全 文 ：药学学报A 。 ta P卜a r ma e e u6a e S in iea 199 0; 25 (3 ): 16 1 ~ 166
研 究 论 文
裂褶菌抱内多糖和抱外多糖
对小鼠免疫功能的影响 .
夏 冬 林志彬1 马 莉 李兆兰二
(北京医科大学药理学教研室 , 北京 1。。。 8 3 )
提要 裂褶菌抱内多塘 ( S P G O 和抱外多塘 ( S P G s) 是分 slJ 从发酵培养的裂褶菌 菌 丝 体 和
发酵液中提取的多糖 . S P G I 和 S P G : 均能显著促进 C o n A 诱导的小鼠脾淋巴细 胞 增 殖 反 应 .
S P G I还显著地对抗氢可的松对淋巴细胞增殖反应的抑 制作 用 . S P G : 和 S P G : 均可恢 复 14 月
龄老年小鼠低下的脾淋巴细胞增殖反应 . 给小鼠 iP S P G I 和 S P G : 均能显 著 增 强 二 硝 基 氯苯
( D N C B ) 所致小鼠迟发型皮肤过敏反应 ( D CH ) .小鼠 i p S P G : 可显著增强羊红细 胞 ( S R B C )
诱导的小鼠脾脏空斑形成细胞 ( P F C ) 反应 . S P G I 和 S P C : 还可使老年小鼠的 P F C 反应恢复至
成年小鼠水平。
关键词 裂褶菌 , 多糖 ; 淋巴细胞增殖 , 迟发型皮肤过敏反应 , 空斑形成细胞
裂褶菌 ( S e人诬: o p h y l l“ 二 。 o 二二“ , e ) 是担子菌亚门 , 层菌纲 , 伞菌目 , 口 磨 科 , 裂褶
菌属的真菌 。 裂褶多糖 ( S P G ) 系从裂摺菌中提取的多糖 。 日本学者发现 S P G 能显著 抑制
肿瘤生长 ( ” ; 对动物的急慢性感染有防御作用 , 能防御葡萄球菌 、 大肠杆菌 、 绿脓杆菌等多
种细菌引起的感染 ( 2 ) ; 能显著增加脾脏产生抗羊红细胞抗体的细胞数 ` 3 ’ : 并可增强迟发 型
皮肤过敏反应 , 提高细胞免疫功能 ( 召 ) 。 关于裂褶多糖的药理学研究国内还未见报道 , 本文对
裂褶菌抱内多糖 ( S P G , ) 和裂褶菌抱外多糖 ( S P G , ) 对机体细胞免疫功能和体液免疫功能
的调节作用进行了初步探讨 。
材 料 与 方 法
S P G : 和 Sp G : 是从人工培养的裂褶菌的菌丝体和发酵液提取并纯化的两种多糖 。 由南
京大学生物系提供 。 其分子量分别为 10 万和 7 万 , 化学结构均为主链 日 ( 1一 3 ) 结 合 , 支链
p ( 1` ) 结合的葡聚糖 。 均为黄揭色粉末 , 溶于冷水 , 热水可加速其溶解 , 水溶液呈粘稠透
明状 , p H 6 . 9 一 7 . 0 。 体内给药时用生理盐水配制 ; 体外试验时则用细胞培养液配制 , 经滤菌
器除菌 。
动物 C 57 B L /6J 小 鼠 , 2 月龄 , 早了兼用; 瑞士种小鼠 , 2 一 3 月龄及 14 月龄 , 早了兼
用 。
淋巴细胞增殖试验 用 〔3H」胸腺嗜咤核背掺入法进行 ( 。 , . ) 。 无菌取出 C 57 B L 6/ J 小
本文于 19 89 年 9 月 1 日收到 。
*本文为国家自然科学基金资助课题 ; 本文曾在第三属全国杭炎免疫药理学术会议上报告。
申 .南京大学生物系
12 6 药学学报 Ae t a P h ar mae e uti e a Si ni e a 1 9 90 ;2 5 ( 3) : 1 61 ~1 66
鼠脾脏 , 用 R P M I 16 4。 培养液制成一定浓度的脾细胞悬液 。 向 96 孔平底培养板每孔 中分别
加入脾细胞悬液 、 刀豆素 A ( C o n A ) 及不 同浓度的裂褶菌多糖 (进行氢可的松抑制的淋 巴
细胞增殖试验时 ,还需加入适当剂量的氢可的松 ) ,使每孔总体积为 2 0 时 ,脾细胞的终浓度为
2 x l o 6加 1 , C on A 的终浓度为 2 件gm/ 1。 3 7 ’ C , 5肠 C O Z 湿 度饱和培养箱中培养 72 h ,在
结束培养前 6 h 于培养板各孔 内加入 1 . 1 x j护 B q 「3 H ] T d R 。 培养结束后收集细胞 , 用液
体闪烁仪测 「“ H ] T d R 的掺入量 , 以反映细胞增殖程度 。
迟发型皮肤过敏反应的沉定 按文献 ( 7 )方法进行实验 。 将 2 月龄小 鼠按表 4 分 组并 给
药 , 在给药当天用 50 肠二硝基氯苯 ( D N C B ) 丙酮溶液 ( 2 川 /只 ) 涂于小鼠颈部脱毛 的 皮
肤上致敏 , 连续 给 药 g d 。 停药次 日 , 在小鼠腹部脱毛的皮肤上 涂 2 . 5肠 D N C B 丙酮 溶液
( 2 0 俘 1/只 ) 攻击 。 2 4 h 后 , i v l肠伊文斯蓝 ( l o m g / k g ) 。 3 0 m i n 后处死小鼠 , 取其腹 部蓝
染皮肤 , 剪碎 , 浸于 :1 1 生理盐水丙酮液中 36 h , 离心 取上 清 液 , 用 7 21 型 分光 光度 计
以 = 6 1 0 n m ) 测光密度 ( O D ) 值 。
S R BC 诱导空斑形成细胞 ( p F C ) 的测定 将小 鼠按表 5 ~ 6 分组 并 给 药 。 在 给 药 的
d 2 i p 1 0肠 羊红细胞 ( s R B C ) o . Z m l / 只免疫小 鼠 , 4 d 后 按 C u n n i n g h a m 小室法 ( 吕 ’进行
直接溶血空斑试验 , 测定 工g M P F C 。 处死小鼠 , 用 H an k S 液制备浓度 为 8 x 1 0 “m/ 1的脾细
胞悬液 , 将 l 肠的 S R B C 0 . 9 m l 、 补体 80 川 和脾细胞悬液 20 川 混合后填充于两个用载 玻
片制成的小室 内 , 小室剩余空隙用 l 帕的 S R B C 充 满 。 用石蜡封严小室 , 于 37 O C 温 育 l h
后计数空斑 , 结果以 1 0a 脾 细胞中的 P F C 表示 .
结 果
一 对正常小 鼠淋巴细胞增殖反应的影响
表 z 的结果表明 , s p G : ( 1 0 , 2 5 , 5 0 和 10 0 卜gm/ 一) 以及 s p G Z ( 10 , 5 0 和 10 0 件g加 l )
均能显著增强 C o n A 诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应 , 且 S P G I 的作用强于 S P G , 。
T a b 1
.
E f f e c t o f S PG i a n d S P G
、
: o n C o n A in du c e d l y m Pho c y t e P r o li f e r a t io n i n m ie e
D r u g
C o n t r o l
S P G
i
S P G :
S P G i
S P G I
D o s e (协g / m l ) S a也 p l e n u乎 b o r [ 3 H〕T d R i n e o r p o r a t i o n ( e p m 士DS )
3 4997士 8990
70 556士 7416 . * *
69786土 7676* * *
76 135士 77 67…
90068土 10486二 *
12012
1025
C o n t or l
S P q
S P场
S P G -
4 42 20土 9394
6 8126士 6630…
667 31士 7030…
57 808士 10136*
nUó“,15
又士s D , . P < 0 . 05 , * * . P ( 0 . 0 01 , e o m p a r e d w 肚h e o nt or l .
二 . 对氢可的松 ( HC ) 抑制的淋巴细胞增殖反应的形晌
由表 2 可见 , H C ( 0 . 2 卜 g加 1) 显著地抑制小鼠脾淋巴细胞增殖反应 , S P G : ( 10 , 25 ,
50 和 75 卜g / m l) 能明显地对抗 H c 的这种抑制作用 , 使遭受抑制的淋巴细胞增殖反应部分
恢复 , 以 2 5 和 5 0 卜g m/ l 时作用最显著 。 而 S P G : ( 10 , 5 0 和 一0 0 卜gm/ 1) 对 H C 抑制的淋
药学学报 A e ta P h a r m a e e u t i e a S王n i e a 199 0 ; 25 ( 3) : 1 61~ 16 6
巴细胞增殖反应无明显影响 。 将 H c 的剂量降至 0 50 及 0 . 1雌m/ 1时 , S P G Z 亦 不 能 对抗
其对淋巴细胞增殖反应的抑制作用 。
T a b Z T h e a n t a g o n i s t i e e f f e e t o f S P G i a n d S P G Z o n t h e i n h i b i t o r y a e t iv i t y o f
hy d r o e o r t is o n e i n m 0 U S6 Iy m Ph
o e y t e P r o li f e r a t i o n i n d u e e d b y C o n A
G
r o u p D o s e (卜g / m l ) S a m Pl e n u m b e r [ 3 H ] T d R i n e o r p o r a t io n ( e p m 土 S D )
C
o n t r o l
H C
SP G : + H C
SP G
,
+ H C
SP G , + H C
S P G I+ H C
0
.
2
10+ 0
.
2
25+ 0
.
2
50+ 0
.
2
75+ 0
.
2
3852 2土 67 84
9 04 5士 1 825 + + +
12 150士21 17 .
1642 1土307 8 . t 今
192 33士1720* 二
巧904士36 7 0二
C o n t r成
H C
S P G : + H C
S P G Z+ H C
S P场 + H C
0
.
2
10+ 0
.
2
5 0+ 0
.
2
100十 0 一 2
495 7 6土3 17 3
1454 8土 19 16 + + +
1 3917士 3203
14 458士 12 38
22676 土 902 6
又土 s D , + + + P0<
.
0 0一, co m p a er d w i t h e o nt or 一; ’ P< 0 . 05 , * ’ P < 0 . 0 1 , 二 ’ P < 0 . 001 , 。 o m p a r e d w i t h H C
G r o u P
.
三 . 对老年小鼠淋巴细胞增殖反应的影响
与 3 月龄小鼠比较 , 【3 H」 T d R 掺入 C o n A 诱导的 14 月龄小鼠脾淋巴细胞 D N A 的 量
减少 2 6 . 5肠 (表 3) , 即老年小鼠的琳巴细胞增殖反应下降 。 S P G : ( 10 和 2 5 协g加 1)和 S P G Z
(25 陀加 l) 可显著促进老年小鼠低下的淋巴细胞增殖反应 , 但剂量增加 到 50 和 10 妙g m/ 1
时 ,这种促进作用反减弱 ,与未给药的老年对照组相比 , 〔S H 〕 T d R 的 掺入量在统计学上无显
著差异 。 与表 l 的结果相比 , 说明老年动物的药物最适剂量比成年动物小 。
T a b 3
.
E f f e c t o f S PG i a n d S PG Z o n C o n A in d u c e d l y m P ho c y t e Pr o l i f e r a t i o n
i n 14 m o n t n a g e d m i c e
A g
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( m
o n t il ) D
r u g D o s e (协g / m l S a m p le n u m b e r 〔3 H〕T d R in e o r p o r a t io n ( e p m 土S D )
C o n t r o l
C o n t r o l
S P G I
S P G I
S P G I
S P G I
SP G :
S P G :
SP G 吕
S P G名
5 0079士7 552
36812土 269 0+ +
4 18 32 土20 70二
4576 1士4478 * .
40 978土387 6
40 639士6878
38948士4886
42 702士34 84 .
40545士 3896
3 8645 士542 6
65
魂bl匕月O
10250叨
14]
X 土DS , + + P < 0
.
0 1
, 。 o m P a r e d w i th y o u叱 co n t r o l ; . P ( 0 . 05 , * . P < 0 . 0 1 , e o m P a “ d w i t h a g e d c o n t or l .
16 4 药学学报 Ac ta P ha r ma ’ce ut ia e ’S i n ia e 1 990 ; 25(3 ): 16 1 ~6 6 ]
四. 对 O N CB 所致小鼠迟发型皮肤过敏反应( O CH ) 的影响.
表 4显 示 , 给小 鼠 i p S p G : ( 2 . 5 和 5 . 0 m g / k ; ) 和 s p G Z ( 2 . 5 和 5 . o m g / k g ) 共 9
日 , 均可显著增强 D N C B 所致小 鼠迟发型皮肤过敏反应 。
T a b 4
.
E f f e e t o f S P G i a n d S P G Z o n d la y e d一 t y P e h y P e r s e n s i t iv i t y t o Z
,
4一 d i n i t r o -
c h lo r o b e n z e n e
`
in m i e e
G r o u P D o s e m g / ( k g
·
d ) i p N o
.
o
f m i ce S k i n r e a e t io n (O D入= 6 ! 0 n m )
C o n t r o l
S P G I
S P G I
S P G Z
S P G Z
2
。
5 只 9
5
.
0 大 9
2
.
5 X 9
5
。
0 X 9
0
.
057 士0 . 010
0
.
083士0 . 0 14…
0
.
104士0 . 036 * .
0
.
074士0 . 0 19 .
0
.
; 17士0 . 034二 *
n”q`Q甘,l.ōj几,1
X 土 SD , * P < 0 . 05 , , * P < 0 . 0 1 , . * * P < 0 . 00 1 , 。 o m p a er d w i th e o n t r o l .
五 . 对 S RB C 诱导的空斑形成细胞 ( P F C ) 的影响
如表 5 所示 , 在剂量为 1 . 25 , 2 . 5 和 5 . o m g / k g 时 , s P G , 能显著增加脾细胞中 P F c 的
数目。 剂量增至 10 m g / k g 时 , P F C 反减少 , 表明剂量过大反而抑制机体的免疫反应 。 S P G ,
( 2
.
5 和 5 . 0 0 9 / k g ) 亦使脾细胞中的 P F C 显著增加 。 ,
T a b 5
.
E f f e e t o f S PG : a n d S P G : o n P l a q u e f o r m i n g e e l l ( P F C ) r e s P o n s e t o S R B C i n m i e e
G r o u P D o s e m g / ( k g
·
d ) i 。 N o
。
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八n月t)
C o n t r o l
S P G i
S P G i
1
.
25 X I
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.
00 X I
2038土4R8
3231士438 * *
1188士812
C o n 乞r o l
S P G i
S P G i
2
.
5 X I
5
.
0 X I
13 88 士356
2 169土369 . *
2 181土775 *
丹匕一b
C o n t r o l
S P几
S P几
2
.
5 X I
5
.
0 X I
1862土243
3 121土780 * .
2 841土840 .
. P < 0
.
05
, 二 P < 0 . 01 , c o m p a r e d w i t il c o o t r o l .
T a b 6
.
E f f e e t o f S p G : a n d S p G : o n p l a q u e f o r m i n g e e l l ( p F C ) r e s po n s e t o S R B C
i n 14 m o n t hs a g e d m i c e
A ge (m
o n th ) G r o u p
C o n t r o l
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SP GI
S P G :
D o s e 二 g / ( k g · d ) i p N o . o f m ic e P F C八 0。 , p l e e n e e l ls (X 土 S D )
魂b丹b
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。
5 X I
2
.
5 X I
240 3土 530
1048 土 354+ + +
2747土 56 5…
247 3士 47 9…
QJ左ù连ō
` .占曰几甩1
+ + + P < 0
.
002
, e o nz 件 et d w i , h 了。 。 。 9 e o n t r o l , 二 * . P < 0 . 001 , c o二 P a e dt , 二t h a g e d c o n t r o l .
药学学报 A et a P h乙r m么 e`ut i a eS i ni a e 19 90 ;2 5 ( 3) : 16 1~ 166 16 5
六 . 对S R BC 诱导的老年小鼠空斑形成细胞 ( P FC) ` 的影响
表6 的结果指出 , 老年对照组的 P F C 显著地减少 , 与年轻组相比减少了 56 . 4肠 。 S P G ,
和 S P G : (剂量均为 2 . s m g / k g ) 可显著地促进老年小鼠 P F C 反应 , 两药分别使 其 增 加 了
16 2
.
1 和 1 36 . 0肠 , 使老年小 鼠 P F C 反应恢复到年轻小鼠的水平 。
讨 论
为了较全面地研究裂褶菌多糖的免疫药理作用 , 特别是探讨其对不同原因所致机体免疫
功能抑制的影响 , 本实验不仅观察了两种裂褶菌多糖对正常机体免疫功能的调节作用 , 而且
还观察了它们对老年性免疫功能缺陷的影响以及对免疫抑制剂所致免疫功能 抑制 的恢复作
用 。
C on A 诱导的淋巴细胞增殖反应和迟发型皮肤过敏反应分别是体外及体内检 测 T 细胞
功能的方法 ,可反映机体细胞免疫反应的水平 。从实验结果看出 , 体外培养时 , 10 一 10 卜gm/ l
的 S P G , 和 S P G : 均可提高 C o n A 诱导的小鼠淋巴细胞 增殖 反应 ; 一定 剂量 的 S P G : 还
可明显对抗氢可的松对 C o n A 诱导的淋巴细胞增殖反应的抑制作用 ,使淋巴细胞的增殖有所
恢复 ; 给小鼠腹腔注射这两种多糖 , 使 2 , 4一二硝基氯苯所致的小鼠迟发型皮肤过敏反应显
著增强 。 因此 , 从体外和体内试验均体现出 S P G , 和 S P G , 具有促进机体细胞免疫功能的作
用 。 日本学者铃木宗司等只是发现裂褶菌多糖可促进三硝基氯苯引起的小鼠耳朵皮肤的迟发
型过敏反应 ( 4 ) , 而对淋巴细胞增殖反应的影响未见报道 。
P F C 是一种体外检测单个抗体形成细胞的方法 。 它不仅可作为免疫基本理论研 究的工
具 ,而且还可作为研究药物对机体体液免疫功能影响的特异指标 。 本实验结果表明 , ip 一定剂
量的 S P G , 和 S P G : 均可显著增加正常小 鼠脾细胞中抗体形成细胞的数 目 , 这与日本学者的
报道是一致的 ` “ ’ 。 由此推测 , 裂褶菌抱 内多糖和抱外多糖对机体的体液免疫功能也有一定促
进作用 。
衰老现象是生命过程中出现的生理衰退变化 , 其中包括免疫系统功能的改变 。 本实验结
果表明 , 14 月龄的老年小鼠与 3 月龄年轻小鼠相比 , C o n A 诱导的淋 巴细胞 增殖 反应 及
S R B C 诱导的抗体形成细胞的数目均明显降低 , 即老年动物的细胞免疫及体液免疫功能均低
下 。 给予一定剂量的 . S P G , 或 S P G : 可 增强 14 月龄小鼠细胞增殖反应的能力 ,也可提高老年
小鼠抗体形成细胞的数目 , 使其恢复到年轻小 鼠的水平 。 由此提示 , S P G : 和 S P G , 可恢复老
年动物低下的细胞免疫及体液免疫功能 , 对延缓衰老可能有一定的意义 , 值得进一步深入研
究 。
参 考 文 献
1
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a
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U l t r a s o n i e d e g r a d a t io n o f S e h i : o ph y l la n
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A B ST R AC T S P G a a n d S P G
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m e n t e d e u l t u r a l m y e e l i u m a n d f e r m e n t a t i o n f l u id o f S e h i z o Ph y l乙u m e o 撰扭 u 林 e . T h i s p a p e r
r e p o r t s 舌h e e f f e e t o f S P G ; a n d S P G : o n e o n e a n a v a l i n A ( C o n A ) i n d u e e d p r o l i一
f e r a t i o n o f ly m p h o e y t e f r o m C
, 7 B L / 6 J m i
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林g / m l ) a n d S p G Z ( 10
,
5 0 a n d 10 0 卜; / m l ) w a s f o u n d t o s i g n i f i e a n t l y i n e r e a s e I y二 p h o -
e y t e p r o l i f e r a t i o n
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I n a dd i t i o n
,
S P G : ( 10
,
2 5
,
5 0 a n d 7 5 协g / m l ) a n t a g o n i z e d t h e
s u P p r e s s i v e e f f e e t o f h y d r o e o r t i s o n e o n p r o l i f e r a t i o n o f 爪 o u s e s P l e e n e e l l s , w h i l e
S P G
:
d i d n o t
.
I t 0 10 0
, a t t h e d o s e o f 2
.
5 a n d 5
.
0 m g / k g ip f
o r 9 d a y s
,
S P G :
a n d S P G a r e m a r k a b l y e n h a n e e d t h e d e l a y e d一 t y P e h y p e r s e n ` i t i v i t y t o Z , 4一 d i n i t r o 一
e h l o r o b e n z e n e ( D N C B ) i
n o i e e
.
S P G : ( 1
.
2 5
,
2
.
5 a n d 5
.
0 m g / k g
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i p f o r 1 d a y ) a
n d
S P G
Z
( 2
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5 a n d 5
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0 m g / k g
,
i p f o r 一 d a y ) p r 0 0 0 t e d t h e p l a q u e f o r m i n g e e l l ( P F C )
r e s P o n s e t o s h e e p r e d b l o o d e e l l s ( S R B C ) i
n m i e e
.
T h e e f f e e t s o f S P G , a n d S P G
Z
o n i m o u n e f u n e t i o n w e r e s t u d i e d i n a g e d io m u n o d e f i e i e n t m i e e
.
S P G , ( 1 0
a n d 2 5
卜 g / m l ) a n d S p G Z ( 2 5 协g / m l ) w a s f o u n d t o e n h a n e e t h e C o n A i n d u e e d l y甩p h o c y t e
p r o l i f e r a t i o n i n 一4 m o n t h s a g e d nt i e e . A t t h e d o s e o f 2 . 5 m g / k g , S P G , a n d
S P G
: p r o d u e e d r e s p e e t i v e ly 1 6 2
.
1 a n d 13 6
.
0% i n e r e a s e i n P F C r e s p o n s e i n 1 4
m o n t h s a g e d m i e e
.
Ke y w o r d s S e耘i z o P人y乙乙“ 水 e o拼协 u 林。 ; P o ly s a e e h a r i d e ; L y爪 p h o e y t e p r o l i f e r a t i o n ;
D e l a y e d一 t y p e h y p e r s e n s i t i v i t y ; P l a q u e f o r m i n g e e l l ( P F C )
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