全 文 ：第 6期
文章编号: 1008－830X(2013)06－0503－05
铜藻粗多糖酶法提取工艺的优化及其抗氧化活性研究
刘丽佳，何淑婷，姜 露，薛 露，杨 玲，曲有乐
（浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山 316022）
摘 要：通过正交试验法对铜藻中粗多糖的酶法提取工艺进行优选，并测定其 1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基的清
除能力、超氧阴离子自由基（O2-）及抗脂质过氧化能力；优化后铜藻粗多糖提取率为 5.61%，具有一定的 DPPH自由基清除能
力、抗脂质过氧化能力、O2-清除能力。
关键词：铜藻；多糖；正交实验；抗氧化活性
中图分类号：Q539 文献标识码：A
Study on Polysaccharide Extraction and its
Antioxidative Activity from Sargassum herneri
LIU Li-jia, HE Shu-ting, JIANG Lu, et al
(Food and Pharmacy School of Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)
Abstract: Polysaccharide was extracted by enzymes from brown algae(Sargassum herneri) using orthogonal
experiment in this study, and antioxidative activity of extracted polysaccharide was investigated in vitro. An－
tioxidative activity extracted polysaccharide was evaluated with the scavenging capacity of DPPH, free radical
(O2-) and lipid peroxidation in vitro. After optimized the copper extraction rate of algal polysaccharides was
5.61% and extrated polysaccharide possess the capacities of scavenging DPPH and free radical(O2-) and protect
lipid from peroxidation.
Key words: Sargassum herneri; polysaccharide; orthogonal experiment; antioxidative activity
铜藻 Sargassum herneri（Tarn）Ag.俗称“丁香屋”（南麂岛），属褐藻类，马尾藻属 Sargassum。铜藻在民间
可全藻用药，其化学成分特别是有生物活性的特效成分研究得较少，仅见报道含褐藻酸、甘露醇和多糖等
的成分[1-2]，可见该藻并未得到有效的开发利用。
近些年来，我国对海洋来源多糖的研究日益广泛，已有研究表明海洋多糖具有抗衰老、抗辐射、抗病
毒、抗心血管疾病及抗氧化等活性等功能[3-7]，其中，海藻多糖已有很多研究表明具有免疫调节功能、抑制
肿瘤活性及抗病毒等作用，因此越来越受到研究者的关注。为了提高提取效率，笔者采用复合酶法提取铜
浙江海洋学院学报(自然科学版)
Journal of Zhejiang Ocean University(Natural Science)
第 32卷 第 6期
2013年 11月
Vol．32 No．6
Nov,2013
收稿日期：2013-07-15
基金项目：舟山市科技计划项目（2012C33004）；浙江省自然科学基金（LQ13C200002）；2012年浙江海洋学院大学生科技创新项目
作者简介：刘丽佳（1986-），女，黑龙江佳木斯人，硕士研究生，研究方向：海洋天然产物与健康.
通讯作者：曲有乐（1960-），男，教授，研究方向：海洋药物.
浙江海洋学院学报(自然科学版) 第 32卷
藻中的多糖，并运用正交试验方法，对铜藻多糖的提取工艺进行优化，并对其多糖的体外抗氧化活性进行
研究，为后续铜藻多糖的开发提供理论依据。
1材料与方法
1.1仪器
UV-1100紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；FW80万能粉粹机，天津市泰斯特仪器有限公
司；BSA323S精密电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HWS12电热恒温水浴锅，上海一恒科技
有限公司；SB4200DT 超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；FEB85-2恒温磁力搅拌器，常州国
华电器有限公司。
1.2试剂
铜藻，舟山嵊泗岛采得，由浙江海洋学院药学系鉴定；葡萄糖（百灵威科技有限公司）；纤维素酶
（10 000 U/g，上海金穗生物科技有限公司）、中性蛋白酶（50 000 U/g，上海金穗生物科技有限公司）；苯酚、
浓硫酸、95%乙醇、氢氧化钠、盐酸等均为分析纯试剂。
1.3葡萄糖标准曲线
采用苯酚—硫酸比色法[8]
精密称取 0.050 g 分析纯葡萄糖，水定容至 100 mL，此溶液为
500 μg/mL的葡萄糖标准溶液，吸取 0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50
mL葡萄糖标准溶液，加入超纯水至 2.0 mL，再加入 1.0 mL 5%苯酚，
漩涡混悬器混匀后快速加入浓硫酸 7.0 mL，边加边剧烈震摇，室温下
放置 30 min，λ=485 nm处测定其紫外吸收 A。横坐标为吸光值 A，纵
坐标为葡萄糖质量浓度，绘制标准曲线。绘制的标准曲线如图 1所
示。
1.4多糖的提取及测定
取铜藻粉末 20 g，过 20目筛，按一定料液比加水，经过热水提取法提取后，离心、取溶液，加入 3%的
H2O2，4 ℃保温 2 h，浓缩后加入乙醇，使含醇量为 70%，沉淀过夜，抽滤，滤渣加水溶解后，Sevage法脱蛋
白，即为铜藻粗多糖溶液，苯酚硫酸法测多糖含量。
1.5铜藻多糖提取过程中的单因素影响研究
1.5.1酶解 pH对铜藻多糖提取率的影响
在提取温度为 60 ℃，加混合酶（纤维素酶：中性蛋白酶=2:1，w/w）量为 2%（混合酶：干铜藻粉(w/w)），提
取时间为 90 min，酶解 pH分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的条件下，考察酶解 pH值对铜藻多糖提取率的影
响。
1.5.2酶解时间对铜藻多糖提取率的影响
在 pH为 4.5，提取温度为 60 ℃，加混合酶（纤维素酶：中性蛋白酶=2:1，w/w）量为 2%（混合酶：干铜藻
粉(w/w)）的条件下，分别酶解 50、70、90、110、130 min，考察酶解时间对铜藻多糖提取率的影响。
1.5.3加酶量对铜藻多糖提取率的影响
在 pH为 4.5，提取温度为 60 ℃，酶解时间为 110 min，加酶量分别为 0.5%、1%、2%、3%、4%的条件下，
考察加酶量对铜藻多糖提取率的影响。
1.6正交试验
在单因素试验的基础上，设计考察酶解时间（A）、加酶量（B）、酶解 pH（C）和酶解温度（D）对多糖提取
率的影响。每个因素各取 3个水平进行正交试验设计，选用四因素三水平正交法研究酶法提取铜藻多糖。
正交试验因素水平见表 1。
图 1 葡萄糖标准曲线
Fig.1 Glucose standard curve
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第 6期
1.7不同提取方法的铜藻多糖抗氧化活性及还原性研究
1.7.1铜藻多糖对 DPPH自由基清除作用[9]
配制浓度为 0、2、4、6、8和 10 mg/mL的样品溶液，取 1.0 mL加入 0.004% DPPH溶液 4.0 mL，混匀后
暗处放置 30 min，测定其 λ=517 nm处吸光度值 A。
清除率计算公式为[(A0-A1)/A0]×100%
其中 A0为乙醇加 DPPH溶液的吸光度；A1为待测液加 DPPH溶液的吸光度。
1.7.2抗脂质过氧化能力的测定[10]
配制溶液：①浓度 0.1 mol/L、pH为 7.45的 PBS缓冲溶液；②卵黄悬液：1:25（V(卵黄)：V(PBS)）；③铜藻多
糖溶液浓度为 0、2、4、6、8和 10 mg/mL。取试管中分别加入卵黄悬液 0.4 mL及不同浓度铜藻多糖待测溶液
1.0 mL，再加入 25 mmol/L的硫酸亚铁 0.4 mL，PBS定容至 4.0 mL，37 ℃恒温振荡器中孵育 15 min后，加入
20%的三氯乙酸(TCA)1.0 mL，室温静置 10 min，3 500 r/min离心 10 min，取上清液 4.0 mL于试管中，加入
0.8%的硫代巴比妥酸(TBA)溶液 2 mL，置于沸水浴中反应 15 min，室温冷却，以 PBS调零，λ=532 nm处测定
吸光度值 A。
抑制率 I/% =(A0-A)/A0×100%。其中 A0为对照管的吸光度；A为样品的吸光度。
1.7.3超氧阴离子自由基清除能力的测定[11]
配制溶液：①0.05mol/L、pH为 8.2的 Tris-HCl②铜藻多糖溶液浓度为 0、2、4、6、8和 10 mg/mL。试管中
分别加入 Tris-HCl缓冲液 3 mL，再分别加入铜藻多糖溶液 0.20 mL（对照组用蒸馏水代替）。置于 25 ℃电
热恒温气浴箱中孵育 10 min后，各管加入 25 ℃预温的 30 mmol/L的邻苯三酚 12 μL，漩涡混悬器混匀后，
精确反应 4 min，各管加入 0.50 mL浓盐酸终止反应，于 λ=320 nm处测定吸光度值，Tris-HCl缓冲液作为
空白管。
清除能力 E=(A 对照-A 样品)/(A 对照-A 空白)×100%。其中 A 空白为 Tris-HCl缓冲液的吸光度值；A 对照为未加
多糖样品管吸光度值；A 样品为加样品的吸光度。
2结果与分析
2.1单因素试验
从图 2可以看出，提取率的影响较大，亦可从曲线中得出正交试验所需的 3水平。
2.2正交试验
正交试验结果和极差 R分析表明，对多糖提取率影响的主次因素依次是温度＞pH＞加酶量＞时间（表 2）。
综合可知，铜藻多糖酶解的最佳提取条件为：A1B2C1D2，即为：时间 70 min，加酶量 2%，pH 4.0，温度 60 ℃。
表 1 正交试验因素与水平
Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment with water extract
1
2
3
70
90
110
1%
2%
3%
4.0
4.5
5.0
50
60
70
水平
因素
A
酶解时间/min
B
加酶量 *
C
酶解 pH
D
酶解温度/℃
注：* 酶用量=酶:干铜藻粉(w/w).
图 2 pH（A）、时间（B）和加酶量（C）对铜藻多糖提取率的影响
Fig.2 Effect of pH(A), extraction time (B) and the content of enzyme (C) on the extraction of polysaccharide
刘丽佳等： 铜藻粗多糖酶法提取工艺的优化及其抗氧化活性研究 505
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2.3抗氧化活性测定结果
从图 3(A) 可以看出，不同浓度的铜藻多糖对 DPPH自由基具有一定的清除能力，当多糖的浓度为 10
mg/mL时，清除率达到 33.9%，清除率随浓度增大而增大，其中水提取多糖 DPPH自由基清除能力较超声
及酶解法多糖稍强。
从图 3(B)中可看出 3种提取方法的多糖均具有较强的抗脂质过氧化能力，50.8%随多糖浓度升高而增强，
多糖抗脂质过氧化能力强弱大体上看水提法强于超声法强于酶解法，超声和酶解法对多糖的破坏是影响
多糖抗脂质过氧化能力的主要原因。
从图 3(C) 中可知铜藻多糖有超氧自由基清除能力，多糖浓度为 10 mg/mL时，超氧自由基清除能力
28.05%，但较抗坏血酸弱很多。同样，水提方法多糖的清除能力强于超声和酶解法，并与多糖浓度成正比
关系。
表 2 酶法正交分析表
Tab.2 Orthogonal experiment of enzymatic
实验号 时间/min 加酶量 pH 温度/℃ 多糖提取率/%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
均值 1
均值 2
均值 3
极差 R
1(70)
1
1
2(90)
2
2
3(110)
3
3
4.68
4.40
4.41
0.286
1(1%)
2(2%)
3(3%)
1
2
3
1
2
3
4.33
4.66
4.50
0.336
1(4.0)
2(4.5)
3(5.0)
2
3
1
3
1
2
4.92
4.30
4.27
0.650
1(50)
2(60)
3(70)
3
1
2
2
3
1
3.95
5.20
4.34
1.25
4.39
5.35
4.31
3.87
3.79
5.53
4.72
4.85
3.67
图 3 不同浓度多糖对 DPPH自由基清除能力（A）、抗脂质过氧化能力（B）和 O2-清除能力（C）的测定
Fig.3 Scavenging effects of different polysaccharide concentrations on DPPH free radicals(A),
anti-lipid peroxidation(B) and O2-radicals(C)
3结论
影响铜藻水溶性粗多糖提取率的主要 3个因素（提取温度、提取时间、料液比）中，在本试验条件下，提
取温度和时间为主要因素，其次是料液比。铜藻水溶性粗多糖提取的最优工艺为：提取时间 3 h，温度 60 ℃，
料液比 1:20。
对于马尾藻科多糖的提取，主要集中在羊栖菜、海带等，铜藻的多糖提取工艺及抗氧化活性在国际上
尚未见公开报道，本研究通过比较三种提取方法及联合应用后对多糖提取的影响确定最佳提取工艺为时
间 70 min，温度 60 ℃，pH为 4.0，加酶量 2%（纤维素酶∶中性蛋白酶=2:1，w/w），提取率为 5.61%，单一法最
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优工艺为酶解法，具有提取工艺简单、能耗低和提取率高等优点。
本文就海藻多糖 DPPH自由基清除能力、抗脂质过氧化能力、O2-清除能力和还原力进行测定，表明该
多糖在离体条件下具有自由基清除能力、抗脂质过氧化能力和 O2-清除能力，但其能力较抗坏血酸比较相
差较多。
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