全 文 ：书第 44卷 第 7期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol．44 No．7
2016年 7月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Jul． 2016
1)中 央 高 校 科 学 前 沿 与 交 叉 学 科 创 新 基 金 项 目
(2572014CAQ02);黑龙江省高校科技成果产业化前期研发培育项目
(1254CGZH14)。
第一作者简介:赵玉红，女，1968 年 8 月生，东北林业大学林学
院，副教授。E－mail:zhao@ nefu．edu．cn。
收稿日期:2015年 12月 18日。
责任编辑:程 红。
鹿茸水溶性蛋白质提取条件的优化及组分1)
赵玉红 张立钢 张睿
(东北林业大学，哈尔滨，150040) (东北农业大学) (东北林业大学)
摘 要 以梅花鹿(Cervus nippon Temminck)鹿茸为原料，采用缓冲溶液提取水溶性蛋白质，在单因素试验的
基础上，利用 Box－Behnken设计试验优化鹿茸水溶性蛋白质的提取条件，采用 Sephadex G－100 凝胶层析和 SDS－
PAGE电泳对提取物组分进行分析。结果表明:鹿茸水溶性蛋白质的最佳提取工艺条件为 pH= 9．18，料液比 1．0 g ∶
60．4 mL，提取时间 5．9 h，在此条件下蛋白提取量为 90．84 mg·g－1。采用 Sephadex G－100凝胶层析对鹿茸水溶性蛋
白质进行分离得到 3个吸收峰，经 SDS－PAGE电泳测定，其相对分子质量分别为 66 000、29 000、14 000。鹿茸水溶
性蛋白质主要为小分子蛋白质。
关键词 梅花鹿;鹿茸;水溶性蛋白质
分类号 S865．42;Ｒ284．2
Component and Optimization of Extraction Conditions for Water Soluble Protein from Deer Antler / /Zhao Yuhong
(Northeast Forestry University，Harbin 150040，P． Ｒ． China);Zhang Ligang(Northeast Agricultural University) ;Zhang
Ｒui(Northeast Forestry University)/ / Journal of Northeast Forestry University，2016，44(7) :120－124．
Antler velvet from Cervus nippon Temm inck was used as raw material，and water-soluble protein was extracted with
buffer solution． The extraction condition was optimized by Box－Benhnken central composite experiment based on single fac-
tor tests． The components were analyzed with Sephadex G－100 gel filtration chromatography and SDS－PAGE． The opti-
mized extraction conditions of water soluble protein were pH of 9．18，solid-liquid ratio of 1．0 g ∶ 60．4 mL，and extraction
time of 5．9 h with the protein yield of 90．84 mg /g． Three peaks were got with Sephadex G－100 gel filtration chromatogra-
phy． The molecular weight of protein was investigated by SDS－PAGE with 66 kD，29 kD and 14 kD． Water-soluble protein
from antler velvet was small molecular protein．
Keywords Cervus nippon Temminck;Deer antler;Water soluble protein
梅花鹿鹿茸是梅花鹿(Cervus nippon Temminck)
雄鹿密生茸毛的未骨化的幼角［1］。鹿茸作为哺乳
动物界唯一存在的可快速重生的组织器官［2－3］，其
中含有蛋白质、氨基酸、脂肪酸、磷脂、多糖等多种有
机成分，还含有人体必需的多种常量和微量元
素［1］。鹿茸蛋白占鹿茸总质量的 52%以上［4］，具有
调节免疫、促进伤口愈合、改善性功能、抗疲劳、抗肿
瘤、抗炎、抗氧化等多种生物学效应［5－6］。
鹿茸水溶性成分主要包括蛋白质、氨基酸、多糖
等，其中蛋白质和多糖是具有生物功能的活性物质。
Sui et al．［7］采用生理盐水和 pH= 4．0、pH= 10．0的缓
冲溶液对鹿茸中蛋白质进行提取，用 STD 裂解缓冲
液提取其中可溶性蛋白质，并用胰蛋白酶进行酶解，
对产物采用 ＲPLC－ESI－MS /MS 进行分析，其酸性
和碱性缓冲溶液提取蛋白对人脐静脉内皮细胞具有
明显增殖效果。严铭铭［8］从梅花鹿茸中分离纯化
得到 5种蛋白质 CNTPⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和 1 个多肽
CNT14，发现蛋白 CNTPⅢ和多肽 CNT14 同源性与
已知蛋白序列相比小于 50%。董万超等［9］将二杠
梅花鹿茸经 40%乙醇提取，分离、纯化，获得梅花鹿
茸多肽Ⅰ和Ⅱ组分。王华等［10］从梅花鹿鹿茸中提
取了天然鹿茸总多肽(VATP)，通过 HPLC 纯化，分
离出了相对分子质量为 200 ～ 600 的小肽活性组分
(VAP－B2)。王丰等［11］通过凝胶层析、离子交换层
析以及 HPLC法，从马鹿茸中分离得到一种相对分
子质量为 3 095．1的多肽。
本研究以梅花鹿鹿茸为原料，利用水溶液对鹿
茸蛋白质进行提取，在单因素试验基础上，利用 Box－
Behnken中心组合试验优化提取鹿茸水溶性蛋白质
的提取工艺，并对产物组分进行分级和分子质量分
析，旨在优化鹿茸蛋白质提取的适宜工艺条件，提高
鹿茸蛋白质提取效率，节约生产成本。为发现鹿茸
提取物中新的活性物质，为鹿茸水溶性蛋白质的进
一步应用及工业化生产提供依据。
1 材料与方法
1．1 材料
梅花鹿鹿茸:黑龙江省大庄园集团提供。鹿茸
为二杠锯茸，具有典型分枝，为带血茸，皮黑褐，亮
泽，断面含血充分、均匀，呈暗红色。单枝质量不低
于 125 g。
DOI:10.13759/j.cnki.dlxb.2016.07.025
1．2 方法
1．2．1 鹿茸的预处理及提取方法
取冷冻鲜茸，剥皮，去除残余鹿茸血，将去血的
鹿茸切成 2～5 mm的小块，冻干后经粉碎机粉碎，过
40目筛，鹿茸粉密封备用。用不同 pH 的缓冲溶液
浸泡鹿茸干粉，得鹿茸蛋白粗提物。
1．2．2 提取工艺条件优化
(1)单因素试验设计
选取缓冲溶液 pH、料液比、提取时间 3 个因素
为主要影响因素。①缓冲溶液 pH 对鹿茸水溶性蛋
白质提取效果的影响。精确称取鹿茸粉末 1 g，分别
在 pH为 2．6、5．0、7．0、8．0(磷酸二氢钠－柠檬酸缓冲
溶液)、9．0、10．0(碳酸钠－碳酸氢钠缓冲溶液)、12．0
(氯化钾－氢氧化钠缓冲溶液)，提取 2 h，料液比 1 g ∶
20 mL的条件下提取，测定不同 pH条件下提取的蛋
白质质量分数。②料液比对鹿茸水溶性蛋白质提取
效果的影响。精确称取鹿茸粉末 1 g，分别在料液
比为 1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40 mL、1 g ∶ 50
mL、1 g ∶ 60 mL、1 g ∶ 70 mL、1 g ∶ 80 mL、1 g ∶ 90
mL、1 g ∶ 100 mL，pH= 9．0，提取 2 h 的条件下提取，
测定不同料液比条件下提取的蛋白质质量分数。
③提取时间对鹿茸水溶性蛋白质提取效果的影响。
精确称取鹿茸粉末 1 g，分别在时间为 1、2、4、6、8 h，
pH= 9．0，料液比 1 g ∶ 60 mL 的条件下提取，测定不
同提取时间下提取的蛋白质质量分数。
(2)Box－Behnken中心组合设计
在单因素试验的基础上应用 Box－Behnken的中
心组合设计原理设计响应面试验。用 SAS9．0 软件
对响应面结果进行分析。响应面试验的因素和水平
编码值见表 1。
表 1 响应面分析因素水平编码
水平 提取时间(X1)/d 料液比(X2) pH(X3)
－1 5 1 g ∶ 55 mL 8．5
0 6 1 g ∶ 60 mL 9．0
1 7 1 g ∶ 65 mL 9．5
1．2．3 蛋白质质量分数测定
采用考马斯亮蓝 G－250 法测定蛋白质质量分
数。标准曲线回归方程为 y= 0．005 9x+0．013 7，Ｒ2 =
0．995 2。
1．2．4 鹿茸蛋白质的分离纯化
(1)水提物中蛋白质的初步分离
取鹿茸缓冲溶液提取物，加入 80%硫酸铵，搅拌均
匀，使硫酸铵完全溶解，于冰箱中4℃冷藏过夜，使蛋白
沉淀析出，高速离心，得粗蛋白，－20 ℃冷冻备用。
(2)Sephadex G－100排阻层析
凝胶的预处理:准确称取 4 g Sephadex G－100
于烧杯中，加入 200 mL蒸馏水，浸泡 72 h，使凝胶充
分溶胀，倾去水分和表层的细小颗粒及杂质。溶胀
后如果仍有细小颗粒存在，可以充分搅拌或超声处
理以打碎细小颗粒，必须保证葡聚糖凝胶的均一性。
凝胶充分溶胀后，用蒸馏水反复洗涤 2 ～ 3 次后，于
冰箱 4 ℃冷藏备用。
装柱:取洁净的层析住，垂直固定在铁架台上，
不可倾斜，关闭下端出口，在柱中加入约 1 /3柱床体
积的洗脱液，边轻轻搅拌边将葡聚糖凝胶匀浆通过
内壁一侧倾入柱中，待凝胶沉积 1 ～ 2 cm 后，打开层
析柱下端出口，流速一般为 0．3 ～ 0．6 mL·min－1;同
时不断缓慢加入凝胶悬液，待沉积胶面上升至标记
处时，灌胶完毕;关闭出水口，静置片刻，等凝胶完全
沉降后，接上恒流泵，用 3 ～ 5 倍柱床体积的平衡液
平衡柱子 24 h，使柱床稳定。装柱过程应始终注意
速度，以防有气泡进入。
经过初步分离的鹿茸蛋白质，溶于 pH = 8．0 的
磷酸盐缓冲溶液中，上样质量浓度为 20 g·L－1，上
样体积为 1 mL(5%)。层析柱规格为 1．0 cm×40．0
cm，径高比为 1 ∶ 25，流速 0．5 mL·min－1，5 mL·
管－1收集流出液。分别用紫外 /可见光分光光度计
(280 nm处)检测紫外吸收峰。根据洗脱曲线收集
合并相同的组分，－20 ℃冷冻备用。
(3)SDS－PAGE电泳
SDS不连续凝胶垂直电泳，3%浓缩胶，15%分
离胶。
1．2．5 数据处理
采用 Excel 2003对数据进行分析，所得结果为
平均值±标准差(珋x±s，n= 3)，应用 SAS 9．0 软件对显
著性进行分析。
2 结果与分析
2．1 单因素试验
2．1．1 pH对鹿茸水溶性蛋白质提取效果的影响
pH为 2．6、5．0、7．0、8．0、9．0、10．0、12．0 时，鹿茸
水溶性蛋白质提取量分别为 17．23、48．75、63．38、65．47、
81．75、77．00、64．46 mg·g－1。可见，在缓冲溶液 pH＜
7时，蛋白质的提取量是随着 pH 的升高而增加的，
而由 pH= 7 到 pH = 8 附近又趋于平稳，即蛋白质提
取量不随 pH改变而有明显变化。从 pH=8到 pH=9
过程中蛋白质提取量又随着 pH 升高而继续升高，
到 pH= 9以后，随着 pH增大，蛋白质提取量呈降低
趋势，当 pH= 9时蛋白质的提取量最大。
2．1．2 料液比对鹿茸水溶性蛋白质提取效果的影
响结果
料液比为 1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 40
121第 7期 赵玉红，等:鹿茸水溶性蛋白质提取条件的优化及组分
mL、1 g ∶ 50 mL、1 g ∶ 60 mL、1 g ∶ 70 mL、1 g ∶ 80
mL、1 g ∶ 90 mL、1 g ∶ 100 mL时，鹿茸水溶性蛋白质
提取量分别为 77． 17、78． 38、79． 20、80． 36、82． 19、
79．96、75．72、73．29、70．90 mg·g－1。可见，料液比小
于 1 g ∶ 60 mL时，蛋白质提取量是随着料液比的增
加而增加，从料液比 1 g ∶ 60 mL 到 1 g ∶ 100 mL 阶
段，蛋白质的提取量随着料液比增加而明显降低。
料液比为 1 g ∶ 60 mL时蛋白质提取量最大。
2．1．3 提取时间对鹿茸水溶性蛋白质提取效果的
影响
提取时间为 1、2、4、6、8 h 时，鹿茸水溶性蛋白
质提取量分别为 64．40、66．69、72．28、82．96、73．04、
71．77 mg·g－1。可见，提取时间小于 6 h 时，随着提
取时间的增加蛋白质的提取量增加，直到提取 6 h
时蛋白质提取量达到最大(82．96 mg·g－1)。提取
时间从 6 h到 12 h蛋白质提取量又随着时间的增加
而减少。
2．2 鹿茸水溶性蛋白质提取工艺条件优化
试验采用 Box－Behnken 设计原理，二次旋转多
元回归试验设计，共计 17个试验点，其中 12个析因
点，5 个零点。以提取时间(X1)、料液比(X2)、pH
(X3)3个因素为自变量，以蛋白质质量分数为响应
值，试验方案及结果见表 2。
表 2 Box－Behnken试验设计及试验数据
试验号
提取时间
(X1)
料液比
(X2)
pH
(X3)
蛋白质质量
分数 /mg·g－1
1 －1 0 1 81．941
2 0 0 0 92．110
3 －1 0 －1 69．991
4 0 0 0 92．618
5 0 1 1 82．449
6 0 0 0 93．127
7 0 －1 1 78．127
8 1 1 0 67．449
9 －1 1 0 78．381
10 0 －1 －1 71．008
11 0 1 －1 66．686
12 0 0 0 91．602
13 1 －1 0 74．822
14 1 0 1 79．398
15 －1 －1 0 73．551
16 1 0 －1 71．517
17 0 0 0 90．839
应用 SAS 9．0 软件对回归系数显著性进行分
析，结果见表 3。
各因素经回归拟合后，解得回归方程为:
Y= 92．059 2－1．334 8X1 －0．317 9X2 +5．339 1X3 －
8．682 1X1X1 －9．826 4X2X2 －7．665 4X3X3 －
3．050 8X1X2 －1．017 3X1X3 +2．101 0X2X3。
式中:Y为蛋白质量分数;X1 为提取时间;X2 为料液
比;X3 为 pH。
表 3 回归系数显著性分析结果
项目 系数 系数标准误 t值 p值
常量 92．059 2 0．642 9 143．20 ＜0．000 1
X1 －1．334 8 0．508 2 －2．63 0．034 1
X2 －0．317 9 0．508 2 －0．63 0．551 5
X3 5．339 1 0．508 2 10．51 ＜0．000 1
X1X1 －8．682 1 0．700 5 －12．39 ＜0．000 1
X2X1 －3．050 8 0．718 7 －4．24 0．003 8
X2X2 －9．826 4 0．700 5 －14．03 ＜0．000 1
X3X1 －1．017 3 0．718 7 －1．42 0．199 9
X3X2 2．101 0 0．710 7 0．01 0．010 0
X3X3 －7．665 4 0．700 5 －10．94 ＜0．000 1
表 4 回归方程检验结果
方差来源 自由度 平方和 均方 F值 p值
X1 1 14．252 5 14．252 5 6．90 0．034 1
X2 1 0．808 4 0．808 4 0．39 0．551 5
X3 1 228．050 0 228．050 0 110．36 ＜0．000 1
X1X1 1 394．716 9 394．716 9 191．02 ＜0．000 1
X1X2 1 37．228 3 37．228 3 18．02 0．003 8
X1X3 1 4．139 2 4．139 2 2．00 0．199 9
X2X2 1 441．849 6 441．849 6 213．83 ＜0．000 1
X2X3 1 18．679 7 18．679 7 9．04 0．019 8
X3X3 1 247．400 4 247．400 4 119．73 ＜0．000 1
模型 9 1 387．124 9 0．989 7 74．59 ＜0．000 1
线性 3 243．110 9 0．173 5 39．22 ＜0．000 1
平方 3 1 083．966 8 0．773 4 174．86 ＜0．000 1
交互 3 60．047 2 0．042 8 9．69 0．006 9
失拟误差 3 11．311 8 3．770 6 4．78 0．082 3
纯误差 4 3．153 0 0．788 2
残差 7 14．464 7 2．066 4
总离差 16 1 401．589 6
对此二元回归模型进行方差分析，其回归系数
Ｒ2 = 0．9897，Ｒ2 越接近 1，证明拟合度越高，全体自
变量与因变量之间的多元回归关系就越显著，且模
型的 p值小于 0．01，表明该模拟二次方程极显著，失
拟性结果不显著(p＞0．05)，所以该模型的拟合度很
好，可用该模型对未知条件下提取鹿茸蛋白的工艺
进行理论预测。由表 5 的 p 值可知，各因素对结果
的影响由大到小为:pH 值、提取时间、液料比。其
中，X3、X1X1、X2X2、X3X3、X1X2 对 Y的影响极显著(p＜
0．01)，X1、X2X3 对 Y 的影响显著(p＜0．05)，说明试
验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，其中
二次项对响应值的影响较大，交互项的作用较小。
根据回归方程，做出响应面及等高线图，考察所
拟合的响应面的形状，分析 3 因素对蛋白质量分数
的影响。响应面图和等高图见图 1。从 pH 与提取
时间响应面和等高线图可以看出，最优点趋近于 pH=
9．0和提取时间为 6 h，并在这 2点附近取得最大值。
从等高线图可看出，pH比提取时间对蛋白提取量的
影响大。从 pH 与料液比响应面和等高线可以看
221 东 北 林 业 大 学 学 报 第 44卷
出，最优点趋近于 pH= 9．0 和料液比为 1 g ∶ 60 mL，
并在这 2点附近取得最大值。从等高线图可看出，
pH比料液比对蛋白提取量的影响大。从料液比与
提取时间响应面和等高线可以看出，最优点趋近于
料液比为 1 g ∶ 60 mL和提取时间为 6 h，并在这 2点
附近取得最大值。从等高线图可看出，料液比比提
取时间对蛋白提取量的影响大。
利用 SAS 9．0 软件对该试验设计进行脊岭分
析，最终确定了鹿茸蛋白的最优提取条件为 pH=9．18，
料液比 1．0 g ∶ 60．4 mL，提取时间 5．90 h。
图 1 梅花鹿鹿茸蛋白质量分数与提取因素的响应面和等高线图
为了验证拟合数据的可行性，在得到的最佳提
取条下，进行鹿茸蛋白提取验证试验，3 次平行试验
得到实际平均蛋白提取量为 90．84 mg·g－1，是理论
预测值的 97．54%，十分接近理论预测值。因此，响
应面法对鹿茸蛋白提取条件的优化是可行的，得到
的鹿茸蛋白的提取条件具有实际的应用价值。
2．3 Sephadex G－100排阻层析结果
用 Sephadex G－100 葡聚糖凝胶对经过初步分
离得到的鹿茸蛋白进行的纯化、收集洗脱峰部分，结
果见图 2。从图 2 可知，经 Sephadex G－100 凝胶层
析后得到了 3个吸收峰，依次为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，其中第
1个吸收峰较大，后两个吸收峰较小，这说明鹿茸水
溶性蛋白质的分子质量范围主要集中在这 3处。
2．4 蛋白分子质量分布
用 SDS－PAGE 电泳测定粗蛋白及经分离纯化
后蛋白质的分子质量分布(图 3)。由图 3 可以看
出，3个组分的相对分子质量从高到低依次为 66 000、
29 000和 14 000，说明鹿茸中的蛋白质分子质量主
321第 7期 赵玉红，等:鹿茸水溶性蛋白质提取条件的优化及组分
要集中在这 3个分子质量范围内，且 Sephadex G－100
层析柱能够有效地将鹿茸蛋白质各个分子质量范围
的蛋白质分离开，效果显著。
图 2 鹿茸水溶性蛋白质 Sephadex G－100凝胶排阻层析曲线
1．经硫酸铵分离后的粗总蛋白;2．组分Ⅰ;3．组分Ⅱ;4．组分Ⅲ;5．蛋白
Marker。
图 3 鹿茸水溶性蛋白质 SDS－PAGE电泳图
3 结论
通过对梅花鹿鹿茸中的水溶性蛋白质进行提取
条件优化并对其组分进行分析可知:鹿茸水溶性蛋
白质的最佳提取条件为:pH = 9．18，料液比 1．0 g ∶
60．4 mL，提取时间 5．9 h，在此条件下蛋白提取量为
90．84 mg·g－1。通过 Sephadex G－100 凝胶层析，得
到了 3个吸收峰，经 SDS－PAGE 电泳测定，相对分
子质量分别为 66 000、29 000、14 000。鹿茸水溶性
蛋白质主要为小分子蛋白质。
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421 东 北 林 业 大 学 学 报 第 44卷