全 文 ：　第 2期
2007年 3月 华东师范大学学报(自然科学版)Journal o f East China Norm al University (Natural Science)
No. 2　
M ar. 2007
文章编号:1000-5641(2007)02-0137-04
*简报*
水线草初提物药理作用的初步研究
丛　蓉1 , 　旷丽莎1 , 　冯　静1 , 　侯爱君2 , 　白美蓉1 , 　钱　 1
(1 .华东师范大学 生命科学学院 , 上海　200062;　2 .复旦大学 药学院 , 上海　200032)
中图分类号:R961　　文献标识码:A
　收稿日期:2006-02
　基金项目:上海-SK 研究与发展基金(2004008-t)
　第一作者:丛蓉(1981 -),女 ,硕士研究生.
　通讯作者:钱 (1961 -),女 ,教授;E-mail:mqian@bio. ecnu. edu. cn.
0　引　　言
水线草为茜草科植物水线草 Oldenlandia (Hed yotis) corymbosa L. 的全草 ,又称伞房花耳草 、蛇舌草 ,
广泛分布于我国东南 、西南各地及热带亚洲 、非洲和美洲.据报道[ 1-3] , 水线草能抗植入皮下肿瘤 , 显著促进
白细胞放射性损伤后的复原 ,并且对体外培养的人癌细胞增殖有抑制作用 , 并可显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜
(CAM)新生血管的生成. 但是水线草抗肿瘤的有效成分目前还没有明确 , 为此 ,我们将水线草分别用三种
不同的溶剂提取获得初提物 ,然后用 MTT 法和鸡胚绒毛尿囊膜实验来观察其对体外培养的人结肠癌细胞
的影响以及对 CAM 血管生成的作用 , 为明确水线草抗肿瘤的有效成分提供依据.
1　材料与方法
1 . 1　实验材料　水线草购于上海医药公司 , 结肠癌细胞株 LoVo 和 HCT-8 购自中科院细胞库 ,小牛血清
(PAA , AUS TRIA), RPMI-1640(GIBCO , US A),胰蛋白酶 、M TT(AM RESCO , USA), DMSO(上海凌峰化
学试剂有限公司), 华申罗曼种鸡蛋购于上海新杨家禽育种有限公司 , 药物载体为中速定性滤纸(杭州新华
纸业有限公司).
1 . 2　实验仪器和设备　二氧化碳培养箱 、低温冰箱(SANYO , JAPAN), 倒置相差显微镜 、酶标仪(BIO-
TEK , USA), 解剖镜(OLYMPUS , JAPAN), 超净工作台(CA1390-1 , 上海上净净化有限公司), 数码相机
(Canon A70 , JAPAN)等.
1 . 3　方法
1 . 3 . 1　药物(水线草初提物)的制备
水线草三种初提物的制备.水煎提取法制备水线草初提物:200 mL水煮 35 g 水线草干草 24 h ,提取液
减压浓缩后蒸干得浸膏.丙酮提取法制备水线草初提物:用 200 mL 50%丙酮冷浸 35 g 水线草干草 24 h ,
渗漏提取 3 次 ,提取液合并 , 减压浓缩后蒸干得浸膏. 乙醇提取法制备水线草初提物:用 200 mL 95%乙醇
冷浸 35 g 水线草干草 24 h ,渗漏提取 3 次 , 提取液合并 ,减压浓缩后蒸干得浸膏.
药物的配制:用二甲亚砜作助溶剂 , 分别将水线草三种初提物溶于生理盐水 ,使这三种初提物的浓度
达到 500 μg /m L ,二甲亚砜的终浓度为 0. 5%.
1 . 3 . 2　肿瘤细胞的培养
结肠癌细胞株 HCT-8和 LoVo均在含 1%双抗- 10%小牛血清-RPMI1640 完全培养基中 , 37 ℃, 5%
CO 2培养.待细胞铺满瓶壁后 , 用无菌 D-Hanks液洗一遍 , 加入 0. 25%胰蛋白酶消化液(约消化 0. 5 min)至
华东师范大学学报(自然科学版) 2007 年
细胞变圆但未从瓶壁上脱落时倒去消化液 ,加入完全培养基 ,吹打均匀后进行传代培养或处理待用 .
1 . 3 . 3　MT T 法观察水线草初提物对肿瘤细胞增殖的影响[ 4]
选择生长良好的结肠癌细胞 HCT-8 和 LoVo分别接种于 96 孔板 , 每孔 100 μL , 浓度为 2×105 cells /
mL 即 2×104 cells /孔 , 37 ℃静止培养 24 h 后 , 弃原培养基 ,用新鲜 RPMI1640 培养基配制一系列浓度的水
线草 95%乙醇提取物 、50%丙酮提取物和水提取物溶液(0 μg /mL , 125 μg /mL , 250 μg /mL , 500 μg /m L ,
1 000 μg /m L),每孔加 100 μL , 5% CO2 , 37 ℃保温 24 h ,作用完毕后 , 每孔加 20 μL MT T 溶液 , 反应 4 h ,
吸掉 MT T 后每孔加入 200 μL DMSO ,振荡器混匀 , 酶标仪测 570 nm 处的 OD 值 ,计算药物对肿瘤细胞增
殖的抑制率.抑制率(%)=(对照组 OD 值-加药组 OD值) /对照组 OD 值×100 , 然后作出抑制率与药物浓
度关系的曲线图 ,从图中求出药物的 IC50值.
图 1　药物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成影响的评判标准
Fig. 1　Evaluation of medicine induced effect on CAM vesse ls
1 . 3 . 4　鸡胚绒毛尿囊膜实验[ 5]
载体的制备　将中速定性滤纸用打孔器做成直径为 5 . 5 mm 的小圆片 , 高压灭菌待用.
鸡胚孵育　选择重量相近(60±5)g 的新鲜种蛋用 0. 1%新洁尔灭浸泡 3 min ,清水洗净后纱布拭干.
气室朝上 ,置于(38±0. 5)℃培养箱中孵化培养 ,内置湿盘 , 保证相对湿度在 60%～ 70%, 每天翻蛋 4 次.
加药　取 7 d 龄鸡胚 , 随机分为五组:阳性对照组(1×10- 6 mol /L 的地塞米松组)、阴性对照组(0. 5%
二甲亚砜的生理盐水)、水线草三种初提物组(500 μg /mL),每组不少于 25 枚种蛋 , 75%酒精消毒种蛋气室
表面 ,无菌操作下在外壳上开一约 2 cm×2 cm 的窗口 , 轻轻去除内壳膜 , 暴露鸡胚绒毛尿囊膜. 在制备好
的中速定性滤纸载体上加药 20 μL ,放在尿囊膜毛细血管新生区 , 无菌透明胶带封口 , 继续孵育 24 h 观察
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第 2 期 丛蓉 , 等:水线草初提物药理作用的初步研究
结果 ,小心揭开透明胶带 , 向鸡胚绒毛尿囊膜上滴加数滴预冷的丙酮 , 在室温下固定 30 min 后 ,将该膜小心
剪下 ,移至玻璃片上使其展开 、铺平 ,放到 10 倍的解剖镜下观察并用数码相机拍照.
结果的统计分析　按表 1 对药物对鸡胚绒毛尿囊膜的影响进行等级评估 , 用 SPSS V12 . 0 进行等级分
组资料的秩和检验 ,比较各组药物对鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响.
表 1　药物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成影响的评判标准
Tab. 1　Evaluation o f medicine induced effec t on CAM vessels
等　级 评判标准
0 药物对血管生成无影响 ,血管仍正常生长
1+ 药物对血管生成有部分抑制 ,部分血管受损变细
2+ 药物对血管生成有抑制 ,血管受损变细
3+ 药物对血管生成有明显抑制 ,部分血管完全消失
4+ 药物对血管生成有极其明显抑制 ,血管已完全消失
2　结　　果
2 . 1　水线草不同提取物对结肠癌细胞株 HCT-8 和 LoVo 增殖的影响
由表 2 可以看出 ,水线草 95%乙醇提取物和 50%丙酮提取物对两株结肠癌细胞的增殖均有抑制作用
(P<0 . 01),且抑制作用随提取物浓度的增加而增大 , 而水提取物对两株结肠癌细胞的抑制作用不大 , 约在
4%～ 10%之间 ,且其抑制作用随提取物浓度的增加变化不大.经计算得水线草 95%乙醇提取物 、50%丙酮
提取物对 HC T-8细胞的 IC50分别为 810 μg /m L和 1 259μg /mL;对 LoVo 细胞的 IC50 分别为 547 μg /mL
和 705 μg /m L.
表 2　MTT法检测水线草不同提取物对 LoVo和 HCT-8 细胞的 OD值的影响
及增殖抑制率大小　(n=8 , x—±s)
Tab2 . Effect of the crude extr acts on the OD value and
inhibitory ra te o f LoVo and HCT-8
浓度
/(μg mL- 1)
95%乙醇提取物
OD值 抑制率 /%
50%丙酮提取物
OD值 抑制率 /%
水提取物
OD 值 抑制率 /%
0
0. 98±0. 02
2. 73±0. 02
0
0
0. 98±0. 02
2. 73±0. 02
0
0
0. 98±0. 02
2. 73±0. 02
0
0
125
0. 68±0. 04
2. 06±0. 04
30. 72
24. 67
0. 82±0. 15
2. 26±0. 15
16. 57
17. 41
0. 90±0. 04
2. 61±0. 06
8. 16
4. 40
250
0. 63±0. 01
1. 88±0. 01
36. 22
31. 20
0. 74±0. 07
2. 11±0. 07
24. 79
22. 68
0. 88±0. 02
2. 60±0. 05
10. 20
4. 76
500
0. 53±0. 04
1. 63±0. 04
46. 16
40. 3
0. 69±0. 01
1. 89±0. 01
29. 98
31. 43
0. 92±0. 07
2. 65±0. 03
6. 12
2. 93
1 000
0. 27±0. 03
1. 2±0.03
72. 17
56. 04
0. 29±0. 11
1. 60±0. 11
70. 89
41. 93
0. 90±0. 03
2. 55±21. 25
8. 16
6. 59
　　注:在每一浓度下上面一行为 LoVo 的数值 ,下面一行为 HCT-8的数值
2 . 2　水线草不同初提物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响
通过对表 3 进行等级分组资料的秩和检验 ,得 Hc=12 . 756(P=0. 013), 说明经五组不同药物作用后
鸡胚的血管生长状态等级不同 ,经过两两比较发现 , 阳性对照组与阴性对照组相比差异显著(P <0. 05),阳
性对照表现出明显的抑制血管生成 , 500 μg /mL 水线草水提取物 、乙醇提取物 、丙酮提取物与阴性对照组
相比均有极其显著性差(P<0. 01),表明水线草三种初提物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成均有抑制作用 ,而
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华东师范大学学报(自然科学版) 2007 年
水线草三种初提物之间比较无显著差异(P>0. 05), 表明水线草三种初提物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的
抑制作用差异不显著.
表 3　不同药物对鸡胚绒毛尿囊膜血管的作用
Tab. 3　Effect of different drugs on CAM vesse ls
药物 药物对鸡胚绒毛尿囊膜血管的影响程度
0 1+ 2+ 3+ 4+ 死胚 总数
A 0 2 3 6 5 13 32
B 9 6 2 1 1 9 28
C 0 2 6 2 7 15 32
D 0 3 3 5 5 13 29
E 0 2 3 6 5 13 29
　　A:阳性对照(1×10 -6 mol /L 地塞米松);B:阴性对照(0. 5%二甲亚砜的生理盐水);C:50%丙酮提取物;D:95%乙
醇提取物;E:水提取物
3　讨　　论
为了确定水线草中抗肿瘤的有效成分 ,本实验首先将水线草分别用 95%乙醇 、50%丙酮和水按一定的
工艺流程取得水线草三种初提物 ,然后分别观察其对人结肠癌细胞增殖和 CAM 血管生成的影响.
由 MT T 实验结果可以看出 , 水线草 95%乙醇提取物和 50%丙酮提取物对人结肠癌细胞 HCT-8 和
LoVo 均有显著的增殖抑制作用 , 经比较 , 95%乙醇提取物比 50%丙酮提取物对两种结肠癌细胞的抑制作
用要大;而水线草水提取物对两株结肠癌细胞的抑制作用很小.推测水线草抗肿瘤有效成分很可能存在于
95%乙醇提取物和 50%丙酮提取物中 ,而且存在于 95%乙醇提取物中的可能性更大.
血管形成在实体肿瘤的生长和转移过程中起着决定性的作用[ 6] , 因此 , 通过抑制肿瘤组织的新生血管
形成从而遏制肿瘤的生长与转移是抗肿瘤药物的一个可能的机制. 为此 ,我们采用经典的研究血管形成的
模型———鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型来进行水线草初提物的抗血管形成实验 ,观察其对 CAM 血管生成
的影响.在 CAM 实验中 , 将 CAM 血管的损伤程度进行等级分类 , 并制定评判标准(表 1), 然后进行等级资
料的比较.结果表明 , 水线草三种初提物均能抑制血管生成 , 推测水线草三种初提物均含有抑制血管生成
的活性成分 ,这是其抗肿瘤的可能的机理之一 ,但其抗血管形成的作用机制尚不明确 , 有待进一步探讨.
本实验为进一步分离提取水线草抗肿瘤有效成分提供了依据 ,但其抗肿瘤的有效成分 ,还需进一步研究.
[参　考　文　献]
[ 1] 　ROHAYA A , ABDU L M A , DAUD A I , et al. Ant ioxidant , radical-scavenging , ant i-inflammatory , cy totoxic and
ant ibacterial act ivi ti es of methanolic ex tract s of some Hedyoti s species[ J] . Life Sciences , 2005 , 76:1953-1964.
[ 2] 　JENQ J Y , CHUN C L. The possib le us e of peh-hue-juw a-chi-cao as an ant itumour agent and radiop rotector af ter
th erapeu tic i rradiation[ J] . Phytoth erapy Research , 1997(11):6-10.
[ 3] 　梅兵 ,戴平 ,钱 ,等.水线草提取物药理作用的初步研究[ J] .中草药, 2000 , 31(增刊):107-109.
[ 4] 　刘建文主编.药理实验方法学———新技术与新方法[M ] .北京:化学工业出版社 , 2003:27.
[ 5] 　韩锐主编.抗癌药物研究与实验技术[ M] .北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社 , 1997:364.
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