金项目:国家自然科技资源共享平台项目“林业微生物菌种资源标准化整理 、整合及共享试点”(2005DKA21207-19)。
＊刘爱新为通讯作者。
Pathogen Identification of Legume Dieback of Cassia tora
Liu Huixiang1　Zhao Xinlan1　Niu Fufang1　Pan Yanping2 　Liu Aixin1
(1.Department of Plant Pathology , Shandong Agricultural University 　Tai an 271018;
2.Protection Station of Beijing Forestry Bureau　Beijing 100029)
Abstract:　A new disease named legume dieback of Cassia tora was first found in Taian of Shandong Province during 2006—
2007.The disease was mainly harmful for legumes.Initially , the tips of diseased legume were gray-green and legume dieback
with the disease development.The diseased part of legume could not seed.Eleven strains were isolated from diseased legumes
and the pathogenicity was tested in the legumes.Based on morphological characteristics , pathogenicity test and the sequence of
ribosomal DNA-ITS , the pathogen was identified as Botryosphaeria dothidea Ces et de Not.This is the first report of legume
dieback of Cassia tora.
Key words:　legume dieback of Cassia tora ;symptoms;pathogenic identification;Botryosphaeria dothidea
草决明(Cassia tora)为豆科植物 ,广泛分布于热带和亚热带地区 ,在我国安徽 、广西 、四川 、浙江 、广东等
地栽培面积较大 。其干燥成熟种子即决明子 ,是中医临床最常用药材之一 。该药材具有祛风散热 、清肝明
目 、润肠通便的功效 ,主要成分有蒽醌类 、萘并吡喃类 、多糖类化合物及锌 、锰等多种微量元素(贾振宝等 ,
2006)。研究表明:其具有降压 、降血脂 、抗菌等作用 ,尤其对高血压 、高血脂等心血管疾病疗效较好。由于良
好的降脂效果 ,目前又成为减肥用品中的最常用组分 ,是国家卫生部公布的 69种药食同源的植物之一(吕翠
婷等 ,2006)。
草决明在我国栽培历史悠久 ,但国内对该药材的研究主要集中在分类鉴定 、内在质量 、有效成分 、药理作
用及作用机制等方面(张颖等 , 2004;张加雄等 , 2006),对其栽培过程中的病害问题研究很少。作者于
2006—2008年 ,在山东农业大学药材试验站种植的草决明荚果上发现一种新病害 ,该病害可造成 10%以上
荚果受害 ,危害严重 。本研究对病害的病原进行系统研究和鉴定 ,以期为病害的控制提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　标本采集及病原菌分离
病害标本分别采自山东农业大学中药材试验站和山东农业大学园艺试验站 。
病原菌的分离和纯化采用组织分离方法 ,置 PDA培养基上于 25 ℃恒温培养 ,待菌落长出后 ,挑选形态
一致的菌落转入 PDA平板继续培养 ,观察菌落形态 。
1.2　病原菌形态观察
在体视显微镜下检查采集的病荚 ,观察拍摄分生孢子器在病荚表面的分布 。选取具有典型症状的草决
明病荚标本 ,采用徒手切片法切取子实体 ,显微镜下观察病菌分生孢子器和分生孢子形态 ,分别测定 100个
分生孢子器和分生孢子 ,计量分生孢子器及分生孢子大小。
1.3　致病性测定
采用离体菌丝块接种法对分离菌株进行致病性测定。选取健康未成熟的草决明幼荚 ,用 75%的酒精表
面消毒 ,将 PDA平板上培养 4 d的培养物用直径 6 mm 的打孔器在菌落边缘打出菌饼 ,采用无伤和刺伤进行
接种 。无伤接种是将菌饼直接贴接于幼荚表面 ,刺伤接种用一次性注射器针头在健康幼荚表面针刺后 ,将菌
饼贴接于刺伤部位 ,每处理接种 10个幼荚 ,以PDA 琼脂块同样处理接种为对照 。25 ℃培养箱内保湿培养。
接种 2 d后移去菌丝块 ,观察发病情况。根据柯赫氏法则 ,对发病草决明荚再分离病原菌 ,观察分离的病菌
是否与原接种菌株相同。
1.4　病原菌生物学特性
1.4.1　病原菌对温度的适应性研究　分设 10 ,15 ,20 ,25 ,28 ,30 ,35 ℃7个温度梯度 ,取直径 5 mm 的菌落圆
片置于 PDA培养基上 ,于上述温度下恒温培养 ,间隔 24 h测量菌落直径 ,并观察菌落生长形态 、颜色等 。每
处理重复 3次。
1.4.2　病原菌对酸碱度的适应性　培养基灭菌后 ,分别调节 pH值为 3 ,4 ,5 ,5.5 ,6 ,7 ,8 ,9 ,接菌后于 25 ℃恒
温培养箱中培养 ,间隔 24 h测量菌落直径 ,计算日生长量 ,观察菌落生长形态 、颜色等 ,每处理重复 3次 。
1.5　ITS 区的 PCR扩增与序列分析
1.5.1　基因组 DNA的提取　选择菌株SDAU08-1 ,将病原菌接种到铺有无菌玻璃纸的 PDA平板 ,5 d后收集
菌丝 ,CTAB 法提取纯化基因组DNA ,用于 PCR扩增。
1.5.2　PCR扩增及序列测定　采用真菌核糖体 DNA(rDNA)通用引物 , ITS1和 ITS4进行扩增 ,引物序列分
别为 ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′, ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(上海生工生物工程
有限公司合成)。PCR循环设置如下:95 ℃预变性 4 min ,95 ℃变性 30 s ,55 ℃退火 40 s ,72 ℃延伸 1 min ,设
30个循环 ,最后 72 ℃延伸 10 min。PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分析。所用试剂购自上海生工生物工程
有限公司 。
用胶回收试剂盒(Takara公司)回收正确片断 ,连接 pMD-18-T 载体(Takara 公司),转化大肠杆菌 DH-5α,
PCR法筛选阳性克隆 ,提取质粒 ,经酶切鉴定正确后 ,由上海博亚生物技术有限公司测序。
1.5.3　序列分析与数据处理　测序后 ,菌株的 rDNA-ITS序列与GenBank核酸数据库中相关菌株进行相似性
比较 ,用 DNAMAN 软件构建系统发育树 ,分析该菌与其他菌株的关系 。
2　结果与分析
2.1　草决明荚枯病症状
该病主要为害草决明的荚果 ,均从荚果的顶(尖)端开始发病 。发病初期在荚果的顶端形成暗绿色 、水渍
状长条形斑 ,病斑凹陷 ,并迅速环绕整个荚果 。病斑沿荚果的顶端逐渐向内扩展 ,形成边缘褐色 ,中部灰褐色
至灰白色的病荚 ,荚果发病部分明显凹陷 ,不膨大 。有时病斑边缘暗绿色 ,病健交界处不明显 ,病部明显缢缩
(图版 Ⅰ-A ,箭头所示)。后期在发病部位密布黑色小颗粒 ,排列不规则 。病部可延伸至整个荚果的 1 2 ,导
致病部以上的荚果枯死(图版 Ⅰ -A)。荚果发病部分很少形成籽粒 ,发病较轻者偶有籽粒形成 ,但籽粒干
瘪 、黑褐色 、表皮不光滑(图版 Ⅰ-C)。根据病害症状 ,将该病命名为草决明荚枯病。
2.2　病原菌鉴定
2.2.1　病原菌形态特征　在解剖镜下镜检田间自然发病的荚果 ,发现病原菌分生孢子器黑褐色 ,初埋生寄
主表皮下 ,后突破表皮部分外露(图版 Ⅰ -E)。分生孢子器多为单生 ,单腔室 ,扁球形或球形 ,有孔口 ,大小
约(110.12 ～ 154.28)μm ×(82.74 ～ 150.23)μm ,平均(129.67 ～ 114.27)μm。内壁生分生孢子梗 ,孢子梗无色 ,
不分支(图版 I-F ,G , B和 C)。分生孢子梭形 ,单胞 ,无色 ,顶端钝圆 ,基部平截(图版 Ⅰ -H),大小为(16.83
～ 24.55)μm×(5.27 ～ 8.17)μm ,平均(18.35 ×6.34)μm 。
2.2.2　病原菌培养性状及生物学特性　将分离获得的不同菌株在 PDA培养基上培养 ,共获得 11株长势一
95　第 10期 刘会香等:草决明荚枯病病原鉴定
致的分离物。各分离物在 PDA培养基上生长迅速 ,培养初期菌丝白色 、疏松 、棉絮状 ,气生菌丝发达 ,易纠
结 ,菌落边缘整齐或不整齐。培养 3 d后 ,菌落逐渐变成灰色 ,10 d左右 ,菌落呈深灰色至黑色 ,镜检发现 ,菌
丝初期无色 ,后为深褐色 ,菌丝粗细不匀 ,分枝发达 ,有隔。
从病原菌对温度 、酸碱性适应性方面对该病菌的生物学特性进行初步分析 ,结果表明:病菌在 10 ～ 35 ℃
范围内均可生长 ,但在 20 ～ 28 ℃时菌丝生长迅速 ,4 d后即可长满培养皿 ,其他温度下生长较慢。pH 测定表
明 ,该菌在 pH4 ～ 9均可生长 ,但在 pH5.5 ～ 6.5生长最好 ,菌丝生长速度快 ,其他 pH 条件下生长相对较差。
因此 ,该菌生长适温范围为 20 ～ 28 ℃,适宜的 pH 范围为5.5 ～ 6.5。
2.2.3　致病性测定　菌丝块法接种结果表明:经针刺接种的荚果 ,3 d后开始出现病斑 ,病斑初期暗绿色 ,水
渍状 ,随后继续扩展形成暗褐色梭形斑 。而无伤贴接菌丝块的荚果只有 2个荚果表现轻微的水渍状 ,且水渍
状未进一步发展 ,对照处理也未产生任何症状 。从发病荚果上再分离的病菌与原接种菌株培养性状相同 ,证
实原接种菌株为草决明荚的致病菌 。
图 1　草决明荚枯病菌 SDAU08-1 与其他
菌株间的系统进化树
Fig.1　Phylogenetic tree of i8solate SDAU08-1 and
related pathogens based on sequences of ITS region
2.2.4　ITS 序列分析　为明确草决明荚枯病菌的类群 ,在形态鉴定基础上 ,进一步采用分子生物学方法进行
鉴定 。利用真菌 ITS1和 ITS4通用引物 ,对草决明荚枯病菌SDAU08-1的基因组DNA进行PCR扩增 ,在 580bp
左右扩增出一条单一条带 。经序列测定 ,该片段大小为 583bp。将该序列与 GenBank中已有的 DNA 序列进
行同源性比较 ,发现与其同源性在 95%以上的菌株共101个 。其中 , Botryosphaeria dothidea 87个 , B.corticis 4
个 , B.populi(基因登录号:51094087)1 个 ,其他类群如 Physalospora pyricola , Dothiorella gregaria , Dichomera
saubinettii(Fusicoccum aesculi), Macrophomina phaseolina 等 9 株 。所有 B .dothidea 菌株的 rDNA ITS 序列与
SDAU08-1的同源率均在 98%～ 100%,其中 12 株与该菌的同源率为 100%。所得最大分值(Score)为 1077
bits ,分别为来自中国的石榴干腐病菌 B.dothidea(基因登录号:gi:183238643)和石榴疮痂病菌 B .dothidea
(基因登录号:gi:168810882)。同源性较低的有 Macrophomina phaseolina(分值为 935)和 Rhizoctonia bataticola
(分值为 928),同源率均为 95%。
用DNAMAN软件建立该菌与其他 15个代表菌株的系统发育树 ,结果如图 1。菌株 SDAU08-1的序列与
GenBank中 8个 B .dothidea 位于系统发育树的同一分支 ,
遗传距离最近。与其他两个 B .dothidea(登录号:89994162
和 89994163)及无性态的 D.saubinettii即Fusicoccum aesculi
(登录号:58614359)和 B.populi(登录号:51094087)相对较
近。而与 D.gregaria(登录号:187472357)及 P.pyricola
(登录号:187472378)相对较远 , 与 B .corticis(登录号:
83270252)遗传距离最远 。
根据上述病原菌的形态特征以及 ITS序列同源性比较
的结果 , 初步鉴定草决明荚枯病的病原菌为葡萄座腔菌
(Botryosphaeria dothidea Ces et de Not.)。其分类地位属于子
囊菌门(Ascomycota)、腔菌纲(Loculoascomycetes)、格孢腔菌
目(Pleosporales)、葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae),葡萄座
腔菌属(Botryosphaeria)。
3　结论与讨论
本研究通过对该病害病原菌的致病性测定 、病原菌的
形态观察和 rDNA的 ITS序列分析 ,确定该病原菌为葡萄座
腔菌 ,将该病害命名为草决明荚枯病 ,这在国内外为首次报
道。
葡萄座腔菌属(Botryosphaeria spp.)真菌是世界性分布
的病原菌 ,由它引起的植物病害在世界 20多个国家流行危
害 ,主要引起多种木本植物的枝干和果实病害 ,如危害杨树
(Populus)、苹果(Malus)、石榴(Catunaregam)、桃树(Prunua)
96 林 业 科 学 44 卷　
等的枝干而导致溃疡 、干腐 、流胶 ,为害果实则导致果实腐烂等症状(张星耀等 , 2006;余仲东等 , 2002;付娟
妮等 ,2007)。有关该类真菌在药用草本植物上引起的病害报道较少。 B.dothidea 在草决明上的症状非常单
一 ,目前主要发现危害荚果 ,而在发病植株的茎杆和叶片等部位未发现症状 ,与木本植物上的多种症状类型
差异较大 。由草决明荚枯病的症状还可以看出 ,该病菌在荚果上仅发现无性态的分生孢子器和分生孢子 ,未
发现有性时期的结构。从GenBank比对结果看 ,在 101个与 SDAU08-1同源性95%以上的菌株中 ,87个为 B.
dothidea ,且同源率均在 98%～ 100%,DNAMAN构建的系统发育树也表明 ,该菌与 B .dothidea 位于系统进化
树的同一分支 ,表明引起草决明荚枯的病菌其有性时期为 B .dothidea 。
Botryosphaeria属真菌无性时期的分类鉴定较为复杂 ,该属真菌曾先后与多个半知菌属相联系 ,因此很难
把有性型和无性型正确地对应起来 。由于该菌的无性型特征如分生孢子颜色 、分隔 、分生孢子果的形态等都
是可变的 ,因此仅依靠形态特征进行分类容易发生混淆(Butin , 1993)。赵嘉平等(2007)认为 Botryosphaeria
无性阶段可能分别对应于色二孢属(Diplodia)和壳梭孢属(Fusicoccum),而我国林木病理学界曾广泛使用无
性型 D .gregaria 。王金利等(2005)综合分析以前的研究结果后认为 ,B .dothidea 的无性型应该是F.aesculi
而不是 D.gregaria 。本研究中 ,草决明荚枯病菌SDAU08-1菌株在基于 rDNA-ITS序列的系统进化树中 ,与分
离自桉树的 D.saubinettii 即F.aesculi(登录号:58614359)的遗传距离更为接近 ,表明该病原菌的无性型可
能为 F.aesculi ,有关这方面的研究正在进行中。
参 考 文 献
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吕翠婷 ,黎海彬 ,李续娥 ,等.2006.中药决明子的研究进展.食品科技 ,8:295-298.
王金利 ,秦国夫 ,贺伟 ,等.2003.葡萄座腔菌属及其相关真菌的系统学研究进展.中国森林病虫, 22(3):32-36.
余仲东 ,曹支敏 ,张星耀.2004.杨树溃疡病 、苹果轮纹病等病原菌的 ITS-rDNA- RFLP解析.中国森林病虫 , 23(2):15-18.
张　颖 ,张立木 ,杨志孝 ,等.2004.草决明不同部位中无机元素的含量测定.泰山医学院学报 ,25(1):33-34.
张加雄 ,万　丽 ,胡轶娟 ,等.2006.决明子降血脂有效部位的研究.时珍国医国药 , 17(6):904-905.
张星耀 ,赵嘉平 ,梁　军 ,等.2006.树木溃疡病菌主要类群系统地位及茶 子葡萄座腔菌的种内一致性.林业科学 , 42(11):63-68.
赵嘉平 ,梁　军 ,吕　全 ,等.2007.葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)系统分类评述.林业科学研究 , 20(3):415-422.
Butin H.1993.Morphological adaptation and spore pleomorphism in the form-complex Dichomera-Camarosporium and Fusicoccum-Dothiorella.Sydowia , 45:161
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(责任编辑　王艳娜)
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