全 文 ： 采用酿酒酵母检验黑胡椒挥发油抗氧化活性
张玲玲1，张 鹏 2，李世明 3，赵 辉 1,*
（1.天津市食品与生物技术重点实验室，天津商业大学，天津市 300134；2.海南大学环境与
植物保护学院，海南省 海口市 570228；3.湖北省经济林种质资源改良与资源重点实验室，
黄冈师范学院，湖北省 黄冈市 438000）
摘 要：采用超临界 CO2流体萃取技术提取黑胡椒挥发油（Black pepper oil, BPO），应用气相色谱-质谱联
用（GC-MS）技术对 BPO 进行分析，采用 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法和还原能力法
对 BPO 进行了体外抗氧化活性检验，并且采用酿酒酵母对 BPO 进行体内抗氧化活性检验。结果表明 BPO
主要成分为胡椒碱（40.2%），BPO 对 DPPH 自由基的清除能力和还原能力略低于二丁基羟基甲苯（BHT）
和抗坏血酸（Vc）。而且 BPO 不同程度地提高了 CCl4、H2O2 和 CdSO4 应激下酵母细胞的存活率；较明显
地降低了氧化应激下酵母细胞内氧化和膜脂质过氧化水平。而且数据还表明 BPO 抵抗脂质过氧化的机制很
有可能与基因 CTT1 编码的过氧化氢酶有关。
关键词：黑胡椒挥发油；抗氧化；酿酒酵母；脂质过氧化；细胞内氧化

Using saccharomyces cerevisiae to test the antioxidant activity of black pepper oleoresin
ZHANG Lingling1, ZHANG Peng2, ZHAO Hui1, *
(1. Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology, School of Biotechnology and Food
Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134.;
2. College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou, Hainan, 570228;
3. Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization,
Huanggang Normal University, Huanggang, Hubei 438000)
Abstract: Black pepper oleoresin (BPO) was extracted using Supercritical CO2 fluid extraction technology, and
analyzed with the technology of GC-MS. The antioxidant activity of BPO were studied with the DPPH free radical
scavenging assay and reducing capacity assay. In addition, saccharomyces cerevisiae was used to detect the
antioxidant activity in vivo. The results indicated the main ingredient of BPO was piperine (40.2%). And the
ability to scavenge DPPH free radical and its reducing capacity was obvious, though it was a bit lower than BHT
and Vc. The survival rates of saccharomyces cerevisiae stressed with CCl4、H2O2 and CdSO4 were enhanced by
BPO inordinately, and obviously decreased the levels of cellular oxidation and lipid peroxidation. Eventually the
results showed the mechanisms of BPO against lipid peroxidation involved the catalase T.
Key words: Black pepper oleoresin, antioxidant, saccharomyces cerevisiae, lipid peroxidation, cellular oxidation

黑胡椒，胡椒科植物胡椒 Piper nigrum L.(PN)，是一种开花藤本植物，主要生长在高温和湿润的
地区，在我国主要种植在海南省。黑胡椒果实晒干之后通常作为香料和调味料使用。黑胡椒经过超临
界流体或者水蒸馏法提取可以得到 BPO。 BPO 含有丰富的天然活性产物，在食品和饮料加工等方面
被广泛使用[1]。由于富含胡椒碱和挥发油成分（水芹烯、柠檬烯、石竹烯和 β-蒎烯等）等风味物质，
因而具有强烈芳香和刺激性辣味，BPO 兼有除臭、杀菌作用，还可以促进胃肠蠕动，加速血液循环[2]。
最近几年关于 BPO 抗氧化的研究越来越多，研究方法主要基于 BPO 总体抗氧化能力、清除超氧阴离
子自由基能力、清除羟基自由基能力、铁离子还原能力和抗亚油酸脂质过氧化能力等几种检测体系上

收稿日期：2016-03-07
基金项目：国家自然科学基金项目（31571832）；国家自然科学基金项目（81172837）；天津市农产品加
工新工艺及相关机理研究创新团队(TD12-5049)
作者简介：张玲玲（1992-），女，硕士，研究方向为发酵工程，E-mail：Tjcu408@Gmail.com
*通讯作者：赵辉,男，副教授，博士，研究方向为生物制药，E-mail：zhaohui@tjcu.edu.cn
网络出版时间：2016-06-07 14:23:45
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2206.TS.20160607.1423.036.html

[2]，而这些体外检测体系只能初步的评价 BPO 的抗氧化能力，很难表征 BPO 在生物体内的抗氧化能
力。
酿酒酵母（S．cerevisiae）广泛应用于酿酒、食品和饮料加工，同时也是一种被广泛应用的真核
模式生物。人体中很多具有重要生物学意义的蛋白，如细胞周期蛋白、信号蛋白和蛋白形成酶等在酿
酒酵母细胞内都存在。许多研究发现酵母基因与许多涉及人类遗传性疾病的基因有很高的同源性，因
此通过研究这些基因及其编码的蛋白的生理功能及它们与其他蛋白的相互作用能极大地帮助我们了
解这些疾病，以便更有效更方便的对相关疾病进行防治[3,4]。酵母细胞和人体细胞的抗氧化机制相似，
而且酵母生长代谢规律短暂，这些使得酵母成为抗氧化研究的新模式生物[5]。
大量的研究发现，代谢紊乱产生的活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）是引起心脑血
管疾病、阿兹海默症、II-型糖尿病和肥胖等疾病的重要因素，而这些疾病已经严重影响了人类的身体
健康。ROS 和 RNS 在细胞内可以引起蛋白变性，膜脂质过氧化和 DNA 损伤，最终导致细胞死亡[6-8]。
为了保护人类健康，新型的天然抗氧化剂的开发和利用越来越成为人们关心的热点。本实验采用真核
模式生物 S．cerevisiae 野生型及其同源性基因缺陷型菌株 sod1, ctt1, gsh1, gtt1 和 gtt2 在 H2O2、CCl4
和 CdSO4氧化应激下对 BPO 进行体内抗氧化活性检验，探索 BPO 在酵母体内的抗氧化活性，为后续
的功能食品和保健品开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂
试剂：琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；LP0021 YEAST EXTRACT, OXOID; PEPTONE,
D-GLUCOSE, AMRESCO; Glass beads acid-Washed, Solarbio; 三氯乙酸（分析纯），成都市科龙化工试
剂厂。抗坏血酸（Vc），2,6-二叔丁基对甲酚（BHT），乙二胺四乙酸（EDTA），H2O2，CCl4，CdSO4
等其他试剂均为分析纯。
野生型（WT）Saccharomyces cerevisiae BY4741 (MATa, his3, leu2, met15 和 ura3) 及其同源性基
因缺陷型菌株 sod1, ctt1, gsh1, gtt1 和 gtt2 由巴西南卡希亚斯大学的教授 D. PEREIRA 赠送。（sod1 编
码细胞质超氧化物歧化酶；ctt1 编码过氧化氢酶 T；gsh1 编码谷胱甘肽；gtt1 和 gtt2 是编码谷胱甘肽
硫转移酶的同工酶）。
1.2 仪器与设备
P300 超微量分光光度计，IMPLEN；Legend micro 17R 离心机，Thermo；LH-12 型固液两用超临
界萃取制备系统，青岛利和萃取科技有限公司；Agilent 7890/5975C-GC/MSD 气质联机检测设备，安
捷伦科技有限公司；SW-CJ-1F 型单人双面净化工作台、BLB-1000 洁净工作台，苏净集团苏州安泰空
气技术有限公司；HK-180 不锈钢万能粉碎机，广州旭朗机械设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 BPO 的提取
取黑胡椒样品，干燥后粉碎，过 20 目筛。取 400 g 黑胡椒粉末与萃取釜中，以 CO2作为萃取介
质，通过高压泵持续打压，使 CO2达到 7.35 MPa、分离温度 35-40 ℃环境，萃取 2 h 后从分离釜中
收集萃取物，得黑褐色稠膏状物，称重， 计算收率。
1.3.2 供试样品溶液制备
取 1 g 黑胡椒超临界萃取物，加 10 mL 无水乙醇溶解，摇匀得到 100 mg/mL 的母液。
1.3.3 GC-MS 分析条件
色谱条件：色谱柱 HP-5 毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm），升温程序：初始温度为 60 ℃，10 ℃
/min 升温至 130 ℃，保持 5min，10 ℃/min 升温至 180 ℃。保持 3min，20 ℃/min 升温至 270℃，保
持 5 min 结束。载气为高纯氦气，流速为 1 mL/min。分流比 20：1，溶剂延迟 3 min。
质谱条件，EI 离子源，电离能 70 eV, 离子源温度 230 ℃，界面温度 250 ℃，质量扫描范围范围 m/z

50-550。
1.3.4 清除 DPPH 自由基的测定
本实验参考并优化了 Joshi R 等人的方法[9]。用无水乙醇分别配置浓度为 0，1.0，1.5，2.0，2.5，
3 mg/mL 的 BPO 溶液，2 mg/mL 的 BHT 溶液和 Vc 溶液作为样品溶液。然后将 2 mL 样品溶液和 2 mL
DPPH 溶液（1.0×10-4 mg/mL）混合，混匀后暗处理 0.5 h, 以无水乙醇作参比，测定 517 nm 处的吸
光值 A，测定 2 mL 样品溶液和 2 mL 无水乙醇混合后溶液在 517 nm 处的吸光值 A0，同时测定 2 mL
DPPH 溶液与 2 mL 无水乙醇混合液在 517 nm 处的吸光值 A1。根据下面公式计算清除率。

式中：A1 为 DPPH 与无水乙醇混合液的吸光度；A0 为样品与无水乙醇混合液的吸光度；A 为样
品与 DPPH 混合液的吸光度。
1.3.5 还原能力测定
BPO 还原能力测定参考并优化了李慎新等人的测定方法[10]。取 2.5 mL 样品溶液，2.5 mL 磷酸缓
冲溶液（0.2 mol/L，pH=6.6）和 2.5 mL 铁氰化钾溶液（1 % w/v）混合，摇匀之后放置于 50 ℃水浴
20 min，迅速冷却。再加入 2.5 mL 三氯乙酸（10% w/v），3000 r/min 离心 10 min，取上清液 2.5 mL，
分别加入 2.5 mL 蒸馏水及 0.5 mL 三氯化铁溶液（0.1% w/v），混合均匀。 静置 10 min 后，于 700 nm
波长测定其吸光度。平行测定三次，吸光度越大表示待测样品的还原能力越强。
1.3.6 BPO 对酵母细胞在氧化应激胁迫下存活率的影响
通过平板涂布法测定酵母的存活率来检测 BPO 的抗氧化活性[11]。挑取单菌落接种于液体 YPD 培
养基中，28 ℃，200 rpm 摇床过夜培养。用无菌生理盐水调 OD600=1 的细胞悬浮液。取 1 mL 细胞
悬液转移至 9 mL 含有不同浓度样品（25、50 ug/mL）的新鲜液体 YPD 培养基中，涡旋振荡 15s 后，
28 ℃，200 rpm 摇床培养 2 h。然后，在培养液中分别加入 H2O2、CCl4和 CdSO4, 终浓度分别达到 2.0
mM、10 mM 和 2.5 mM。涡旋振荡 15s 后，摇床培养 1h。取各处理的酵母细胞悬液，分别稀释 1000
倍，取稀释后的细胞悬液 100 µL 均匀涂布在固体 YPD 培养基中。放置于生化培养箱中，28 ℃，倒
置培养 72h。计数菌落个数，每个处理方法做 3 个平行试验。
1.3.7 BPO 对酵母细胞的脂质过氧化水平的影响
采用硫代巴比妥酸（Thiobarbituri acid, TBA）法测定脂质过氧化水平[11]。取 OD600=1 的酵母细
胞悬浮液 1 mL 转移至 9 mL 含有不同浓度样品（25、50 ug/mL）的新鲜液体 YPD 培养基中，培养 2 h
后，分别加入 H2O2、CCl4 和 CdSO4, 终浓度分别达到 2.0 mM、10 mM 和 2.5 mM。继续培养 1 h 后，
将酵母细胞培养液离心，弃上清，取沉淀，洗涤 2 次。取 50 mg 细胞沉淀重新悬浮在 0.5 mL 三氯乙
酸（10% w/v）中，加入 1.5 g 酸洗玻璃微珠。使用涡旋振荡器振荡破碎细胞。然后离心，取上清，加
入 0.1 mL EDTA (0.1M), 0.6 mL 巴比妥酸 (1% w/v)。将上述混合物沸水浴 15 min，然后迅速冰浴，待
其冷却后，532 nm 处测定的吸光度值。每个处理三个平行试验。
1.3.8 BPO 对酵母细胞的细胞内氧化水平的影响
通过 2′7′—二氯二乙酸酯荧光探针法测定酵母细胞内过氧化水平，参考并优化 Dani C 等人的方法
[11]。取 OD600=1 的酵母细胞悬浮液 1 mL 转移至 9 mL 含有不同浓度样品（25、50 ug/mL）的新鲜液
体 YPD 培养基中，培养 2 h 后，分别加入 H2O2、CCl4 和 CdSO4, 终浓度分别达到 2.0 mM、10 mM
和 2.5 mM。培养 1 h 后，加入 40 uL 2′7′—二氯二乙酸酯探针溶液（5 mM），继续培养 15 min 后，将
酵母细胞培养液离心，弃上清，取沉淀，洗涤 2 次，加入 50 mL 去离子水和 1.5 g 酸洗玻璃微珠后涡
旋破碎细胞。然后 25000 rpm 离心 5 min，取上清 150uL，加入 750 uL 去离子水（稀释 6 倍），混匀后，
去 200 uL 混合液加入 96 孔黑色微孔板，置于酶标仪中，在激发光 504 nm 和发射光 524 nm 处测定吸
光度值。每个处理三组平行


2 结果与分析

2.1 BPO 的 GC-MS 分析结果
从黑胡椒超临界 CO2萃取物中，共分离得到 29 个组分，其中以胡椒碱含量（40.2%）为最高，接
下来是石竹烯（8.7%）、D-柠檬烯（7.2%）、3-蒈烯（3.4%）和 α-水芹烯（3.0%）（表 1）。胡椒中的
主要活性物质是胡椒碱( piperine)，它属于桂皮酰胺类生物碱，是胡椒中的特征性辣味成分，具有抗氧
化、抗肿瘤、促进药物代谢等作用，此外还具有镇静催眠和抗抑郁等效果，对炎症和疼痛的发生也有
一定的缓解效果[12-14]。王勇等人的研究表明超临界 CO2萃取得到的 BPO 能最大限度地保留胡椒中的
有效成分，而且对胡椒碱的提取率可高达 65.79%[15,16]。最新的研究表明胡椒碱有可能通过影响树突细
胞的迁移和功能来治疗树突细胞诱发的自身抗原和移植抗原病变[17]。胡椒碱可以通过激活 IL-1β,
MMP-8 和 MMP-13 的表达来抑制发炎，牙周骨质丢失，骨微观结构和胶原纤维退化等[18]。而且胡椒
碱可以通过调节 NF-κB 通路改善脂多糖诱导的急性肺损伤[19]。可见胡椒碱的生物活性是很高的，其
应用范围在不断的拓展，不断的开发胡椒碱对人类健康带来极大的好处。
表 1 黑胡椒 CO2 超临界萃取物的化学成分
Table.1 Chemical component of BPO extracted by Supercritical CO2 extraction
No. 化合物 分类 匹配度/% RT/min Relative content/%
1 桧烯 烯类 90 5.25 1.1
2 α-水芹烯 萜类 94 5.84 3.0
3 α-蒎烯 萜类 91 5.94 2.1
4 4-蒈烯 烯类 87 6.19 0.5
5 3-蒈烯 烯类 92 6.34 3.4
6 D-柠檬烯 萜类 93 6.64 7.2
7 育亨宾 酯类 72 7.71 1.2
8 丙咪嗪 二苯并类 76 9.40 0.9
9 环己烯 烯类 70 11.00 0.7
10 1,2,3,4,4a,7 — 六 氢 —
1,6—二甲基—4—（1
—甲基乙基）奈
萘类 89 11.19 0.2
11 荜澄茄油烯 烯类 93 11.64 2.2
12 石竹烯 萜类 82 12.27 8.7
13 α-石竹烯 萜类 57 12.75 0.4
14 雪松烯 烯类 76 13.25 0.7
15 甜没药烯 烯类 83 13.30 0.5
16 杜松萜烯 萜类 89 13.48 1.1
17 α-愈创木烯 杂环类 92 14.90 0.2
18 1,2,3,4,4a,7,8,8a- 八 氢
-1,6-二甲基-4-（1-甲
基乙基）-1-萘酚
萘类 84 15.11 0.9
19 十六烷酸 烷烃类 74 18.56 1.0
20 油酸乙酯 酯类 83 20.21 2.1
21 硬脂酸 脂肪酸类 59 20.43 0.8
22 亚油酸乙酯 酯类 69 21.03 0.5
23 2,2-亚甲基双-(4-甲基
-6-叔丁基苯酚)
含苯环类 77 22.47 0.6

24 间苯氧基苯甲醛 含苯环类 81 24.24 0.4
25 4-硝基苯基-3-茴香酸
乙酯
酯类 92 24.54 1.4
26 9-十八烯酸-2-（十八烷
氧基）乙酯
酯类 81 25.50 1.5
27 去甲吗啡 含苯环类 49 27.32 0.3
28 胡椒碱 哌啶类 97 27.81 40.2
29 2,4,6,8-十四四烯酸-9-
甲酰-10-氧乙酯
酯类 74 28.44 0.8

Total 84.6


2.2 BPO 清除 DPPH 自由基
DPPH 自由基清除法是目前广泛被接受的一种测定生物样品体外抗氧化能力的方法。DPPH 在有
机溶剂中形成紫红色、稳定的自由基，与抗氧化剂反应生成无色产物，导致溶液的特征吸收峰下降，
吸光值变小。
BPO、BHT 和 Vc 三种抗氧化剂的抗氧化活性如表所示。由表 2 可以看出，BPO 的抗氧化活性随
着浓度的增加而增加，BPO 的自由基清除能力略低于 Vc 和 BHT。当浓度都为 1 mg/mL 时，BPO 对
自由基的清除能力大约相当于 Vc 的 56%和 BHT 的 66%。莫峥嵘等人的研究表明，胡椒碱对 DPPH
的清除能力大约相当于 Vc 的 60.5%[20]。表 1 表明 BPO 中胡椒碱的含量为 40.2%，以 Vc 作为参比，
推算胡椒碱在 BPO 清除 DPPH 自由基的反应中贡献大约 43%的清除能力。此外，还有研究表明柠檬
烯等挥发性物质也具有较强的 DPPH 自由基清除能力[21]。
表 2 BPO 对 DPPH 的清除率
Table.2 The activity of scavenging DPPH of BPO
Treatment 浓度 (mg/mL) 清除率 (%)


BPO
0.5 38.950.32
0.75 48.310.55
1.0 53.260.43
1.25 65.020.27
1.5 70.970.30
BHT
VC
1.0
1.0
80.870.14
94.010.23

2.3 BPO 还原能力测定
还原能力是表示抗氧化剂提供电子能力的重要指标，它可以通过提供电子来中断自由基的连锁反
应，使自由基变为稳定的物质。因此，还原能力与抗氧化能力存在着联系[22]。
BPO 的还原能力测定结果如图 1 所示：Vc 和 BHT 在 0.0-1.0 mg/mL 浓度范围内呈显著的量效关
系；BPO 在 0.0-2.0 mg/mL 浓度范围内也表现出显著的量效关系。它们的还原能力为: BHT>Vc>BPO。
当 BPO 浓度达到 2.0 mg/mL 时的还原能力略高于浓度 1.0 mg/mL BHT 的还原能力。

图 1 BPO 的还原能力
Figure.1 The reducing capacity of BPO

2.4 BPO 对酵母细胞氧化应激压力下的保护作用
图 2 表明，H2O2 对于所有酵母菌株毒性最高，直接应激下各株酵母菌的存活率均低于 20%，接
下来是 CCl4和 CdSO4。由于 H2O2在体内产生最毒和活性最高的反应性羟基自由基，而有机体对于过
量的羟基自由基几乎没有抵抗力，因此酵母细胞对于 H2O2 的耐受性较低。大量的研究表明，过氧化
氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等自由基清除酶系是细胞抵抗氧化损伤的第一道屏障；像
GSH 等细胞内非酶系清除物质构成第二道防护屏障[23-25]。数据表明，BPO 对于各株酵母细胞在三种
氧化应激下均有不同程度的保护作用，对 CdSO4应激下 GSH 基因缺陷型存活率提高最明显（图 2 A），
表明 BPO 在抵抗 CdSO4对细胞氧化作用时，与 GSH 的作用关系不是很明显。由于 BPO 是混合物，
在细胞内发挥抗氧化作用的机制是多样的，因此对各株酵母均表现出保护作用。在 H2O2 应激下，对
SOD1 基因缺陷型的保护作用最明显（图 2 B），SOD1 在细胞内的主要作用是将超氧阴离子（O2-）转
化为 H2O2，因此在抵抗 H2O2氧化损伤时与 SOD1 酶的关系相对较小；只有 H2O2应激时，SOD1 基因
缺陷型的存活率明显高于 WT 型，这有可能与其他抗氧化系统的代偿性过表达有关。一些研究表明当
缺乏一种抗氧化体系时，机体其他抗氧化体系的过表达反而提高了机体的抵抗效果[26,27]。
2.5 BPO 对酵母脂质过氧化水平和细胞内氧化水平的影响
自由基在细胞内攻击的第一个目标是生物膜，导致膜脂质过氧化，进而引起细胞泄露甚至死亡。
表 3 表明，CCl4、H2O2和 CdSO4这三种氧化应激均增加了 WT、SOD1 和 CTT1 型酵母细胞的脂质过
氧化水平，而且 BPO 展现出对生物膜氧化损伤不同程度的保护作用。由于 BPO 对其他几株基因缺陷
型酵母细胞脂质过氧化和细胞内氧化的保护作用无明显特征性，所以未列出讨论。数据表明，H2O2
对各株酵母细胞造成的脂质过氧化损伤是最高的，这与H2O2应激下酵母细胞存活率最低相一致。 CCl4
应激下，BPO 降低 SOD1 基因缺陷型酵母细胞脂质过氧化的程度较明显，这说明 BPO 在抵抗 CCl4
损伤时可能与 SOD1 酶的关系较小。
H2O2 应激下，BPO 对 CTT1 基因缺陷型酵母细胞脂质过氧化水平降低程度偏弱，这说明缺乏过
氧化氢酶对酵母细胞抵抗脂质过氧化影响较大，也说明 BPO 对酵母的保护机制与过氧化氢酶的关系
较大。
由于 BPO 具有一定的体外自由基清除活性，实验中进一步通过荧光探针法测定酵母细胞内氧化
水平，这将有助于说明 BPO 是否是通过降低细胞内活性氧自由基的浓度来提高酵母对氧化应激的耐
受性。2′7′—二氯二乙酸酯荧光探针一旦进入细胞，就会被 ROS 攻击，产生荧光强度更大的化合物，
这种探针已经广泛应用于评估氧化应激后 ROS 的增强[28]。

表 4 表明 WT 和 CTT1 型酵母细胞直接暴露于 H2O2和 CCl4中，细胞内氧化水平会明显的增高，
H2O2应激下细胞内氧化水平最高，这与前面 H2O2应激下各株酵母细胞存活率最低和膜脂质过氧化水
平最高相对应。BPO 能降低 H2O2和 CCl4应激下的酵母细胞内 ROS 水平。CdSO4对于酵母细胞内氧
化水平影响很弱，这说明 CdSO4可能不是通过增加细胞内 ROS 水平来发挥毒性作用的。
CCl4、H2O2和 CdSO4应激对酵母细胞均能引起损伤。CCl4和 H2O2产生自由基，并且能提高细胞
内氧化水平；而且这三种应激均能攻击生物膜，导致膜脂质发生过氧化反应，影响膜脂质的完整性和
功能性[26,29,30]。同时 BPO 有可能是通过降低酵母细胞膜脂质过氧化和细胞内 ROS 水平来提高各株酵
母对于氧化应激的耐受性，进而提高应激状态下酵母存活率。


图 2 BPO 对氧化应激下酵母细胞的耐受性保护作用
Figure. 2 BPO increased oxidative stress tolerance in S. cerevisiae
注：图中 A、B 和 C 分别是是 CdSO4、H2O2和 CCl4应激下各株酵母的存活率，以未应激对照组酵母细胞
的存活率为 100%，灰色代表直接应激组，黑色和白色分别代表采用 25 和 50 ug/mL BPO 前处理组。图 D
是 BPO 对各株酵母的毒性测试，灰色、黑色和白色分别代表 0、50 和 100 ug/mL BPO 处理组。不同字母代
表显著性差异 p  0.05。
表 3 BPO 对酵母脂质过氧化水平的影响
Table. 3 Effect of BPO on lipid peroxidation
Stress Treatment WT SOD1 CTT1
CCl4 without extract 1.7±0.1man 1.9±0.2a 1.7±0.1a
BPO extract 1.3±0.1bc 1.1±0.1c 1.4±0.1b
H2O2 without extract 3.0±0.1a 2.4±0.1c 2.6±0.1b

BPO extract 2.1±0.1d 1.6±0.2f 2.3±0.1c
Cd+ without extract 1.4±0.1a 1.3±0.2b 1.4±0.1a
BPO extract 1.1±0.1c 1.1±0.1c 1.0±0.1c
注：m 酵母细胞脂质过氧化水平的结果是以应激后 BPO 处理或者未处理的过氧化水平与对照未应激组过氧
化水平的比值来表示的。数据以“平均值±标准差”来表示。n每一氧化应激组通过 Duncan 法分析来确定
显著性差异（不同的字母表示显著性差异 p  0.05)。
表 4. BPO 对酵母细胞内氧化水平的影响
Table. 4 Effect of BPO on cellular oxidation level
Stress Treatment WT CTT1

CCl4 without extract 2.5±0.1mbn 2.0±0.1c
BPO extract 1.9±0.1c 2.9±0.1a
H2O2 without extract 7.0±0.3a 6.5±0.2a
BPO extract 3.6±0.4c 5.9±0.1b
Cd+ without extract 1.2±0.1a 1.3±0.1a
BPO extract 1.0±0.1b 0.9±0.1b
注：m 酵母细胞内氧化水平的结果是以应激后 BPO 处理或者未处理的细胞内氧化水平与对照未应激组细胞
内氧化水平的比值来表示的。数据以“平均值±标准差”来表示。n每一氧化应激组通过 Duncan 法分析来
确定显著性差异（不同的字母表示显著性差异 p  0.05)。

3 结论
本研究，通过人为添加氧化剂（H2O2、CCl4 和 CdSO4）诱导酵母细胞产生一连串的氧化应
激反应。酵母细胞对于不同氧化剂的应激机制是不同的，相关的蛋白表达和抗氧化体系表达也有
所差异。通过分析不同基因缺失型酵母在应激条件下表现出的存活率、脂质过氧化和细胞内氧化
水平，我们可以推断出酵母对于不同应激情况下所依赖的抗氧化体系。而且使用 BPO 前处理酵
母细胞后，相同应激条件下，不同基因缺失型酵母表现出抗氧化活性差异。进一步分析数据，我
们可以推断 BPO 在酵母细胞内发挥抗氧化作用所依赖的抗氧化体系。由于酵母细胞与人体细胞
具有较高的同源性，这对 BPO 进一步在人体内的作用机制研究提供较可信的证据。
实验中，采用超临界 CO2流体萃取得到的 BPO，提取率为 7.3%。通过 GC-MS 联用技术分
析结果可知，BPO 的主要成分为胡椒碱（40.2%）、石竹烯（8.7%）、D-柠檬烯（7.2%）、3-蒈烯
（3.4%）和 α-水芹烯（3.0%），总共占 BPO 的 62.5%。体外抗氧化活性检验表明，BPO 对 DPPH
自由基的清除率略低于 BHT 和 Vc，而且 BPO 的还原能力也略低于 BHT 和 Vc，但随着 BPO 浓
度的升高，其还原能力达到了 Vc 的水平。采用模式生物酿酒酵母在 CCl4、H2O2和 CdSO4应激
下检测 BPO 的抗氧化活性，数据表明 BPO 不同程度的提高各株酵母在氧化应激下的存活率。数
据还表明 BPO 抵抗脂质过氧化的机制很有可能与基因 CTT1 编码的过氧化氢酶有关。体外和体
内的实验数据均表明黑胡椒超临界 CO2 流体萃取物具有较强的抗氧化活性，这为进一步拓展黑
胡椒在食品、药品及人类健康方面的应用提供了较重要的依据。

参考文献：
[1] 回瑞华，侯冬岩，李铁纯，等.固相微萃取-气相色谱-质谱法分析黑胡椒挥发性成分[J]. 内蒙古民族大学学报, 2009,
15(4):66-68. DOI: 10.3969/j.issn.1008-5149.2009.04.031.

[2] 王颖，姜子涛，李荣,等.黑胡椒和白胡椒精油抗氧化性能及清除自由基能力的比较[J]. 中国调味品，2009，05:50-53+58. DOI:
10.3969/j.issn.1000-9973.2009.05.008
[3] Walker L J, Aldhous M C, Drummond H E, et al. Anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies (ASCA) in Crohns disease are
associated with disease severity but not NOD2/CARD15 mutations[J]. Clinical & Experimental Immunology, 2004, 135(3):
490-496. DOI: 10.1111/j.1365-2249.2003.02392.x
[4] Moyad M A. Brewers/bakers yeast (Saccharomyces cerevisiae) and preventive medicine: Part II[J]. Urologic nursing, 2008, 28(1):
73.
[5] 王郅媛,王友升,李丽萍. 抗衰老研究新模型—酵母细胞活性氧代谢研究进展[J]. 食品科学,2012, 07:354-358.
[6] Fiocchetti M, Camilli G, Acconcia F, et al. ERβ-dependent neuroglobin up-regulation impairs 17β-estradiol-induced apoptosis in
DLD-1 colon cancer cells upon oxidative stress injury[J]. The Journal of steroid biochemistry and molecular biology, 2015, 149:
128-137. DOI: 10.1016/j.jsbmb.2015.02.005
[7] Bhargava S, Ali A, Kankra M, et al. Differential expression of lipid peroxidation and total antioxidant status in Indian patients with
cardiovascular and cerebrovascular disease 1[J]. Canadian journal of physiology and pharmacology, 2014, 92(7): 592-597. DOI:
10.1139/cjpp-2013-0481
[8] Zimmerman M T, Bayse C A, Ramoutar R R, et al. Sulfur and selenium antioxidants: Challenging radical scavenging mechanisms
and developing structure–activity relationships based on metal binding[J]. Journal of inorganic biochemistry, 2015, 145: 30-40. DOI:
10.1016/j.jinorgbio.2014.12.020
[9] Joshi R, Kamat J P, Mukherjee T. Free radical scavenging reactions and antioxidant activity of embelin: biochemical and pulse
radiolytic studies[J]. Chemico-biological interactions, 2007, 167(2): 125-134. DOI: 10.1016/j.cbi.2007.02.004
[10] 李慎新，曹新志，钟俊波，等.几种中草药抗氧化性成分的还原能力及总酚含量比较研究[J]. 安徽农业科学，2008，
29:12755-12756. DOI: 10.3969/j.issn.0517-6611.2008.29.094
[11] Dani C, Bonatto D, Salvador M, et al. Antioxidant protection of resveratrol and catechin in Saccharomyces cerevisiae[J]. Journal
of agricultural and food chemistry, 2008, 56(11): 4268-4272. DOI: 10.1021/jf800752s
[12] 廖红波，刘屏，胡园，等.胡椒碱的抗抑郁及神经保护作用研究[J]. 中国中药杂志，2009，12:1562-1565.
[13] 刘红，赵建平，谭乐和.胡椒碱的研究进展[J]. 中国调味品，2008，10:33-36. DOI: 10.3969/j.issn.1000-9973.2008.10.003
[14] 刘 屏 ， 索 婧 侠 ， 于 腾 飞 . 胡 椒 碱 药 理 作 用 的 研 究 进 展 [J]. 中 国 药 物 应 用 与 监 测 ， 2007 ， 03:7-9. DOI:
10.3969/j.issn.1672-8157.2007.03.003
[15] 王勇，魏娜，李洪福，等.海南黑胡椒超临界萃取物中化学成分的 GC-MS 分析[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，12:121-123.
[16] 陈建华，翁少伟，李忠，等.超临界 CO_2 萃取黑胡椒中有效成分的研究[J]. 精细化工，2010，10:991-995+1030.
[17] Rodgers G, Doucette C D, Soutar D A, et al. Piperine impairs the migration and T cell-activating function of dendritic cells[J].
Toxicology letters, 2016, 242: 23-33. DOI: 10.1016/j.toxlet.2015.11.025
[18] Dong Y, Huihui Z, Li C. Piperine inhibit inflammation, alveolar bone loss and collagen fibers breakdown in a rat periodontitis
model[J]. Journal of periodontal research, 2015, 50(6): 758-765. DOI: 10.1111/jre.12262
[19] Lu Y, Liu J, Li H, et al. Piperine Ameliorates Lipopolysaccharide-Induced Acute Lung Injury via Modulating NF-κB Signaling
Pathways[J]. Inflammation, 2015: 1-6. DOI: 10.1007/s10753-015-0250-x
[20] 莫峥嵘，张岐.胡椒碱的抗氧化活性及稳定性研究[J]. 海南师范学院学报(自然科学版)，2006，01:52-54. DOI:
10.3969/j.issn.1674-4942.2006.01.016
[21] 陈思佳，刘雅丽，张晨，等.柠檬精油抗氧化活性的研究[J]. 实用口腔医学杂志， 2015， 03:343-346. DOI:
10.3969/j.issn.1001-3733.2015.03.010
[22] 马玲，彭登峰，李慧，等.不同菌种组合 Mozzarella 干酪成熟过程中提取液的抗氧化活性[J]. 中国农业科学，2013，
12:2615-2624. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.12.024
[23] Halliwell B. Biochemistry of oxidative stress[J]. Biochemical Society Transactions, 2007, 35(5): 1147-1150. DOI:
10.1042/BST0351147
[24] Jamieson D J. Oxidative stress responses of the yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. Yeast, 1998, 14(16): 1511-1527. DOI:

10.1002/(SICI)1097-0061(199812)14:16<1511
[25] Penninckx M J. An overview on glutathione in Saccharomyces versus non-conventional yeasts[J]. FEMS yeast research, 2002, 2(3):
295-305. DOI: 10.1016/S1567-1356(02)00081-8
[26] Fernandes P N, Mannarino S C, Silva C G, et al. Oxidative stress response in eukaryotes: effect of glutathione, superoxide dismutase
and catalase on adaptation to peroxide and menadione stresses in Saccharomyces cerevisiae[J]. Redox Report, 2007, 12(5): 236-244.
DOI: 10.1179/135100007X200344
[27] França M B, Panek A D, Eleutherio E C A. The role of cytoplasmic catalase in dehydration tolerance of Saccharomyces cerevisiae[J].
Cell stress & chaperones, 2005, 10(3): 167-170. DOI: 10.1379/CSC-103R.1
[28] Rota C, Fann Y C, Mason R P. Phenoxyl Free Radical Formation during the Oxidation of the Fluorescent Dye 2′,
7′-Dichlorofluorescein by Horseradish Peroxidase possible consequences for oxidative stress measurements[J]. Journal of Biological
Chemistry, 1999, 274(40): 28161-28168. DOI: 10.1074/jbc.274.40.28161
[29] Brennan R J, Schiestl R H. Chloroform and carbon tetrachloride induce intrachromosomal recombination and oxidative free radicals
in Saccharomyces cerevisiae[J]. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 1998, 397(2): 271-278.
DOI: 10.1016/S0027-5107(97)00225-X
[30] Brennan R J, Schiestl R H. Cadmium is an inducer of oxidative stress in yeast[J]. Mutation research/Fundamental and molecular
mechanisms of mutagenesis, 1996, 356(2): 171-178. DOI: 10.1016/0027-5107(96)00051-6