全 文 ：第 16 卷 第 9 期 2016 年 3 月
1671—1815(2016)09-0160-04
科 学 技 术 与 工 程
Science Technology and Engineering
Vol. 16 No. 9 Mar． 2016
 2016 Sci. Tech. Engrg.
生物科学
长春七多糖的单糖组成分析及理化性质研究
闫涵威1 李 萍2 倪文骐1 李卫燕2 曹 蔚2*
(第四军医大学学员旅1，药学院天然药物学教研室2，西安 710032)
摘 要 长春七多糖的单糖组成分析及理化性质研究，以长春七为原料，对其根部进行粉碎，经过水提醇沉得到粗多糖，然后
经过除蛋白、脱色等步骤进一步得到总多糖。通过高效液相色谱法、比色法等分析其单糖组成和理化性质。结果表明长春七
多糖主要由甘露糖-鼠李糖-葡萄糖醛酸-阿拉伯糖-岩藻糖(17. 2 ∶ 1. 0 ∶ 18. 0 ∶ 38. 6 ∶ 16. 2)构成;含总多糖 63. 03%，蛋白质
9. 21%，硫酸根 6. 56%，糖醛酸 26. 39%。
关键词 长春七 多糖 理化性质 单糖组成
中图法分类号 Q539. 7; 文献标志码 B
2015 年 11 月 09 日收到 陕西省中医管理局科研课题(13 － ZY037)、
国家自然科学基金(81173513，81473329)资助
第一作者简介:闫涵威(1995—) ，男，汉族。
* 通信作者简介:曹 蔚(1977—) ，女，副教授，博士生导师。
E-mail:caowei@ fmmu． edu． cn。
长春七，别名长虫七，为伞形科岩风属植物岩风
Libanotis Buchtorimensis (Fisch)DC 的干燥根及根
茎;为陕西“太白七药”之一，在陕西民间广为应用。
同时在新疆、甘肃、四川等地亦有分布。本品性甘
温、味苦，具有疏风散寒，祛风除湿，活络止痛的功
效，广泛应用于风寒感冒、周身疼痛、关节肿胀、跌打
损伤、风湿筋骨疼痛等疾病的治疗［1］。国内学者从
其中分离出香豆素类，有机酸，甾醇类有关物质［2］，
但对其中所含多糖成分研究较少。本文以长春七为
原料，通过水提醇沉法进行初步提取得到粗品多糖，
通过反复冻融法除蛋白，过氧化氢除色素等方法得
到实验样品，最后用由 Honda 等［3—5］发展和完善的
1-苯基-3-甲 基-5-吡 唑 啉 酮 (1-phenyl-3-methyl-5-
pyrazolone，PMP)柱前衍生化高效液相色谱法分析
其单糖组成［6—8］。同时对其总多糖、蛋白质、硫酸根
和糖醛酸含量进一步分析。研究结果为长春七大分
子成分的研究提供了实验数据。
1 仪器与试剂
1. 1 仪器
LC-2010A HT 色谱仪(日本岛津公司) ;UV-
2600 紫外分光光度计(天美科学仪器有限公司) ;
ＲE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) ;
SHB-Ⅲ型循环水用真空泵(郑州长城科工贸有限公
司) ;TDL-5C型离心机(上海安亭科学仪器厂) ;分
析天平(深圳深博瑞仪器仪表有限公司) ;透析袋
(截留分子量 8 000) (西安科昊生物工程有限责任
公司) ;FD—1 型冷冻干燥机(北京博医康实验仪器
有限公司) ;98—1-B 型电热套(天津市泰斯特仪器
有限公司)。
1. 2 试剂
长春七(于 2014 年 9 月从陕西太白山采得，晒
干，经本教研室鉴定) ;无水乙醇(分析纯，天津富宇
精细化工有限公司) ;苯酚(分析纯，天津市河东区
红岩试剂厂) ;浓硫酸(分析纯，西安武本科技有限
公司) ;葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、咔唑(国药集
团化学试剂有限公司) ;氨基葡萄糖、鼠李糖、氨基
半乳糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖
(Sigma-aldrich公司) ;甲醇、乙腈(色谱纯，韩国德山
公司) ;四氢呋喃(色谱纯，天津市科密欧化学试剂
有限公司)。实验所用其他试剂均为国产分析纯。
2 方法与结果
2. 1 方法
2. 1. 1 多糖的提取
取长春七 600 g，用三倍量体积的无水乙醇回流
提取 3 次，每次 2 h。待冷却至室温，倾去上清液，残
渣挥干乙醇后用水溶液回流提取。提取结束后用纱
布过滤，收集上清液，用旋蒸仪蒸发浓缩至小体积，
于 － 20 ℃保存备用。
2. 1. 2 分离与纯化
取所得的上清液，40 ℃溶解，加入 4 倍体积的
乙醇溶解，充分摇匀，在 4 ℃放置 12 h，置于 3 000
r·min －1离心，收集沉淀，加入适量蒸馏水，反复冻
融 13 次［9］，除去其中蛋白质。用旋蒸仪浓缩至小体
积，使用冻干机冻干成粉末，加入 300%体积(多糖
质量:H2O2 体积) ，30% 的 H2O2 除色素(80 ℃，3
h) ，再次浓缩至小体积后将其加入透析袋中进行透
析，除去小分子物质。而后收集透析袋中溶液，继续
旋蒸，浓缩至小体积。用冻干机对其冻干，称重得
5. 56 g多糖，置于干燥器中保存。
2. 1. 3 理化性质分析
1)苯酚-硫酸法测定长春七多糖的总糖含量［10］
标准曲线测定 精密称量干燥的葡萄糖 20
mg，置于干燥的 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻
度。取 6 个 10 mL 容量瓶，精密吸取 0 mL，2 mL，4
mL，6 mL，8 mL，10 mL 葡萄糖母液，加水定容至刻
度，备用。分别吸取 4 mL不同浓度的葡萄糖溶液于
6 个试管中，依次加入 6 mL浓硫酸以及 2 mL 6 %苯
酚，混匀，静置反应 30 min。于 490 nm 处测定吸光
度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，作标
准曲线。
样品含量测定 精密称量长春七干燥样品 3 份
各 25 mg置于 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，
摇匀备用。精密吸取所得样品溶液各 4 mL 置于试
管中，重复以上操作，测定吸光度值，通过标准曲线
算出多糖含量。
2)硫酸-咔唑法测定长春七多糖糖醛酸含量［11］
标准曲线测定 精密称量干燥的半乳糖醛酸
20 mg于 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。分别
吸取体积为 0 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6
mL半乳糖醛酸母液置于 6 个 10 mL容量瓶中，加水
定容至刻度，摇匀，得到 6 个浓度的标准溶液。依次
向放置于冰水浴中的 6 个试管中加入 1 mL 不同浓
度的标准溶液，再依次逐滴加入 6 mL 浓硫酸，冷却
后充分震荡，于 100 ℃水浴锅中水浴 10 min 取出，
再次冷却至室温。向 6 个试管中依次加入 0. 15 %
咔唑溶液 0. 5 mL，充分震摇后静置 30 min。于 530
nm波长处测定吸光度，以半乳糖醛酸浓度为横坐
标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
样品含量测定 分别精密称量长春七干燥样
品 3 份各 25 mg，置于 100 mL容量瓶中，加水定容
至刻度。依次精密吸取样品溶液 1 mL，重复以上
操作，测定吸光度值。根据回归方程计算糖醛酸
含量。
3)考马斯亮蓝法测定长春七多糖蛋白质
含量［12］
标准曲线测定 精密称量干燥的牛血清白蛋白
约 10 mg置于 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。
分别量取 0 mL，5 mL，10 mL，15 mL，20 mL，25 mL
所配溶液于 6 个 50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，
摇匀，得到 6 个不同浓度的标准溶液。依次精密吸
取 6 个不同浓度的标准溶液各 5 mL置于试管中，吸
取考马斯亮蓝 5 mL加入其中，充分震荡，在 595 nm
处测定吸光度。以牛血清白蛋白浓度为横坐标，吸
光度值为纵坐标绘制回归曲线。
样品含量测定 依次精密称取长春七干燥样品
3 份各约 25 mg 于 50 mL 容量瓶中，加入水定容至
刻度，依次精密吸取 5 mL 置于 6 个试管中，重复以
上操作，测定吸光度，根据回归曲线计算蛋白质
含量。
4)硫酸钡比浊法测定长春七多糖中 SO2 －4
含量［13］
精密称量 K2SO4 粉末 108. 75 mg，用 1 mol·
L － 1的 HCl定容于 100 mL容量瓶中，震荡摇匀，即
得 SO2 －4 的标准液。精密吸取 K2SO4 标准溶液
0. 02 mL，0. 04 mL，0. 06 mL，0. 08 mL，0. 1 mL，
0. 12 mL，0. 14 mL，0. 16 mL，0. 18 mL，0. 2 mL，分
别用 1 mol·L － 1 HCl 补充至 0. 2 mL，同时以 0. 2
mLHCl作为空白对照，依次加入三氯乙酸 3. 8 mL，
BaCl2 明胶溶液 1. 0 mL 充分反应，室温静置 15
min后于 360 nm测吸光度 A1;以 1. 0 mL的明胶溶
液代替 BaCl2 明胶溶液重复以上操作，测得吸光度
A2。以硫酸根毫克数为横坐标，Y = A1 － A2 为纵坐
标，得到标准曲线。
样品含量测定 依次精密称取长春七干燥样品
各约 25 mg于 100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，
吸取 0. 2 mL进行以上操作，在 360 nm 下测定吸光
度，根据回归曲线计算 SO2 －4 含量。
5)HPLC法测定单糖组成［14］
称取长春七多糖样品 20 mg置于 10 mL离心管
中，加 2. 5 mL，2 mol·L －1三氯乙酸，充氮气封管，于
110 ℃油浴中水解 6 h，冷却至室温，50 ℃旋蒸挥干
三氯乙酸，用 2 mol·L －1 NaOH 调节 pH 至 7，用去
离子水定容至 1 mL，取上清液。加入 0. 3 mol·L －1
的 NaOH 200 μL，作为长春七实验组。其余各组单
糖各取 400 μL，加入 400 μL 0. 5 mol·L －1PMP甲醇
溶液，混匀后置于 70 ℃水浴 30 min，冷却至室温后
加入 0. 3 mol·L －1HCl溶液中和 pH至 7，加入 4 mL
氯仿和 2 mL水，涡旋萃取，离心分层，用注射器吸取
下层有机层，上层水相重复萃取 2 次，得到 PMP 衍
生化样品。实验重复 3 次。
色谱条件。色谱柱:Hypersil BDS C18分析柱
(4. 6 mm ×250 mm，5 μm)。流动相:乙酸铵水溶液
(pH = 5. 0)-乙腈-四氢呋喃(81 ︰ 17 ︰ 2) ;流速:
1. 0 mL·min －1;检测波长:250 nm;进样量:20 μL;
柱温:25 ℃。
1619 期 闫涵威，等:长春七多糖的单糖组成分析及理化性质研究
2. 2 结果
2. 2. 1 总糖含量
苯酚-硫酸法测定的标准曲线为 Y = 9. 820 3X
(相关系数 r = 0. 998 1，n = 3)含量测定的长春七多
糖总多糖含量 63. 03%。
2. 2. 2 糖醛酸含量
采用硫酸-咔唑比色的方法测得长春七多糖中
糖醛酸含量 26. 39%，标准曲线 Y = 2. 927 7X －
0. 002 1(相关系数 r = 0. 997 3，n = 3)。
2. 2. 3 蛋白质含量
通过 考 马 斯 亮 蓝 法 得 到 标 准 曲 线 Y =
1. 831 8X －0. 004 9(相关系数 r = 0. 998 6，n = 3) ，结
合实验数据得到长春七多糖中蛋白质含量 9. 21%。
2. 2. 4 硫酸根含量
长春七多糖中硫酸根含量 6. 56%，通过 3 组实
验数据得到标准曲线 Y = 1. 309 6X － 0. 068 3(相关
系数 r = 0. 999 1)。
2. 2. 5 HPLC测定单糖组成
10 种标准单糖 HPLC 色谱图及长春七多糖的
单糖组成色谱图，分别见图 1，图 2。以保留时间对
长春七多糖的单糖组成进行定位，发现其单糖组成
为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖和岩藻糖，
采用标准曲线法进行定量，计算出各种单糖的组成
比例为阿拉伯糖-葡萄糖醛酸-甘露糖-岩藻糖-鼠李
糖(38. 6 ︰ 17. 2 ︰ 18. 0 ︰ 16. 2 ︰ 1. 0)。
1为甘露糖;2为氨基葡萄糖;3为鼠李糖;4为氨基半乳糖;5为葡萄糖醛酸;
6 为半乳糖醛酸;7 为葡萄糖;8 为半乳糖;9 为阿拉伯糖;10 为岩藻糖
图 1 10 种标准单糖 HPLC色谱图
Fig. 1 HPLC chromatogram of standard monosaccharides
1 为甘露糖;2 为鼠李糖;3 为葡萄糖醛酸;4 为阿拉伯糖;5 为岩藻糖
图 2 长春七多糖 HPLC色谱图
Fig. 2 HPLC chromatogram of hydrolyzed monosaccharides
from Libanotis Buchtorimensis
3 讨论
多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、
抗凝血、免疫促进［14］等方面具有重要的生物活性。
临床作用广泛且获取途径丰富。尽管近年来国内外
学者关于中草药多糖的结构、活性等方面展开了大
量的研究［15］，然而尚未发现有关长春七多糖的研究
报导，此领域仍是空白。
本文借鉴我们实验室对其他中药多糖的研究方
法，初步对长春七多糖展开研究。提取所得长春七
总多糖产率为 0. 926 7%，其中所采用的反复冻融法
除蛋白效果较为显著，但总多糖中仍存在少量蛋白
质，我们将在以后的研究中加以改进，以期得到均一
性的长春七多糖，为后续结构和活性研究奠定良好
的基础。
我们首次发现长春七总多糖的单糖组成为甘露
糖-鼠李糖-葡萄糖醛酸-阿拉伯糖-岩藻糖;并含有一
定量的硫酸根离子，目前此结构特征的多糖尚未见
报道。目前本实验室正在进行深入的分离、结构研
究，以期得到结构新颖的均一性植物多糖，为陕西
“七药”活性成分的深入研发奠定基础。
参 考 文 献
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Study on Monosaccharide Composition and Physic-chemaical Properties
of the Polysaccharide from Libanotis Buchtorimensis (Fisch)DC．
YAN Han-wei1，LI Ping2，NI Wen-qi1，LI Wei-yan2，CAO Wei2*
(Cadet Bridge，the Fourth Military Medical University1，Department of Natural Medicine，
School of Pharmacy，the Fourth Military Medical University2，Xi’an 710032，P． Ｒ． China)
［Abstract］ To study the monosaccharide composition and physicochemaical properties of polysaccharide from Li-
banotis Buchtorimensis (Fisch)DC，the roots of Libanotis Buchtorimensis (Fisch)DC were crushed and extracted
with alcohol and water respectively． After the removal of protein and the decolorization，the pure product，polysac-
charide was obtained． The carbohydrate，uronic acid，protein content and SO2 －4 content were analyzed． The mono-
saccharide composition was measured by HPLC． The components of the polysaccharide from Libanotis Buchtorimensis
(Fisch)DC include 63. 03% total polysaccharide，9. 21% protein，6. 56% sulfate radica and 26. 39% uronic
acid． The polysaccharide fraction was mainly composed of mannose，rhamnose，glucuronic acid，arabinose and fu-
cose in the molar ratio of 17. 2∶ 1. 0∶ 18. 0∶ 38. 6∶ 16. 2.
［Key words］ Libanotis Buchtorimensis (Fisch)DC polysaccharide physicochemaical property mon-
osaccharide composition
3619 期 闫涵威，等:长春七多糖的单糖组成分析及理化性质研究