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论 文 第 52卷 第 18期 2007年 9月
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β2-肾上腺素受体亲和色谱及其在苦杏仁
活性成分筛选中的应用
郑晓晖① 赵新锋② 杨 荣① 王世祥① 卫引茂① 郑建斌①*
(① 西北大学分析科学研究所, 陕西省电分析化学重点实验室, 西安 710069; ② 西安交通大学中草药现代化研究及工程中心,
西安 710061. * 联系人, E-mail: zhengjb@nwu.edu.cn)
摘要 用 Sepharose-沙丁胺醇亲和色谱柱从家兔肺组织中纯化得到β2-肾上腺素受体(β2-adrenoceptor, β2-
AR), 以大孔硅胶为载体, 采用温和的化学偶联方法, 将β2-AR 通过共价键均匀地固载在大孔硅胶表面,
用硫酸沙丁胺醇、重酒石酸去甲肾上腺素、盐酸肾上腺素和盐酸普萘洛尔表征β2-AR色谱柱的保留特性,
从而建立了β2-AR亲和色谱方法, 并将该法用于苦杏仁粗提物中活性成分的筛选. 结果表明, 色谱固定
相上的β2-AR 能保持其生物活性和选择性; 苦杏仁粗提物中与该受体色谱柱有保留作用的活性成分为
苦杏仁苷. 与已有色谱筛选方法相比, 该法具有稳定性好和选择性强的特点, 可对中药中与β2-AR作用
的活性成分进行快速准确筛选, 可为中药等复杂体系中药物活性成分的筛选提供新途径.
关键词 生物亲和作用 亲和色谱 药物筛选 β2-肾上腺素受体 苦杏仁

2007-02-08收稿, 2007-07-17接受
国家自然科学基金(批准号: 20575052)、陕西省自然科学基金(批准号: 2006B03, 2006C220)资助项目
色谱技术以其高的分离能力和快的分离速度 ,
在新药研发和中药活性成分筛选方面得到了广泛应
用. 邹汉法等人[1]将基于分子识别原理的分子生物色
谱技术应用于中药研究中, 发展了当归、川芎、丹参
和茵陈活性成分筛选及质量控制的生物色谱方法 .
贺浪冲等人[2~4]将细胞膜吸附于硅胶固定相表面, 建
立了细胞膜色谱法. Wainer研究组[5]将受体吸附于磷
脂膜色谱固定相表面 , 从而建立了研究药物与受体
作用的色谱新方法 . 这些方法在药物活性成分筛选
工作中均具有潜在的应用前景[6~8]. 然而, 迄今为止,
如何建立一种从中药等复杂体系中快速、高效地筛选
药物活性成分的方法仍是新药研发工作的热点问题
之一. 众所周知, 药物与细胞膜上的受体选择性地识
别并与之结合, 然后通过信息传递, 最终产生药理活
性是药物在体内发挥药效的重要途径之一 . 如果能
将受体固载于固定相表面 , 并利用其与药物的这种
特异性作用及液相色谱的高分离能力 , 就能建立一
种受体试用药快速、高效和稳定的亲和色谱筛选方法.
本文采用沙丁胺醇亲和色谱从家兔肺组织中纯化得
到了β2-AR, 建立了β2-AR亲和色谱方法, 并用其对苦
杏仁活性成分进行了筛选.
1 实验
(ⅰ) 仪器. Agilent 1100 高效液相色谱-离子阱
质谱联用仪(包括二元梯度泵、二极管阵列检测器、
柱温箱和 SL型离子阱质谱仪); ZZXT-A装柱机(大连
依利特分析仪器有限公司); BT01-100型蠕动泵(保定
兰格恒流泵有限公司).
(ⅱ) 试药. 毛地黄毒苷(上海化学试剂采购供
应站), 6B琼脂糖微球(西安交通大学保赛生物技术股
份有限公司, BS-050824), 二硫苏糖醇(DTT), 1,4-丁
二醇二环氧甘油醚(无锡惠利合成材料有限公司), 苯
甲基磺酰氟(华义生物有限公司). 羰基二咪唑、亮抑
蛋白酶肽、大豆胰蛋白酶抑制剂均购自 Sigma 公司.
其他试剂均为分析纯.
(ⅲ) β2-AR 粗品的制备. 取家兔肺组织, 参考
文献 [9, 10]的方法制备含有溶脱 β2-AR 的洗脱液 ,
−70℃冻存备用.
(ⅳ) β2-AR的纯化. 参考文献[11]的方法合成100
mL Sepharose-沙丁胺醇亲和层析树脂, 然后装柱. 用
100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, 2 mmol/L
EDTA和 0.05%毛地黄毒苷组成的溶液(pH 7.2)平衡柱
子后, 将 β2-AR洗脱液上柱. 先用缓冲液(500 mmol/L
NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl, 2 mmol/L EDTA, 0.5%毛
地黄毒苷, pH 7.2)洗涤, 再用从 0～100%沙丁胺醇溶
液(40 µmol/L)以线性梯度方式进行洗脱 , 收集目标
产物. 用 Sephadex G50 尺寸排阻柱除去收集液中游







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离的沙丁胺醇 , 得到含β2-AR 的洗脱液 . 重复操作 ,
收集大量洗脱液, 用 SDS-凝胶电泳-银染显色法测定
洗脱液中β2-AR的纯度和分子量(图 1), β2-AR的纯度
为 80%, 分子量为 6.3×104 µ.

图 1 β2-AR的 SDS-凝胶电泳图

(ⅴ) β2-AR 亲和色谱固定相的合成和装柱. 参
考文献[11]的方法, 制备氨丙基硅胶, 再用羰基二咪
唑活化. 取 1.3 g活化硅胶, 加入β2-AR洗脱液和磷酸
盐缓冲溶液 (pH 7.0), 室温下搅拌 2 h. 抽滤, 硅胶用
缓冲液洗涤多次后, 转移至 1%甘氨酸乙酯溶液中反
应 30 min. 最后用缓冲溶液洗涤, 得到β2-AR亲和色
谱固定相. 以 5 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 7.2)为匀浆
液和顶替剂, 在 4.0×107 Pa的压力下装填色谱柱(50
mm×4.6 mm( I.D.)).
(ⅵ) 色谱柱保留特性及稳定性研究. 以5 mmol/L
Tris-HCl, 0.5 mmol/L EDTA 和 1 mmol/L NaCl组成的
溶液(pH 7.2)为流动相, 在流速为 0.8 mL/min的条件
下, 分别测定盐酸普萘洛尔、硫酸沙丁胺醇和硫酸特
布他林的保留时间 tR 及柱系统死时间 t0, 通过公式
k′=(tR− t0)/t0计算容量因子. 在相同的色谱条件下, 连
续 7 d 内重复进样, 比较容量因子以及峰形的变化,
判断色谱柱的稳定性.
(ⅶ) 结合常数的测定. 采用前沿色谱法测定配
体-受体的结合常数. 取(ⅵ)节中流动相为 A液, 用 A
液配制而成的硫酸沙丁胺醇等配体溶液为 B 液. 首
先用 A 液平衡色谱柱 50 min, 然后由仪器自动控制
A, B液按一定比例混合, 以 0.8 mL/min流速通过β2-
AR 色谱柱, 直至流出液的紫外吸收达到平台值, 记
录突破曲线, 计算曲线达到拐点时的体积 Vr. 系统死
体积 V0用 NaNO2溶液测定, 利用 Scatchard公式计算
结合常数 Ka.
(ⅷ) 苦杏仁苷粗品的制备. 70 g苦杏仁捣碎后,
用 200 mL 石油醚抽提脱脂. 脱脂苦杏仁晾干后, 再
用 250 mL 95%乙醇抽提. 浓缩抽提液并加少量乙醚,
放置过夜, 过滤, 得苦杏仁苷粗品 3.2 g.
(ⅸ) 苦杏仁苷的筛选. 粗品按(ⅵ)中色谱条件
进行 LC-MSn分析. 质谱条件为: 大气压化学电离源
正离子模式, 雾化气压力为 2.8×105 Pa, 干气流速为
8 L/min, 干气温度为 350℃, 柱后添加甲醇-二氯甲
烷(V:V=1:1)混合溶液进行衍生.
2 结果与讨论
2.1 β2-AR亲和色谱固定相的制备
将蛋白固载于固定相表面的方法有戊二醛法[12]、
三聚氯氰法 [13]和羰基咪唑法[14]等多种方法. 本文用
羰基二咪唑活化氨丙基硅胶, 再与β2-AR 反应, 反应
条件温和 . 然后用甘氨酸乙酯对硅胶表面残留的未
反应的咪唑基进行封尾 . 这样的键合路线不仅能最
大程度地保持受体的活性和选择性 , 又减小了固定
相表面非特异性功能团的影响 , 形成了不同于细胞
膜色谱等方法的固定相结构[15,16].
2.2 β2-AR亲和色谱柱与各配体的生物亲和作用
为了保证配体与所制备固定相的作用主要为生
物亲和作用, 本文在流动相中加入Tris, EDTA和NaCl
等试剂 , 用于消除配体与固定相上残留氨基和硅羟
基之间的静电作用 . 用前沿色谱技术研究配体与受
体的亲和作用, 依据 Scatchard 公式(1)获得配体与受
体的结合常数:
[ ]
r 0 a 1 1
A1 1
V V K m m
= +− , (1)
Vr代表出现拐点时的洗脱体积, V0代表系统的死体积,
ml 表示固定相上活性位点的物质的量, [A]表示流动
相中待分析物质的摩尔浓度, Ka为受体与配体之间的
结合常数.
图 2 是 4 种配体的前沿色谱图. 根据 Scatchard
作图法测得硫酸沙丁胺醇、重酒石酸去甲肾上腺素、
盐酸肾上腺素和盐酸普萘洛尔的线性相关系数及结
合常数(表 1). 由表 1可见, 线性相关系数均大于 0.98,
表明色谱柱中 4 种配体与受体的作用为单位点作用.
文献报道[17], β2-AR有两个活性位点, 但硫酸沙丁胺
醇等铵盐类配体一般与其强作用位点发生亲和作用.







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图 2 4种配体前沿色谱图
(a) 盐酸肾上腺素; (b) 重酒石酸去甲肾上腺素; (c) 盐酸普萘洛尔; (d) 硫酸沙丁胺醇

表 1 β2-AR色谱柱上各配体与受体的结合常数
配体名称 结合常数/L·mol−1 结合位点/mol 相关系数 R2
硫酸沙丁胺醇 0.92×105 142.86×10−9 0.992
重酒石酸去甲肾上腺素 1.87×105 33.33×10−9 0.997
盐酸肾上腺素 2.96×105 25.00×10−9 0.997
盐酸普萘洛尔 1.27×105 166.67×10−9 0.986

4 种配体的结合常数大小次序为: 盐酸肾上腺素>重
酒石酸去甲肾上腺素>盐酸普萘洛尔>硫酸沙丁胺醇,
这与文献[18]中用放射免疫法测定的结果一致. 由此
可见, 经过纯化、化学键合和装填等步骤, 固定相上
的β2-AR依然保持其原有生物活性, 可有效地与各配
体发生亲和作用.
在拟定色谱条件下, 盐酸普萘洛尔、硫酸沙丁胺
醇和硫酸特布他林的保留行为见表 2. 由表 2可见, 3
种配体在β2-AR亲和色谱柱上的保留时间有较大差异,
且保留时间的大小次序与文献[19]中的结合常数的
大小次序一致 , 说明可根据配体与受体生物亲和作
用的不同对其进行分离 . 另外 , 实验发现α-AR 的
表 2 3种配体在β2-AR色谱柱上的保留行为
配体名称 保留时间/min 容量因子 k′
盐酸普萘洛尔 20.8 10.6
硫酸沙丁胺醇 4.5 1.5
硫酸特布他林 3.5 1.0

配体盐酸氯丙嗪及β1-AR的配体酒石酸美托洛尔和阿
替洛尔在β2-AR亲和色谱柱上不保留, 进一步证明了
配体与β2-AR的作用具有特异性.
2.3 β2-AR亲和色谱柱的稳定性
表 3是盐酸普萘洛尔、硫酸沙丁胺醇和硫酸特布
他林在 1, 3, 5和 7 d内的保留时间. 由表 3可知, 3种







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表 3 相同色谱条件下各配体在不同时间点的色谱保留时间
保留时间/min 时间点/d 盐酸普萘洛尔 硫酸沙丁胺醇 硫酸特布他林
1 20.8 4.6 3.5
3 19.5 5.1 3.7
5 21.1 4.4 4.0
7 21.8 5.1 4.2

配体的保留时间标准偏差分别为 4.6%, 7.4%和 8.1%.
图 3为硫酸沙丁胺醇在相应时间点下的色谱图. 可见
各配体保留时间在 1, 3, 5和 7 d内无明显变化, 说明
β2-AR 在色谱柱中能较好保持其结构稳定性. 从图 3
还可看出, 硫酸沙丁胺醇的色谱峰明显变窄, 这可能
是由于随使用时间的延长 , 固定相表面的非可逆性
作用减小所致.


图 3 连续 7 d内硫酸沙丁胺醇的色谱图

2.4 苦杏仁苷的筛选
图 4和 5分别是苦杏仁粗提物在 β2-AR色谱柱上
的紫外色谱图和全扫描一级质谱图. 保留时间为 29.4
min的色谱峰, 在质谱图中的分子离子峰为 m/z 456.3,
经与标准品质谱信息对照 , 确定其为苦杏仁苷的色

图 4 β2-AR色谱柱对苦杏仁粗提物的色谱分离图
峰 1为苦杏仁苷

谱峰. m/z 492.1峰为苦杏仁苷分子在二氯甲烷柱后衍
生作用下产生的加合离子峰.
3 结论
β2-AR是G蛋白偶联的 7次跨膜受体蛋白家族的
成员之一, 是止咳平喘药物发挥药效的主要靶体. 苦
杏仁为临床常用的止咳平喘的中药之一 [20]. 本文用
亲和色谱法从家兔肺组织中纯化得到了β2-AR, 然后
选择温和的化学方法将其通过共价键均匀地固载于
大孔硅胶表面, 用硫酸沙丁胺醇、重酒石酸去甲肾上
腺素、盐酸肾上腺素和盐酸普萘洛尔表征了β2-AR色
谱柱的亲和特性, 从而建立了β2-AR 亲和色谱方法.
与已有色谱筛选方法相比 , 该法具有稳定性好和选
择性强的特点, 可对苦杏仁中与β2-AR 作用的活性成
分进行快速准确筛选 . 该法之所以具有良好的稳定
性, 主要是因为通过共价键将β2-AR 键合在填料表面,
既避免了色谱固定相表面上β2-AR 的流失, 又提高了
β2-AR 本身的稳定性[21]. 该法之所以选择性强, 主要
是由于β2-AR对配体具有选择性识别作用.


图 5 苦杏仁粗提物的一级质谱图







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参 考 文 献
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