全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 16期 2016年 8月

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利用免疫亲和色谱柱特异性敲除甘草酸的方法学研究
曾文浩 1，孔 慧 3，屈保平 3，张美龄 1，王咏枝 1，闫 昕 1，赵 琰 3，屈会化 2*
1. 北京中医药大学中药学院，北京 100029
2. 北京中医药大学 科研实验中心，北京 100029
3. 北京中医药大学基础医学院，北京 100029
摘 要：目的 制备特异性敲除甘草酸的免疫亲和色谱柱。方法 抗甘草酸单克隆抗体与 CNBr活化的 Sepharose 4BTM凝胶
偶联制备甘草酸特异性敲除免疫亲和色谱柱，利用 HPLC 法测定敲除液与洗脱液中甘草酸质量浓度，考察甘草酸免疫亲和
色谱柱的最大载样量、敲出率、精密度、准确度及稳定性等参数。结果 甘草酸免疫亲和色谱柱的最大载样量为 1.326 11 mg；
日内及日间精密度总 RSD分别为 0.65%，相对误差（RE）为 0.37%；免疫亲和色谱柱稳定性实验显示 32 d内甘草酸敲除率
的 RSD为 1.37%，稳定性良好。结论 制备的甘草酸特异性敲除免疫亲和色谱柱能快速、高效、稳定地敲除甘草酸。
关键词：甘草酸；单克隆抗体；免疫亲和色谱柱；敲除；HPLC
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)16 - 2838 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.16.010
Methodology on specific knock out of glycyrrhizic acid by immunoaffinity
chromatography column
ZENG Wen-hao1, KONG Hui3, QU Bao-ping3, ZHANG Mei-ling1, WANG Yong-zhi1, YAN Xin1, ZHAO Yan3,
QU Hui-hua2
1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
2. Center of Scientific Research, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
3. School of Preclinical Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
Abstract: Objective To prepare the glycyrrhizic acid (GA) immunoaffinity chromatography column, which could specifically knock
out the GA. Methods An immunoaffinity chromatography (IAC) column was developed by covalently coupling the anti-GA-MAb to
CNBr-activated SepharoseTM 4B. The concentration of GA was detected by HPLC, and the maximum coupling capacity, stability,
precision, and accuracy of the IAC column for GA were studied. Results The maximum capacity of the IAC column for GA was
1.326 11 mg, the precision (RSD) of GA was 0.65%, and the accuracy (RE) was 0.37%. RSD of GA stayed 1.37% during 32 d, which
showed a pretty well stability. Conclusion GA-IAC column could rapidly, effectively, and stably knock out the GA.
Key words: glycyrrhizic acid; monoclonal antibodies; immunoaffinity chromatography column; knock-out; HPLC

中药活性成分是中药发挥疗效的基础，中药活
性成分的研究不仅是中药质量控制的基础，更是中
医药现代化的关键环节。目前，中药活性成分的研
究主要采用的是“还原论”[1]“靶向技术”[2]或“血
清药理学”[3]等技术，但上述技术在揭示中药活性
成分对中药材或复方的关联度及贡献度等方面还存
在不足。因此，本课题组提出基于小分子单克隆抗
体的免疫亲和色谱特异性敲除技术研究中药物质基
础的新思路与方法[4-6]。
免疫亲和色谱特异性敲除技术原理类似于“基
因敲除”技术[7]，可通过对比药物中某一特定成分
敲除前后的功效变化，从而阐释该成分与整体药效
的相关性，可用于解析药物的活性成分与该药物功
效的关联度、贡献度大小及活性成分与其他成分之
间相互作用关系等问题。利用中药活性成分的单克
隆抗体制备免疫亲和色谱柱，可以特异性地从药材

收稿日期：2016-03-30
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81473338，81274043）
作者简介：曾文浩（1992—），男，在读硕士，研究方向为中药免疫分析方法。Tel: 18010108007 E-mail: zwhao01@foxmail.com
*通信作者 屈会化（1966—），男，硕士生导师，研究方向为中药小分子单克隆抗体技术。Tel: 13661101910 E-mail: zhaoyandr@gmail.com
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或复方中敲除该化合物，且“原样”保留其余成分。
这种高特异性、高灵敏度的化合物分离纯化技术是
目前其他色谱技术难以实现的，这为中药物质基础
的研究提供了更加科学便捷的技术支持[8-10]。
甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是甘草中最重
要的活性成分之一[11-13]，具有免疫调节、抗炎、抗
病毒、抗癌、抑菌、解毒、保护心血管、保护脑损
伤及保护肝脏[14-19]等作用。本实验利用抗 GA单克
隆抗体（monoclonal antibodies，mAbs）[20-22]制备了
GA 特异性敲除免疫亲和色谱柱（immunoaffinity
chromatography，IAC），考察 GA-IAC 柱特异性敲
除 GA的各项参数。本实验通过特异性敲除实验验
证栀子苷能作为 GA-IAC柱的内标物质；通过测定
GA-IAC 柱的最大载样量，考察了 GA-IAC 柱能否
用于甘草提取液的敲除实验；通过考察 GA-IAC柱
的精密度及稳定性等参数，检验 GA-IAC柱特异性
敲除 GA方法的稳定性及可靠性。上述参数的测定，
为 GA特异性敲除技术的建立提供科学依据，也为
今后明确 GA的药效及作用机制，阐释甘草的物质
基础，揭示中药多成分间的相互作用以及复方的配
伍机制研究提供新思路。
1 仪器与材料
CPA225D电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）
有限公司；Agilent 1260 Infinity LC高效液相色谱
仪，德国 Agilent Technologies；色谱柱：Reliasi1 C18
（250 mm×4.6 mm，5 μm），型号：2108055，美国
Orochem公司；中压色谱柱（20 cm×2.5 cm），型
号：7374521，美国 Bio-rad公司；QYC-200恒温振
荡摇床，上海福玛实验设备有限公司；EL×800酶
标仪，美国伯腾仪器有限公司。
对照品 GA（批号 13083101，质量分数≥98%）、
栀子苷（批号 110749-200714，质量分数≥98%），
成都曼斯特生物科技有限公司；CNBr 活化
Sepharose 4B凝胶，批号 10223816，瑞士 Amersham
Biosciences；乙腈，批号1401-7，色谱纯，德国Merck；
BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号 20510203），北京
索莱宝科技有限公司；去离子水，北京中医药大学
逸夫科研楼；其他化学试剂（分析纯）均购于北京
化工厂。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent 1260色谱仪，DAD检测器；色谱柱为
Reliasi1 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为
1%醋酸铵水溶液（醋酸-水 1∶99，0.06 mol/L醋酸
铵）-乙腈；体积流量 1 mL/min；检测波长 254 nm；
进样量 10 μL；柱温 30 ℃；梯度洗脱：0～12 min，
6%～22%乙腈；12～25 min，22%～25%乙腈；25～
45 min，25%～40%乙腈；45～50 min，40%～6%
乙腈；50～57 min，6%乙腈。
2.2 样品溶液的配制
配制 GA的对照品溶液作为上样液，并以一定
质量浓度栀子苷溶液作为内标物质，用于 GA的质
量浓度标准曲线测定，以及 GA特异性敲除实验。
精密称定 10.0 mg GA，去离子水溶解，5 mL
量瓶定容，制成 2.00 mg/mL对照品母液。精密称定
5.0 mg栀子苷，去离子水溶解，5 mL量瓶定容，制
成 1.00 mg/mL对照品母液。利用 GA对照品母液配
制 1.75、1.50、1.25、1.00、0.50、0.25、0.10、0.05
mg/mL GA 对照品溶液（去离子水稀释，含 250
μg/mL栀子苷）。
2.3 GA标准曲线绘制
用栀子苷作为测定的内标物质，在相同的色谱
条件下，对上述已配制好的对照品溶液进行测定，
以 GA的质量浓度为横坐标（X），以 GA的吸收面
积与栀子苷的吸收面积的比值为纵坐标（Y）得线
性回归方程 GA Y＝445.62 X＋55.104，R2＝0.999 8，
线性范围 57.5～1 750 μg/mL，保留时间 40.47 min，
检测限（LOD）为 57.5 μg/mL。结果表明 GA的测
定具有较宽的线性范围，且线性关系良好。
2.4 偶联率测定
通过 BCA（Bicinchonininc acid）法计算蛋白质
的量，在 96孔板中加入 PBS稀释的牛血清白蛋白
（BSA）对照品梯度工作液及待测蛋白样品溶液，加
入BCA工作液，酶标仪 562 nm波长扫描吸光度（A）
值，测定蛋白质量浓度，计算抗GA抗体（GA-mAbs）
与 Sepharose 4BTM凝胶的偶联率及偶联比，计算公
式为偶联率＝(偶联前抗体量－偶联后抗体量)/偶联
前抗体量，偶联比＝(偶联前抗体量－偶联后抗体
量)/琼脂糖凝胶体积。
2.5 GA免疫亲和色谱柱的制备
称取 12 g CNBr活化的 Sepharose 4BTM凝胶，
用 100 mL HCl（1 mol/L，pH 3）溶胀，搅拌 0.5 h。
用 2 000 mL的 HCl（1 mol/mL，pH 3）溶液冲洗柱
子，再以 5倍柱体积去离子水平衡柱子。称取 400 mg
GA-mAb冻干粉溶解于 1 mL的 0.1 mol/L NaHCO3
（pH 8.3，含 0.5 mol/L NaCl）溶液，将抗体溶液加
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入溶胀好的凝胶中，再将凝胶转移至锥形瓶中，
37 ℃，120 r/min，摇床振荡孵育 2 h。振荡后溶液
转移至 20 cm×2.5 cm的中压色谱柱内，以 5倍柱
体积 0.1 mol/L NaHCO3（pH 8.3，含 0.5 mol/L NaCl）
溶液冲洗凝胶至 A值为 0，测定流出液蛋白量，计
算偶联率。再用 3倍柱体积去离子水平衡色谱柱。
将色谱柱中凝胶转移至 0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0，
不含 NaCl）溶液中，37 ℃，50 r/min，摇床振荡孵
育 2 h，将凝胶转移回中压色谱柱中，以 3倍柱体积
去离子水平衡凝胶，再用 5 倍柱体积的 0.1 mol/L
NaAc-HAc（pH 4，含 0.5 mol/L NaCl）溶液及 5倍
柱体积的 0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0，含 NaCl）溶
液交替冲洗凝胶，后去离子水平衡中压色谱柱，再
用 0.01 mol/L PBS封存，4 ℃保存备用。测得偶联
后（未结合）的抗体量为 100.4 mg，计算抗 GA-mAbs
与琼脂糖凝胶偶联率 74.9%，偶联比为 5.99∶1，表
明 Sepharose 4BTM凝胶对抗 GA-mAbs 有较强的结
合能力。
2.6 GA-IAC参数考察
2.6.1 特异性敲除实验 精确量取 1 mL质量浓度
为 500 μg/mL（含 250 μg/mL 栀子苷内标）的 GA
对照品溶液，室温条件下将样品进样到 GA-IAC内，
孵育 15 min，以去离子水为敲除液，收集 5倍柱体
积（250 mL）敲除液，以甘氨酸盐酸缓冲液（pH 2.7，
含 0.5 mol/L NaCl）为洗脱液，收集 5倍柱体积（250
mL）洗脱液，再用去离子水平衡 GA-IAC，至 pH
值恢复中性，放入 4 ℃保存。将收集到的敲除液和
洗脱液分别用旋转蒸发仪浓缩、蒸干，1 mL纯甲醇
复溶，收集复溶液，0.22 μm 微孔滤膜滤过复溶液，
HPLC测定敲除液与洗脱液中化学成分种类及其量。
偶联在 Sepharose 4BTM凝胶上的抗 GA-mAbs，
能特异性吸附样品中的 GA，而其他成分则随着流
动相离开柱子。当进样 500 μg/mL（含 250 μg/mL
栀子苷内标）GA对照品溶液（图 1-A）流经 GA-IAC
柱后，HPLC 法测定敲除液（图 1-B）中栀子苷质
量浓度为 259.0 μg/mL，回收率为 103.6%，未测到
GA；洗脱液（图 1-C）中 GA 质量浓度为 312.1
μg/mL，且未测到栀子苷成分。敲除液与洗脱液
HPLC结果显示GA-IAC柱对栀子苷无特异性吸附，
可选择其作为内标物质。
2.6.2 最大载样量与敲除率考察 考察制备的GA-
IAC柱最大载样量，为之后利用GA-IAC柱敲除GA
的上样量限定范围。精确量取 1 mL质量浓度不同





图 1 GA特异性敲除研究结果
Fig. 1 Specific knock out of GA by HPLC
的 GA 对照品溶液（1.75、1.50、1.25 mg/mL，含
250 μg/mL栀子苷内标），将GA样品进样到GA-IAC
柱内，以去离子水为敲除液，以甘氨酸盐酸缓冲液
（pH 2.7，含 0.5 mol/L NaCl）为洗脱液，分别收集 5
倍柱体积敲除液与洗脱液，再用去离子水平衡色谱
柱至 pH值为 7。将收集到的敲除液和洗脱液分别蒸
干，1 mL纯甲醇复溶，收集复溶液，0.22 μm 微孔
滤膜滤过复溶液，HPLC 测定敲除部分与洗脱部分
中 GA的量，测得 GA-IAC柱对 GA的回收率与敲
除量。其中，敲除量表示 GA-IAC柱从上样溶液中
吸附 GA的量，即 GA-IAC柱的载样量。
通过 HPLC法测定 GA-IAC柱敲除 3个不同质
量浓度的 GA对照品溶液，测得 GA-IAC柱的最大
载样量及回收率如表 1 所示。GA-IAC 柱的最大载
样量＝每克葡聚糖凝胶载样量平均值×葡聚糖凝胶
用量（12 g），测得最大载样量为 110.51 μg/g×12
g＝1.326 12 mg，表明 GA-IAC柱特异性吸附 GA效
果好，GA-mAbs活性高。
2.6.3 精密度与准确性试验 考察 GA-IAC柱的精
密度与准确度，验证 GA-IAC柱特异性敲除 GA方
法的科学性。精确量取 1 mL 不同质量浓度的 GA
对照品溶液（1.75、1.50、1.25 mg/mL，含 250 μg/mL
栀子苷
GA
栀子苷
GA
10 20 30 40 50
t/min
GA对照品溶液
B
C
敲除液
洗脱液
A
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栀子苷），将 3种质量浓度 GA样品连续 3 d进样到
GA-IAC 柱内，每个质量浓度样品进样 3 次，分别
收集敲除液和洗脱液，旋转蒸发仪蒸干，1 mL纯甲
醇复溶，收集复溶液，0.22 μm 微孔滤膜滤过复溶
液，HPLC 检测敲除液中 GA 的量，计算日内及日
间 GA质量浓度的总 RSD和相对误差（RE），并用
以评价 GA-IAC柱敲除 GA的日内及日间精密度和
准确度。计算 GA质量浓度的总 RSD和 RE，结果
如表 2 所示，测得 GA 质量浓度的总 RSD 值为
0.65%，RE值为 0.37%，符合方法的要求。

表 1 GA-IAC柱的载样量与敲除率
Table 1 Knock out efficiency and capacity of IAC column
for GA
进样量/
(mg·mL−1)
组分
GA质量浓
度/(μg∙g−1)
回收率/
%
敲除率/
%
凝胶敲除
量/(μg∙g−1)
1.25 敲除液 0 59.48 100.00 104.17
洗脱液 743.48
1.50 敲除液 177.75 65.55 88.15 112.91
洗脱液 805.54
1.75 敲除液 343.92 73.81 80.35 117.17
洗脱液 947.73
平均值 66.28 89.50 110.51

表 2 GA-IAC柱精密度与准确度考察
Table 2 Assay accuracy and precision of GA-IAC column
进样量/
(mg·mL−1)
敲除量/μg
RSD/% RE/%
1 d 2 d 3 d 平均值
1.75 1 412.07 1 409.82 1 396.35 1 406.08 0.60 0.46
1.50 1 307.38 1 317.07 1 342.64 1 322.25 1.35 0.55
1.25 1 250.00 1 250.00 1 250.00 1 250.00 0 0
平均值 1323.15 1325.63 1329.66 1 326.11 0.65 0.37

2.6.4 重复性与稳定性试验 测定 GA-IAC柱在相
同敲除、洗脱条件，以及相同实验环境（包括温度、
湿度等）下，对 GA的特异性敲除的效果随时间变
化的规律，考察该方法的重复性与稳定性。
同一条件下测定第 1、2、4、8、16、32天时间
点的 GA-IAC柱敲除 GA的敲除率。取 1 mL（1.5
mg/mL，含 250 μg/mL 栀子苷内标）GA 样品，流
经 GA-IAC柱，收集敲除液及洗脱液，蒸干后甲醇
复溶，HPLC测定敲除液及洗脱液中 GA质量浓度，
计算 RSD值，验证 GA-IAC柱特异性敲除 GA的重
复性与稳定性。
测定在第 1、2、4、8、16、32天时间点的 GA-IAC
柱敲除 GA（1.5 mg/mL，含 250 μg/mL 栀子苷）样
品的敲除率，测得 GA-IAC敲除结果见表 3，在 32 d
内，GA-IAC柱敲除率的 RSD值为 1.37%，表明制
备的 GA-IAC柱具有较好的重复性与稳定性。

表 3 GA-IAC柱重复性与稳定性试验
Table 3 Repeatability and stability of GA-IAC column
时间/d
GA/(μg∙mL−1)
敲除率/%
进样液 敲除液 敲除量
1 1 457.03 149.65 1 307.38 89.73
2 1 450.16 133.08 1 317.07 90.82
4 1 521.36 152.53 1 368.83 89.97
8 1 563.24 144.15 1 419.08 90.78
16 1 484.49 186.44 1 298.05 87.44
32 1 457.11 149.31 1 307.80 89.75
平均值 1 488.90 152.53 1 336.37 89.75
RSD/% 3.02 10.76 3.57 1.37

3 讨论
甘草作为最常用的中药之一，对于其化学成分
及药理活性的研究早已开展的十分透彻，但是过往
的研究往往割裂了活性成分 GA与甘草饮片或复方
的关联度，不能论证 GA在中药或复方整体中的关
联性与贡献度大小。因此，本实验制备出能特异性
敲除 GA的免疫亲和色谱柱，为 GA的药理活性研
究提供新的方法。
本实验重点在于考察所制备的 GA-IAC柱的各
项参数。实验结果表明 GA-IAC柱对 GA具有很强
的特异性吸附能力，其最大载样量能达到 1.326 11
mg，进一步研究可用于敲除甘草提取液中的 GA成
分。通过分析 GA-IAC柱的精密度及准确度实验结
果，表明利用 GA-IAC柱特异性敲除 GA的方法是
有效可行的。本实验考察 GA-IAC柱的稳定性，实
验结果显示GA-IAC柱在 32 d内GA敲除率的RSD
值为 1.37%，表明偶联在琼脂糖凝胶上的抗 GA-
mAb在此时间段内活性较好，GA-IAC柱对 GA的
特异性吸附效果良好，该方法具有较好的重复性与
稳定性。上述实验结果表明本实验成功制备了可用
于特异性敲除 GA的 IAC。且在前期研究中本课题
组进行 GA-IAC敲除甘草提取液中 GA的研究[19]，
实验结果表明，GA-IAC 能敲除甘草提取液中的
GA，且敲出率可达到 100%，表明 GA-IAC能应用
于甘草提取液中 GA的敲除研究。
前期研究中发现，利用去离子水作为敲除液，
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甘氨酸盐酸缓冲液（pH 3）作为洗脱液，能取得较
好的敲除洗脱效果[20]。偶联在葡聚糖凝胶上的抗
GA-mAb作为一种蛋白质，敲除液和洗脱液对抗体
活性有十分重要的影响，从而对 GA-IAC柱的敲除
效果产生巨大的影响。本实验选择去离子水及甘氨
酸盐酸（pH 3），其对抗体活性影响较小，在较长时
间内对色谱柱的敲除效率无不良影响，且去离子水
作敲除液可直接用于后续 GA细胞实验或动物药理
学实验当中，无须复杂的有机溶剂处理过程。也有
文献报道[23]采用 5 mmol/L PBS（含 50 mmol/mL
NaCl，pH 7）作为敲除液，20 mmol/L PBS（含 30%
甲醇，500 mmol/L NaCl，pH 7）作为洗脱液。但对
比本实验制备的 GA-IAC柱，在对 GA的敲除效率，
色谱柱的载样量，色谱柱的稳定性等方面，本实验
制备的 GA-IAC柱明显高于文献结果。且本实验制
备的色谱柱的操作更便捷、无污染，适合用于更进
一步研究 GA的药理药效学实验中，这都表明本实
验制备的 GA-IAC柱具有更加独特的应用优势。
作为一种研究 GA 药理活性的新途径，利用
GA-IAC 特异性敲除 GA 的方法还有需要改进的方
面，如色谱柱对有机试剂的耐受性，抗 GA-mAb活
性的保存，GA-IAC 柱的最佳使用条件等方面，都
需要对其进行进一步的优化考察。
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