全 文 ：　 第 40卷　第 5期 　
2010年 5月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERS ITY OF CHINA
40(5):011～ 014
May , 2010
研究简报
宽礁膜多糖酸的水解条件＊
李红燕 , 齐晓辉 , 郭守东 , 陈 　荫 , 陈艳丽 , 徐　健 , 赵春琦 , 叶　欣 , 毛文君＊＊
(中国海洋大学医药学院 , 山东 青岛 266003)
摘　要:　采用 0.1 mol/ L H2 SO4对热水提宽礁膜多糖进行酸水解 ,研究了水解过程中不同的反应温度和反应时间对宽礁膜
多糖分子量的影响。通过控制反应温度和反应时间 , 得到了分子量在 155.0～ 3.9 kDa间的低分子量宽礁膜多糖。结果表
明 , 反应温度的升高 , 反应时间的延长都有利于宽礁膜多糖分子量的降低 , 但温度较时间的影响要明显。
关键词:　多糖;水解;分子量
中图法分类号:　Q949.29　　　　　文献标志码:　A　　　　　文章篇号:　1672-5174(2010)05-011-04
　　宽礁膜(Monostroma lat issimum)属于礁膜属绿
藻 ,藻体为膜状 ,黄绿色或淡黄色 ,体柔软而光泽 ,一般
个体较小 ,藻体边缘多襞褶。生长季节为 12 月至次年
5月 。生长在内湾水静处的中高潮带荫蔽处的岩石上
或具有泥沙的石块上 。我国沿海各岛均有分布。宽礁
膜含量大量的多糖 、维生素 、脂肪酸 、氨基酸 、微量元素
以及无机盐等。广泛应用于食品 、医药 、化妆品等领
域。通过与海带和紫菜进行营养学评价 ,结果表明 ,宽
礁膜中必需氨基酸的化学评分为 91分 ,可作为保健品
和药物的优质原料[ 1] 。
文献报道礁膜属多糖具有多种生物学活性 ,如抗
凝血[ 2-3] 、抗氧化[ 4] 、抗病毒[ 5] 及抗辐射[ 6] 等。研究表
明[ 7] 宽礁膜多糖主要是由硫酸鼠李糖组成的均聚糖 ,
宽礁膜低分子量多糖的抗凝血效果和肝素相当 ,因此
对于宽礁膜低分子量多糖的研究具有重要的意义 。
与蛋白质或核酸大分子比起来 ,多糖结构要复杂
的多 ,直接对其研究比较的困难 ,但解析多糖的结构对
于明确其生物学功能具有重要的意义。目前多糖的水
解方法可分为化学法 、物理法和酶降解法[ 8] 。化学法
又包括酸水解法和氧化降解法 ,因酸水解法操作简单
方便且比较经济 ,因此本文采用酸水解的方法对宽礁
膜热水提多糖(553.0kDa)进行水解 ,得到分子量较小
的片段 ,为宽礁膜多糖结构的研究奠定了基础 ,同时对
于其它多糖结构的研究也具有一定的参考价值。
1　实验部分
1.1 仪器与材料
宽礁膜(M.lat issimum)采自我国浙江省海域 ,原
料用自来水洗净 ,除去泥沙 、杂藻 ,自然风干后于 40 ℃
烘箱内充分干燥 ,粉碎机粉碎 ,室温冷水提取后残渣于
100 ℃水浴中提取 2次 。冻干后待用。不同分子量葡
聚糖标准品(Mw :5.9 , 11.8 , 22.8 , 47.3 , 112 , 212 ,
404 ,788 kDa),日本Shodex 公司;鼠李糖(Rha)和葡萄
糖(Glc), Sigma 公司 。
515型高效液相色谱仪 ,美国Wate rs公司;3000Xi
电泳仪 ,美国 Bio-Rad公司;Hoefer MiniVE 垂直电泳
槽系统 , Pharmacia公司;BS2000S 电子分析天平 ,北京
赛多利斯天平有限公司;恒温水浴锅;乌氏粘度计 。薄
层板 Silica gel60 F254 plate (德国 Merck 公司)。浓硫
酸 、氢氧化钠 、硫酸钠 、苯胺 、二苯胺 、阿利新兰等均为
分析纯。
1.2 降解条件的初步选择
宽礁膜热水提多糖配成质量浓度 1%溶液 ,加入一
定量的 H2 SO 4 ,分别在下列条件下反应:40 ℃, 0.05
mo l/ L H 2 SO 4 ;60 ℃, 0.05 mol/L H 2 SO4 ;80 ℃,
0.05 mol/L H2SO4 ;40 ℃, 0.1 mol/L H 2SO 4 ;60 ℃,
0.1 mol/ L H 2SO 4 ;80 ℃, 0.1 mol/ L H 2 SO 4 。反应
过程中不断搅拌每隔 1 h测定相对粘度的变化 。即反
应 1 ,2 ,3 , 4 , 5 ,6 ,7 h 时分别测定相对黏度 。黏度的测
定参照中华人民共和国药典 ,用乌氏黏度计于 25 ℃测
定反应液(1%,w/v)及蒸馏水的流出时间并根据公式
ηr = T /T 0计算相对黏度 , T 为反应液的流出时间 , T0
为溶剂蒸馏水流出时间 ,重复测定 2次 ,测定值相差不
超过 0.1 s ,取 2次的平均值 ,计算反应液的相对黏度 。
1.3 降解产物制备
取宽礁膜热水提多糖样品配制成质量浓度为 1%
＊
＊＊
基金项目:国家科技支撑计划(2008BAD94B04);山东省攻关计划(2006GG2205014);山东省自然科学基金(Y2007D03)项目资助
收稿日期:2009-12-10;修订日期:2010-01-11
作者简介:李红燕(1981-),女 ,博士生。 E-mail:lih ongyan1447@163.com
通讯作者:Tel:0532-82031560;E-mai l:wenju nm@ouc.edu.cn
中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 1 0 年
溶液 ,加一定量的硫酸使其最终浓度为 0.1 mol/L。在
不同的温度(40 , 60 , 80 ℃)下 ,搅拌反应 ,每隔一定的
时间取样 ,冷却后氢氧化钠中和至 pH =7.0 ,冷冻干燥
备用 。
1.4 T LC 薄层色谱分析
取酸水解后的多糖样品溶液适量进行薄层分析。
高效硅胶板在 100 ℃活化 0.5 h ,移液器点样 ,吹干 ,于
层析缸中展开 ,展开结束后吹干 ,放入显色剂中显色 ,
取出吹干 , 200 ℃加热显色。展开剂:正丙醇∶水∶三
乙胺=60∶30∶0.7(体积分数),显色剂为苯胺-二苯
胺。
1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAG E)分析
采用 5%的浓缩胶 ,22%的分离胶分析多糖降解产
物的降解情况。电压 200 V ,时间 90 min 。0.5%阿利
新兰(2%乙酸)溶液染色 。2%乙酸脱色 。
1.6 分子量的测定
采用高效液相色谱法(HPGPC)测定多糖的分子
量。分析柱为 Shodex Ohpak SB-804 HQ 柱;流动相为
0.1 mol/L Na2SO4 ;流速为 0.5 mL/min;柱温为 35 ℃;
进样量为 20 μL;示差检测器检测 。葡聚糖标准品
(Mw:5.9 , 11.8 , 22.8 , 47.3 , 112 , 212 , 404 , 788 kDa)
制成 5 mg/mL 的标准溶液 ,分别进样 20μL ,根据不同
分子量标准样品的保留时间不同 ,以标准多糖分子量
的对数(log Mw)对保留时间(tR)作图 ,绘制标准曲线;
降解后的多糖样品稀释成一定浓度溶液 ,进样 20 μL ,记
录示差色谱图。运用分析软件根据标准回归方程计算
样品的分子量。
2　实验结果与讨论
2.1 不同降解条件下降解产物相对黏度变化分析
在不同的反应温度 ,不同浓度的 H 2SO4降解宽礁
膜热水提多糖相对黏度的变化如图 1所示。从图中可
以看出 ,在相同的硫酸浓度下 ,随着温度的升高 ,降解
液的相对黏度减小即多糖的降解程度增大。在相同的
温度条件下 ,随着酸浓度的增大 ,降解液的相对黏度也
趋于减小即多糖的降解程度加剧。硫酸对于多糖的降
解主要集中在 2 h 以内 ,在随后的时间里 ,相对黏度的
变化幅度明显减小 ,曲线趋于平缓。因在相同温度而
不同酸浓度条件下 ,酸浓度大时得到的降解产物的的
相对黏度较小 ,即得到的降解产物的分子量较小。为
缩短反应时间 ,故选取 0.1 mol/L H2 SO 4来降解宽礁
膜多糖以制备不同分子量的宽礁膜低分子量多糖。
图 1　不同降解条件下降解产物的相对粘度变化
Fig.1　Relative viscosity variations of deg rada tion
pr oducts in different deg raded conditions
2.2 薄层色谱法
对 0.1 mol/ LH 2 SO 4在不同温度(40 ℃, 60 ℃,
80 ℃)不同降解时间点的样品进行 TLC 分析 ,结果如
图 2所示。不同温度的取样时间点为:40 ℃:0.5 h , 1
h ,4 h , 12 h , 1 d ,3 d ,5 d , 7 d , 9 d , 11 d;60 ℃:3 h ,12
h ,1 d ,2 d ,3 d ,5 d;80 ℃:0.5 h ,1 h ,1.5 h ,2 h ,2.5 h ,
3 h , 4 h ,5 h ,7 h , 9 h。
图 2　0.1 mo l/ L H2 SO4反应温度为 40 ℃, 60 ℃, 80 ℃时 , 不同时间点的降解样品的 TLC 分析
Fig.2　T LC ana ly sis o f hydroly sis products at different temperature(40 ℃, 60 ℃, 80 ℃)in 0.1 mol/ L H 2SO 4
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5期 李红燕 ,等:宽礁膜多糖酸的水解条件
　　通过对以上不同温度和不同反应时间多糖酸水解
产物的 T LC分析图中可以看出 ,随着反应温度的升高
和反应时间的延长 ,处于原点的多糖量逐渐减少 ,降解
产物的 Rf值逐渐增大。由于 T LC 更适于对寡糖进行
分析 ,对于分子量较大的多糖(DP >20)其极性也较
大 ,则化学迁移较小或仍停留在原点 ,故 TLC 不能有
效的对降解多糖进行分析 ,只能看出其降解的程度(原
点处样品溶液颜色的深浅)。
2.3 PAGE法
对 40 ℃、60 ℃、80 ℃,由 0.1 mol/L H2 SO4降解
的不同时间点的多糖样品进行 PAGE检验分析。不同
温度的取样时间点为:40 ℃:0.5 h ,1 h ,4 h , 12 h ,1 d ,
3 d ,5 d ,7 d ,9 d ,11 d;60 ℃:0.5 h ,3 h ,12 h , 1 d ,1.5
d , 2 d ,3 d ,5 d ,7 d;80 ℃:0.5 h , 1 h ,1.5 h , 2 h ,2.5
h ,3 h ,4 h ,5 h ,7 h , 9 h 。将降解后多糖样品配制成浓
度约为 5 mg/mL 的溶液 ,取样品溶液10μL 与 50%的
蔗糖 10μL 充分混合 ,上样 10μL。在 200 v 的电压下
电泳 90 min。不同温度不同时间条件下多糖降解情况
如下图 3所示 。
图 3　0.1 mo l/ L H2 SO4反应温度为 40 ℃, 60 ℃, 80 ℃时 , 不同时间点的降解样品的 PAGE 分析
F ig.3　PAGE analy sis of hydro ly sis pr oducts at different temperature(40 ℃, 60 ℃, 80 ℃)in 0.1 mo l/ L H2 SO4
通过对水解产物的 PAGE 分析 ,在 40 ℃时 ,随降解时
间的延长多糖的水解程度增大 ,但仍有大量的多糖处
于原点位置 ,60 ℃时 ,随着降解时间的延长 ,处于原点
的多糖逐渐减少 ,80 ℃时 ,随降解时间的延长 ,原点处
的多糖量逐渐减少并且多糖的迁移距离越来越大 ,即
低分子量的多糖增多 ,降解后的多糖因其结构的不规
律性 ,在 PAGE图中呈带状分布 。
2.4 水解产物分子量的测定
在 0.1 mo l/L H 2SO4 40 ℃、60 ℃、80 ℃条件下水
解宽礁膜热水提多糖(553.0 kDa),不同温度的取样时
间点设置为:40 ℃:0.5h , 1 h ,4 h , 12 h ,1 d , 3 d ,5 d ,7
d ,9 d ,12 d;60 ℃:3 h , 12 h ,1 d ,2 d , 4 d , 5 d;80 ℃:
0.5 h , 1 h ,1.5 h , 2 h ,2.5 h ,3 h ,4 h ,5 h ,7 h ,9 h。不
同反应时间得到不同分子量大小的低分子量宽礁膜多
糖。在不同温度下反应时间与水解产物分子量大小关
系如图 4所示。在 0.1 mo l/L H2 SO4 40 ℃的条件下 ,
0.5 h后随着反应时间的延长 ,降解产物的平均分子量
均小于 160 kDa 。要得到分子量大于 100 kDa的低聚
糖片段 ,反应时间要小于1 h;要得到分子量在 50 ～ 100
kDa的低聚糖片段 ,反应时间不得超过 3 d;要得到分
子量范围在 10 ～ 50 kDa的低聚糖片段 ,反应时间控制
在 5 ～ 11 d 。在 0.1 mo l/L 硫酸 60 ℃的条件下 ,要得
到分子量在 10 ～ 50 kDa的低聚糖片段 ,反应时间不得
超过 1 d ,要得到分子量小于 6 kDa 的低聚糖片段 ,反
应时间要超过 2 d。在 0.1mol/ L H 2SO 4 80 ℃的条件
下 ,反应时间超过 0.5 h后 ,降解产物的平均分子量均
小于 30 kDa。时间超过 4 h后 ,降解产物分子量已降
至 10 kDa以下。而要得到分子量在 10 ～ 30 kDa 的低
聚糖片段 ,反应时间要控制在 0.5 ～ 4 h之间 。
图 4　0.1 mo l/ L H2 SO 4 40 ℃, 60 ℃, 80 ℃水解产物分子量与降解时间的关系图
Fig.4　The relationship of hydro ly sis products mo lecular w eight and reaction time in 0.1 mol/ L H 2SO 4
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中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 1 0 年
　　通过对宽礁膜热水提多糖在 0.1 mol/L H2 SO4不
同温度不同时间水解产物结果的分析比较可知 ,对于
相同的酸浓度和反应温度 ,随着反应时间的延长分子
量逐渐减小 ,但减小的程度随时间的延长趋缓 。即分
子量大小变化不大 。在 0.1 mo l/L H2 SO 4和时间 1 h
恒定的条件下 ,温度为 40 ℃时 ,宽礁膜粗多糖分子量
由 553.0 kDa 降至 77.0 kDa 。而温度为80 ℃时 ,降解
1h后宽礁膜粗多糖分子量由 553.0 kDa 降至约 25.6
kDa。即对于相同的酸浓度 ,相同的反应时间 ,随温度
的升高 ,分子量迅速的减小 , 分子量大小变化比较明
显。则温度较时间对多糖分子量变化具有较大的影
响。
通过以上的比较可得知:在 0.1 mol/L H2 SO 4条
件下 ,通过改变反应的温度和时间均可得到不同分子
量的宽礁膜低分子量多糖片段。这为制备不同分子量
宽礁膜多糖提供了条件。并为其最小活性片段的寻找
及宽礁膜多糖构效关系的研究奠定了基础。
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Extrated fromMonostroma latissimum (Chlorophyta)
LI Hong-Yan , QI Xiao-Hui , GUO Shou-Dong , CHEN Yin , CHEN Yan-Li ,
XU Jian , ZHAO Chun-Qi , YE Xin , MAO Wen-Jun
(School of Medicine and Pha rmacy , Ocean Univ ersity of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:　The polysaccharide ex t racted f rom the marine green alg ae Monostroma lat issimum w ith hot
w ater w as deg raded using 0.1mol/ L H 2SO4 .The temperature and t ime o f react ion w ere studied in o rder
to get different low mo lecular w eight po ly saccharides.The poly saccharides w ith molecular weight 155.0-
3.9 kDa w ere obtained by changing the react ion tempe rature and time.The results showed that the mo-
lecular weight of the poly saccharide could be decreased when the temperature o f reaction w as increased
and the time was prolonged during the hydroly sis.Moreover , the temperature of reaction had g reater in-
f luence on the molecular size o f poly saccharide than the react ion t ime.
Key words:　poly saccharide;hydroly sis;mo lecula r w eight
责任编辑　徐　环
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