全 文 ：收稿日期:2008-09-18
基金项目:广州市科技局重点攻关项目 (2004Z3-E5021)
作者简介:赵福成 (1980-), 男 , 山东嘉祥人 , 从事特用玉米遗传育种研究工作。
注:王桂跃为通讯作者。
松果菊离体培养的比较试验
赵福成1, 2 , 杨跃生2 , 王桂跃1
(1.浙江省东阳玉米研究所 , 浙江 东阳 322100;2.华南农业大学华南药用植物研究中心 , 广东广州 510642)
摘 要:松果菊是异花授粉多年生药用植物 , 通过组织培养技术繁殖种苗具有实用价值。本研究采用 9 个
不同株系的叶片 、 叶柄和根作为外植体诱导不定芽的形成 , 观察到某些株系间在不定芽的再生能力上有显著的
差别;从总体上看 , 根的不定芽再生能力最强 , 叶柄外植体的再生能力也明显高于叶片。在诱导不定芽生根和
促进植株生长时 , 标准的MS 培养基略优于半量的 1 2 MS 培养基 , IBA的作用略优于 NAA。
关键词:松果菊;组织培养;植株再生;不定芽;克隆苗
中图分类号:S567 文献标识码:B 文章编号:0528-9017(2009)01-0077-03
松果菊是原产于美洲的一类菊科植物 , 因其头
状花序在形态上类似松果而得名 , 而别名 “紫锥
菊” 则是从其英文俗名 Purple Coneflower翻译而来
的。松果菊属植物共有 8个种及数个变种 , 均为多
年生草本植物 , 是典型的虫媒异花授粉植物 。近年
来 , 松果菊作为免疫促进剂和免疫调节剂的原料药
材 , 在国际上一直受到重视。松果菊在欧洲及其它
地区早有不同规模的引种 , 而我国引种该植物相对
较迟 , 最早也是近 10年来的事情[ 1] 。
松果菊栽培通常采用种子育苗移栽的方式。由
于松果菊种子休眠状态复杂以及异花授粉所造成的
基因型杂合性 , 栽培群体在植株形态以及生长发育
进程等方面差别明显 , 不利于田间管理工作的开
展 、 品质的稳定和产量的提高 。从这些方面考虑 ,
通过组织培养技术克隆松果菊种苗进行栽种具有实
用价值。在国外 , 对松果菊离体培养再生植株的研
究很多 , 但在某些方面的结论有较大的差别[ 2-7] ;
国内方面直到最近才有 2例实验结果报道[ 8-9] 。我
们研究中心数年前就开始了松果菊的相关研究 , 在
进行克隆种苗生产技术研究中发现各实生个体材料
外植体的离体培养反应存在显著的不同。为此 , 对
以往缺少研究的 2个侧面 , 即不同株系培养反应的
差别以及诱导不定芽根系再生的实验结果进行报道。
1 材料与方法
1.1 材料
成熟种子用常规方法进行表面灭菌。灭菌后的
种子培养在添加 30 g·L-1蔗糖的 MS无激素培养基
上 , 1个月后得到无菌实生苗。切取实生苗的各种
器官组织作为外植体接种到添加少量 BA 的培养基
上诱导不定芽的形成 , 然后在没有细胞分裂素的培
养基上诱导不定芽发根 , 形成完整植株 , 由此得到
各株系的克隆苗。以这些株系的克隆苗作为本研究
的实验材料 。
1.2 外植体制备
切取无菌克隆苗的叶片 、叶柄和根器官组织作
为外植体 。叶片切成 0.5 cm × 0.5 cm 的小方块 ,
叶柄和根均切成 0.7 cm的长度 。
1.3 培养基
诱导不定芽分化的培养基为 MS+0.5 mg·L-1
BA+0.01 mg·L-1 NAA;诱导不定芽生根的培养基
则以 MS为基础 , 通过添加激素成分和改变浓度等
进行实验比较。培养基按常规方法配制。
1.4 培养方法
外植体接种时 , 以叶片的上表面接触培养基 ,
叶柄和根外植体则随机平放在培养基上并稍加按压
使其与培养基密切接触 。每个培养瓶培养 7个外植
体 , 每个处理设 6个重复。培养环境温度 (24±2)
℃, 光照强度约为2 000 lx , 光照时间为每天 10 h。
1.5 不定芽的生根 、 炼苗和移栽
将不定芽从外植体组织上切下并转入生根培养
基上培养 。1个月后 , 取出幼苗 , 洗净根上粘附的
2009年第 1期 77
DOI :10.16178/j.issn.0528-9017.2009.01.030
培养基 , 以清水浸泡根部 , 每天换水 1次 , 3 d 后
进行移栽 。
1.6 结果的记录和评价
由于不定芽再生时间不一致 , 不定芽的质量有
很大的差别 , 如果单纯以不定芽的数量来衡量再生
效果将会造成很大的偏差 , 因此本研究以有效不定
芽的数量作为统计指标。所谓有效不定芽是指芽高
1 cm 或以上 、没有玻璃化的迹象 、 至少有2片展开
叶片的芽 , 因为这种芽容易进行分离操作以便进行
诱导生根的培养 。对于实验数据的评价 , 采用数据
统计软件 SAS 进行分析 , 各处理平均数间的多重
比较用邓肯氏新复极差测验 , 检测处理间数据差别
的显著性 。
2 结果与分析
2.1 不定芽再生培养
将9个株系 , 各 3种外植体 (叶片 、叶柄 、根)
接种于不同培养基上 , 4 d后观察到外植体在体积上
明显增大;7 d后 , 在切口附近显著膨大;14 d后在
切口处形成少量绿色愈伤组织 , 并有淡紫红色芽点
出现;45 d后 , 不定芽的形成和生长达到相对稳定
的状态 , 在这时进行实验结果记录 (表 1)。
从表1可以清楚地看出 , 不同株系间有效不定
芽的再生效率差别很大 , 有的株系间的差异达到了
显著水平 。编号为 6 、 7的株系的有效不定芽的再
生效率最高 , 而编号为 2 、 3 、 4的株系的再生效率
较低 。松果菊不同株系间不定芽再生能力的差别 ,
可以认为是异花授粉 、 基因型杂合的植物的有性后
代某些性状发生分离的具体体现 。
从表1还可以看出 , 不同外植体材料的不定芽
再生能力也存在明显的差别 , 而以根的再生不定芽
的能力最强 。到目前为止 , 几乎所有的松果菊离体
培养再生植株的研究都采用叶片和叶柄作为外植
体 , 我们用无菌苗的部分器官或组织作为外植体材
料 , 可以取得大量的外植体材料而不需要进行
灭菌。
表 1 不同株系外植体不定芽再生效率的比较
株系编号 叶片 叶柄 根 平均数
1 1.28±0.30 c 2.14±0.39 cd 2.17±0.34 de 1.86
2 1.14±0.29 c 2.27±0.29 cd 3.29±0.34 cd 2.23
3 1.35±0.34 c 1.64±0.25 cd 2.07±0.32 e 1.68
4 1.42±0.36 bc 2.14±0.38 cd 3.29±0.35 cd 1.57
5 1.29±0.28 cd 2.86±0.25 bc 4.14±0.48 c 2.76
6 2.57±0.31 a 4.07±0.41 a 5.28±0.37 ab 3.97
7 2.35±0.32 ab 3.57±0.47 ab 5.93±0.35 a 3.95
8 1.64±0.20 abc 2.07±0.32 cd 4.35±0.41 bc 2.69
9 1.92±0.38 abc 2.21±0.19 cd 2.64±0.36 de 2.26
平均数 1.07 1.64 2.41 -
注:表内 3种外植体材料对应的数据为每个外植体再生的有效不定芽的平均数±标准误;同一列内尾随不同字母表示数据之间的差异
达到显著水平。
2.2 不定芽生根
将有效不定芽由基部分割成单芽 , 转移浅插至
各种生根培养基中。在添加生长素的处理中 , 第 3
天起可以看到不定芽基部切口有白色突起 , 第 5天
看到根的萌发;没有添加生长素的处理的培养反应
则比较缓慢 , 第 8天才能够观察到根的形成 。30 d
后 , 绝大多数不定芽已经形成发达的根系 , 达到可
以移栽的程度。从表 2可以看出 , 松果菊不定芽很
容易生根 , 但在无生长素的培养基中根的生长相对
缓慢 。1 2MS 培养基中虽然形成的根比较多 , 但植
株长势不如 MS , 对后期的移栽不利 。在同等浓度
条件下 , IBA诱导生根的效果好于 NAA。
2.3 炼苗移栽
生根培养 1个月后 , 此时苗高为 5 ～ 8 cm , 可
以继续用来提供各种外植体材料进行诱导不定芽形
成的增殖培养 , 或作为克隆苗进行炼苗移栽。
根据试验结果 , 松果菊组培苗的适应性很强 ,
用于移栽的土壤不需要消毒处理 , 在保持合适湿度
的情况下 , 1周后幼苗可以恢复生长 , 成活率达
100%。
78 2009年第 1期
表 2 培养基成分对不定芽生根的影响
培养基成分 生根率 % 株平均生根数
根系
特征
植株
长势
1 2MS 93.8 2.65 细长 较差
MS 90.6 2.28 粗细适中 中等
MS+ 0.01 mg·L-1 NAA 96.8 3.31 多且粗 好
MS+ 0.01 mg·L-1 IBA 100.0 3.65 多且粗 好
注:平均生根数不包括侧根的数量。
3 小结和讨论
虽然已经有很多松果菊组织培养再生植株的报
道 , 但这些报道的研究内容基本上都集中在以叶片
为外植体材料 、 优化诱导不定芽形成的激素种类 、
浓度和组合方面 。本研究在这些报道的基础上 , 采
用了MS+0.5 mg·L-1 BA+0.01 mg·L-1 NAA 的培
养基配方 , 对不同株系和不同外植体材料的不定芽
再生能力进行了试验比较 。结果表明 , 不同株系的
材料的培养反应程度存在不同 , 同一株系不同器官
组织的材料的培养效果差别也很大 。本研究采用根
外植体直接诱导不定芽形成 , 并发现根外植体的不
定芽再生效率明显高于叶片和叶柄 , 而叶片再生不
定芽的效率最差 。结果还显示 , 外植体大小对培养
效果也有一定的影响 。单个外植体切得太大耗费材
料多 , 而再生的不定芽的绝对数量相对减少 , 特别
是叶片作为外植体材料时 , 面积大的外植体卷曲严
重 , 造成与培养基的接触面减少 , 影响外植体对培
养基成分的吸收 。外植体切得太小也不好 , 可能是
切口对外植体的损伤以及激发了更多乙烯的形成 ,
降低了外植体的活力 , 培养难以成活。
通常情况下 , 不定芽的再生数量随着培养基中
BA浓度的升高而增加 , 但高浓度的 BA 会导致再
生苗的玻璃化。本研究发现 , 尽管各株系有差别 ,
再生芽玻璃化的情况在松果菊的离体繁殖培养中相
当普遍。再生的有效不定芽的数量不是很多 , 就是
因为除去了大量玻璃化的不定芽的结果 。根据试验
结果 , 我们认为诱导不定芽再生的最适宜的培养基
为MS+BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.01mg·L-1 。在这种
激素条件下 , 多数株系不定芽的再生效率最高 , 玻
璃化程度也比较轻 。
对于种子萌发不整齐以及实生群体性状分离比
较严重的松果菊来说 , 从栽培群体中选择离体培养
繁殖特性好 、田间栽培抗性强和生长量大以及药用
成分含量高的株系进行种苗克隆生产 , 具有重要的
实用意义。本研究以诱导不定芽生根 , 再用再生苗
提供各种外植体进行离体培养繁殖的方式 , 为进行
松果菊种苗的工厂化生产提供了一条新的思路 。
参考文献:
[ 1] 王雅玲 , 屠鹏飞 , 谢雪梅.紫锥菊在北京地区的引种 [ J] .中
国中药杂志.1999 , 24(10):590-592.
[ 2] Choffe K L , Victor J M R , Murch S J , et al.In vitro regeneration
of Echinacea L.:Direct somatic embryogenesis and indirect shoot
organogensis in petiole culture [ J] .In Vitro Cell Dev Biol Plant ,
2000 , 36:30-36.
[ 3] Harbage J F.Micropropagation of Echinacea angustifolia , E pallida
and Epurpurea f rom stem and seed explants [ J] .Hortscience ,
2001 , 36 (2):360-364.
[ 4] Koroch A , Juliani H R , Kapteyn J , et al.In vitro regeneration of
Echinacea purpurea f rom leaf explants [ J] .Plant Cell Tissue Organ
Culture , 2001 , 69:79-83.
[ 5] Lakshmanan P , DaneshM , Taji A.Production of four commercially
cultivated Echinacea species by different methods of in vitro
regeneration [ J] .J Horticult Sci Biotechnol , 2002 , 77:158-
163.
[ 6] Mechanda S M , Baum B R.Direct shoot regeneration f rom leaf
segments of mature plants of Echinacea purpurea (L)Moench [ J] .
In vitro Cell and Dev Biol , 2003, 39 (5):505-509.
[ 7] Sauve R J , Mmbaga M T , Zhou S P.In vit ro regeneration of the
Tennessee coneflower(Echinacea Tennesse)[ J] .In Vit ro Cell Dev
Biol Plant , 2004 , 40 (3):325-328.
[ 8] 刘军 , 彭菲.紫锥菊的组织培养和植株再生 [ J] .植物生理
学通讯 , 2004 , 40 (5):577.
[ 9] 王伯初 , 刘万钱 , 段传人.紫锥菊的组织培养及其实用快速
繁殖 [ J] .重庆大学学报 , 2005 , 28(5):120-122.
(责任编辑:夏起洲)
赵福成 , 等:松果菊离体培养的比较试验 79