全 文 ：铜藻多糖水提法工艺优化及其抗氧化活性研究
顾丽霞，刘丽佳，何淑婷，薛 露，姜 露，杨 玲，闻正顺* (浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山 316000)
摘要 ［目的］研究铜藻多糖的水提法提取工艺，并研究其抗氧化活性。［方法］采用水提法提取铜藻多糖，研究提取时间、提取温度和
料液比等因素对多糖提取率的影响，以多糖得率为指标，通过正交试验优化最佳提取工艺;并对铜藻多糖的 1，1-二苯基苦基苯肼(DP-
PH)自由基、超氧阴离子自由基(O －2 )的清除能力及抗脂质过氧化能力进行研究。［结果］该多糖水提法提取的最优条件为料液比 1∶ 20
g /ml、时间 3 h、温度 60 ℃，在此条件下，铜藻多糖的提取率为 4． 9%;铜藻多糖抗氧化活性随着浓度增加而增强，其超氧阴离子(O －2 )和
DPPH自由基清除能力、抗脂质过氧化能力分别为 48． 1%、38． 8%、34． 2%。［结论］该研究优化了铜藻多糖的提取工艺，提取的活性多糖
具有一定抗氧化活性，试验优化的工艺稳定可行，为铜藻多糖的后续研究和开发提供依据。
关键词 铜藻;多糖;水提;抗氧化活性;工艺优化
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2014)29 －10139 －03
Study on Water Extraction Technology and Antioxidative Activity of Polysaccharides from Sargassum herneri
GU Li-xia，LIU Li-jia，HE Shu-ting，WEN Zheng-shun* et al (College of Food，Medicine and Pharmacy，Zhejiang Ocean University，
Zhoushan，Zhejiang 316000)
Abstract ［Objective］Extraction technology of polysaccharide from Sargassum herneri (Turn)C． Ag． and its antioxidative activity were stud-
ied． ［Method］The extraction technology was optimized by orthogonal experiment with the content of polysaccharide which measured by phe-
nol-sulfuric acid method and with the ratio of raw materials to solvent，extracting temperature，extracting time as factors，moreover，1，1-di-
phenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)free radical，scavenging capacity of superoxide anion radical，anti-lipid peroxidation and reducing power of
Sargassum herneri polysaccharide were determined． ［Ｒesult］The optimal extraction technology of polysaccharide was as follows:the extrac-
tion time was 3 h，the extraction temperature was 60 ℃，the ratio of raw material to solvent was 1∶ 20 g /ml． The antioxidative activity Sargas-
sum herneri polysaccharide was increased in a concentration-dependent manner，which the scavenging capacity of the DPPH free radical was
38． 8%，scavenging capacity of superoxide anion radical was 34． 2% and the capacity of anti-lipid peroxidation was 48． 1%，respectively．
［Conclusion］The optimal extraction parameters was gained in this study and antioxidative activity of Sargassum herneri polysaccharide were in-
vestigated，which provided support for the development of Sargassum herneri polysaccharide．
Key words Sargassum herneri;Polysaccharide;Water extraction;Antioxidative activity;Technique optimization
基金项目 舟山市科技计划项目(2012C33004);2012年浙江海洋学院
大学生科技创新项目“铜藻糖胶制备技术研究”;浙江海洋
学院 2012 年科研计划项目(面上项目)(X12M05);浙江海
洋学院科研启动经费资助项目“海藻多糖硫酸酯的抗氧化
活性研究”。
作者简介 顾丽霞(1992 － )，女，浙江杭州人，本科生，专业:药学。
* 通讯作者，讲师，博士，从事海洋天然产物与健康研究工作。
收稿日期 2014-08-31
铜藻 Sargassum herneri(Turn)C． Ag．俗称“丁香屋”，已用
于藻胶制造工业，在农业、生物医药、食品、饲料工业等行业
也被广泛应用，具有较高的商业价值。民间存有铜藻全藻药
用的习惯，其有效成分特别是有生物活性的特效成分研究得
仍较少，仅见报道含褐藻酸、甘露醇、多糖等成分［1 －2］，因而
该藻并未得到有效的开发利用。近些年来，我国对海洋来源
多糖的研究日益广泛，已有研究表明海洋多糖具有抗衰老、
抗辐射、抗病毒、抗心血管疾病及抗氧化活性等功能［3 －7］，其
中，海藻多糖的开发已逐渐全球化，成为重要的一个领域。
在十几年前，从褐藻中分离出有较强药理学和生物化学活性
的硫酸基多糖吸引了许多学者们的关注，阐明了褐藻硫酸多
糖具有抗凝血、抗感染、抗炎症和抗肿瘤等活性［8 －10］。为了
提高效率、节约成本，笔者采用热水提取法提取铜藻中的多糖，
采用正交试验法优化铜藻多糖的提取工艺，并对其体外抗氧化
活性进行研究，为后续铜藻多糖的开发和利用提供依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试原料。铜藻(舟山嵊山岛采得)由浙江海洋学院
药学系鉴定。
1． 1． 2 主要仪器。UV-1100紫外分光光度计，上海美谱达仪
器有限公司;FW80 万能粉粹机，天津市泰斯特仪器有限公
司;HWS12 电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司;
SB4200DT 超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司;
FEB85-2恒温磁力搅拌器，常州国华电器有限公司。
1． 1． 3 试剂。葡萄糖、浓硫酸、苯酚、无水乙醇、氢氧化钠、
盐酸等，均为分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 多糖的提取。取铜藻粉末 20 g，过 20目筛，经热水提
取法提取后，离心，并取溶液，加入H2O2(3%)，4 ℃处理 2 h，
浓缩后加入乙醇，使乙醇含量为 70%，沉淀过夜，抽滤，滤渣
加水溶解，采用 Sevage法脱蛋白，将溶液在旋转蒸发仪上旋
干，加少量水溶解，加入乙醇进行二次醇沉，同样，沉淀依次
用无水乙醇、丙酮、乙醚淋洗两次，挥干溶媒，加少量蒸馏水
溶解，冷冻干燥的固体即为铜藻多糖。
1． 2． 2 标准曲线的绘制。采用苯酚 －硫酸法［11］测定多糖含
量。精密称取 0． 050 g葡萄糖(分析纯)，加水定容至 100 ml，
得到浓度为 500 μg /ml 的葡萄糖标准溶液，精确吸取 0、
0． 10、0． 20、0． 30、0． 40、0． 50 ml，分别置于 10 ml容量瓶中，补
加超纯水至2． 0 ml，加入1． 0 ml苯酚(5%)，混合均匀后快速
加入 7． 0 ml浓硫酸(95%)，摇匀后室温放置 30 min，于 485
nm处测定其紫外吸光值(A)。以吸光值 A 为横坐标、葡萄
糖的质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线(图 1)。
1． 2． 3 多糖含量的测定。精确量取供试品溶液 1 ml，加蒸
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(29):10139 － 10141，10176 责任编辑 黄小燕 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.29.038
图 1 葡萄糖标准曲线
馏水至 2 ml后，加 1 ml 5%苯酚，摇匀后迅速加入浓硫酸 7． 0
ml，摇匀后冷却至室温，按照“1． 2． 2”中的方法测定吸光度。
以吸光度对应的葡萄糖标准品溶液浓度乘以校正系数 0． 9，
计算多糖含量。
1． 2． 4 提取工艺单因素试验。
1． 2． 4． 1 最佳温度确定。取海藻 20 g，在料液比 1∶ 20 g /ml，
提取时间为 4 h，分别以 50、60、70、80 ℃的提取温度，考察提
取温度对铜藻多糖提取率的影响。
1． 2． 4． 2 最佳料液比确定。取海藻 20 g，温度 60 ℃，水提时
间 4 h，分别以料液比为 1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20、1∶ 25 g /ml 的条件
下，考察料液比对铜藻多糖提取率的影响。
1． 2． 4． 3 最佳时间确定。取海藻 20 g，温度 60 ℃，料液比
1∶ 15 g /ml，分别以提取时间为 2、4、6、8、9 h的条件下，考察提
取时间对铜藻多糖提取率的影响。
1． 2． 5 提取工艺的正交试验。以提取温度、提取时间以及
料液比 3个因素为考察对象，每个因素 3 个水平，选用三因
素三水平正交试验(表 1)，筛选铜藻多糖的最佳提取工艺。
表 1 水提法正交试验因素与水平
水平
因素
A(提取时间∥h) B(料液比∥g /ml) C(提取温度∥℃)
1 3 1∶ 15 60
2 4 1∶ 20 70
3 5 1∶ 25 80
1． 3 水提法的铜藻多糖抗氧化活性研究
1． 3． 1 DPPH自由基清除的测定［12］。取不同浓度(0、2、4、
6、8和10mg / ml)的样品溶液1 ． 0ml加入4 ． 0ml0 ． 004%
DPPH溶液，混匀，避光放置 30 min，以无水乙醇作为对照空
白在 517 nm测定其吸光度 A，以 Vc作为阳性对照，清除率 T
(%)= ［(A0 － A1)/A0］×100%，式中，A0 为对照空白吸光度
值;A1 为待测液吸光度值。
1． 3． 2 抗脂质过氧化能力的测定［13］。用磷酸盐缓冲液
(PBS，0． 1 mol /L、pH 7． 45)配制卵黄悬液［V(PBS)∶ V(卵
黄)=25∶ 1］，取 0． 4 ml卵黄悬液，分别加入不同浓度(0、2、4、
6、8 和 10 mg /ml)的被测溶液 1． 0 ml，再加入 0． 4 ml、25
mmol /L的硫酸亚铁，用 0． 1 mol /L、pH 7． 45 的 PBS 补充至
4． 0 ml，37 ℃气浴恒温振荡器中振荡 15 min，取出后加入 1． 0
ml、20%的三氯乙酸(TCA)静置 10 min，3 500 r /min 离心 10
min，取 4． 0 ml 上清液加入 2 ml、0． 8% 的硫代巴比妥酸
(TBA)，加塞，沸水浴 15 min，冷却，以 6． 0 ml PBS为空白调
零管，在 532 nm处测定吸光度;Vc作为阳性对照组，多糖抗
氧化活性以抑制卵黄脂蛋白脂质过氧化效率表示，抑制率 I
(%)=(A0 － A)/A0 × 100%，式中，A0 为空白对照(未加多
糖)的吸光度;A为待测多糖的吸光度。
1． 3． 3 超氧阴离子自由基清除能力的测定［14］。在试管中分
别加入 pH为 8． 2、浓度 0． 05 mol /L的 Tris-HCl缓冲液 3 ml，
每个试管加入不同浓度(0、2、4、6、8和10 mg /ml)的样品0． 20
ml(对照用蒸馏水代替)，并于 25 ℃电热恒温水浴锅中保温
10 min，加入同样预温的 30 mmol /L的邻苯三酚 12 μl，混匀
后精确反应 4 min，0． 50 ml浓盐酸终止反应，在 320 nm处测
吸光度，以等体积 pH为 8． 2的 Tris-HCl缓冲液作为空白，以
Vc作为阳性对照。清除能力 T = (A对照 － A样品)/(A对照 －
A空白)× 100%，式中，A空白为 Tris-HCl 缓冲液的吸光度值;
A对照为 Tris-HCl缓冲液 +邻苯三酚溶液(未多糖)的吸光度
值;A样品为多糖的吸光度值。
2 结果与分析
2． 1 单因素试验 从图 2 可以看出，铜藻多糖提取率随温
度升高先升高再降低，在 70 ℃时提取率最高，达 0． 849 7%，
在一定范围内，温度升高有助于多糖渗出而温度超出最佳条
件后，其提取率呈下降趋势;提取率随料液比增加先升高后
降低，在 1∶ 20 时，提取率最高。提取率随提取时间的增加，
逐渐升高，4 h后提取率略下降，从图 2可知提取时间对提取
率的影响较显著。
图 2 温度(a)、料液比(b)和时间(c)对多糖提取率的影响
04101 安徽农业科学 2014 年
2． 2 正交试验 试验结果(表 2)表明，提取时间、温度以及
料液比 3种因素对铜藻多糖提取效率的影响大小依次为 C
＞ A ＞ B，即提取温度 ＞提取时间 ＞料液比。铜藻多糖最佳
提取工艺为 A1B1C2，即提取时间 3 h、提取温度 60 ℃、料液比
1∶ 20 g /ml。
2． 3 抗氧化活性测定结果 由图 3可见，在不同浓度下，铜
藻多糖对 DPPH自由基具有一定的清除能力，呈一定的浓度
依赖性，浓度为 10 mg /ml 时，其清除率达 38． 8%，低于阳性
对照组(Vc组);水提法提取的铜藻多糖具有较强的抗脂质
过氧化能力，并与浓度呈正相关，浓度为 8 mg /ml 时，多糖抗
脂质过氧化能力最高，为 48． 1%，但低于阳性对照组(Vc 组
为 75． 0%);铜藻粗多糖有超氧自由基清除能力，浓度为 10
mg /ml 时，其清除能力为 34． 2%，其超氧自由基清除能力随
浓度的增加而增强，但明显低于 Vc(清除能力为 92． 1%)。
表 2 水提法正交试验结果
实验号
提取时间
h(A)
提取温度
℃(C)
料液比
(B)
空列
多糖提取
率∥%
1 1(3) 1(60) 1(1:15) 1 4． 59
2 1 2(70) 2(1∶ 20) 2 4． 05
3 1 3(80) 3(1∶ 25) 3 4． 10
4 2(4) 1 2 3 3． 83
5 2 2 3 1 2． 91
6 2 3 1 2 3． 38
7 3(5) 1 3 2 4． 41
8 3 2 1 3 2． 56
9 3 3 2 1 4． 47
均值 1 4． 25 4． 28 3． 51 3． 99
均值 2 3． 37 3． 17 4． 12 3． 95
均值 3 3． 81 3． 98 3． 81 3． 49
极差 Ｒ 0． 878 1． 110 0． 607 0． 495
图 3 铜藻多糖的 DPPH自由基清除能力(a)、抗脂质过氧化能力(b)和超氧阴离子(O －2 )清除能力(c)测定
3 结论与讨论
海藻具有陆生植物所不具备的生态条件，造就了其具有
特殊分子结构及生理、生化特性，其所含的多糖具有特殊的
医用功能，对治疗人类的慢性疾病有显著疗效，因此开发和
利用海洋藻类代谢产物具有重大意义［15］。海藻多糖的提取
工艺及其活性研究，主要集中在羊栖菜、海带等藻类，铜藻多
糖提取工艺及其体外抗氧化能力的相关研究报道不多，该研
究分析了铜藻多糖提取条件，并对其主要影响因子(提取温
度、提取时间、料液比)进行了优化，结果表明，影响铜藻多糖
提取率的主要因素为提取温度和时间，料液比为其次，其最
优的提取工艺为:在料液比 1∶ 20 g /ml、60 ℃下提取 3 h。该
方法(水提法)既节约成本又易于操作的藻类提取有效方法，
具有提取工艺简单、能耗低、提取率高等优点，因而易于推广
到实际生产中，有望实现铜藻多糖提取的产业化。
该研究对铜藻多糖的 DPPH自由基清除能力、抗脂质过
氧化能力以及超氧阴离子(O －2 )清除能力进行评价，结果表
明，该多糖在体外具有一定的抗氧化能力，其抗氧化能力随
着浓度的增加而增强，这与刘丽佳等采用酶法提取的铜藻多
糖相比［16］，抗氧化活性有一定的增强，表明不同提取条件可
能影响了多糖的活性，但较 Vc弱，这有可能与其纯度不高有
关，需要进行深入研究。通过对铜藻多糖提取工艺的优化，
并探讨了其体外抗氧化能力，表明铜藻多糖具有一定的抗氧
化能力，该试验为铜藻资源的研究和开发利用提供依据。
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(下转第 10176页)
1410142卷 29期 顾丽霞等 铜藻多糖水提法工艺优化及其抗氧化活性研究
以蛹在土中越冬，翌年 4月中旬越冬蛹羽化(表 2)。茶尺蠖
各虫态历期，成虫期 3 ～8 d，卵期 5 ～ 11 d，幼虫期 15 ～ 34 d，
蛹期 12 ～17 d，越冬蛹期 193 ～220 d。完成一个世代需 36 ～
62 d。幼虫有 4、5和 6 龄，1、2 代有 4 和 5 龄，3 代 5 龄，4 代
有 5和 6龄。各龄历期因代别、季节变化较大(表 1)。
2． 2 生活习性
2． 2． 1 成虫。蛹大多于 20:00至次日 02:00羽化，以 20:00 ～
24:00羽化最盛;成虫具有趋光性，静止时四翅平展，喜停息在
茶园附近树木枝干及建筑物墙面上［2］。羽化后当天即可交尾，
雄成虫一生交尾多次，雌成虫一般交尾 1次，也有 2次。交尾
后第 2天晚上开始产卵，以 20:00 ～24:00最盛。
表 1 茶尺蠖各龄幼虫头宽、体长和历期
龄次
头宽∥mm
一般 平均
体长∥mm
一般 平均
历期∥d
1 0． 35 ～0． 36 0． 35 1． 80 ～1． 89 1． 85 3 ～7
2 0． 53 ～0． 62 0． 57 5． 74 ～6． 12 5． 98 2 ～7
3 0． 95 ～1． 24 1． 04 9． 06 ～9． 71 9． 24 2 ～7
4 1． 52 ～2． 03 1． 71 15． 31 ～17． 32 15． 98 3 ～7
5 2． 70 ～3． 26 3． 14 22． 56 ～27． 22 24． 49 4 ～10
6 3． 04 ～3． 44 3． 17 26． 36 ～34． 22 30． 79 5 ～9
表 2 茶尺蠖各代各虫态发生期
代别 卵 幼虫 蛹 成虫
1 4月下旬至 5月中旬 5月上旬至 6月上旬 5月下旬至 6月中旬 6月上旬至 6月下旬
2 6月上旬至 7月上旬 6月中旬至 7月下旬 7月上旬至 7月下旬 7月中旬至 8月上旬
3 7月中旬至 8月上旬 7月下旬至 8月下旬 8月中旬至 9月上旬(部分越冬) 8月下旬至 9月中旬
4(部分) 8月下旬至 9月中旬 8月下旬至 10月下旬 9月下旬至次年 4月下旬 4月中旬至 5 月上旬
2． 2． 2 卵。卵成堆产在茶树上、中部枝杈间或茶树基部裂
缝和枯枝落叶间，雌蛾每晚产卵 2 ～ 3块，每块有卵 213 ～ 706
粒，每雌成虫产卵量为 969 ～1 377粒，平均 1 133． 3粒。卵的
孵化从 05:00至 18:00，而以 06:00 和 14:00 孵化最盛，孵出
量为该卵块卵量的 80%左右，第 2天该卵块卵的孵化率仅占
1%左右。卵的孵化率为 82． 8% ～94． 8%，平均 87． 7%。
2． 2． 3 幼虫。初孵幼虫离开卵壳后迅速寻找合适的场所，
在茶树叶片上找好位置后，即停歇在叶片上，状如枯枝，受惊
后即吐丝飘移。孵化 2 d的幼虫取食叶片的上表皮和叶肉，
只留下表皮;孵化3 d的幼虫从叶片近叶缘处取食，看似褐色
的环，同时能将叶片食成孔洞或缺刻。2龄幼虫体色变浅，休
止时在叶片上呈拱桥状。1、2龄幼虫多群集茶篷上面。3 龄
幼虫即在茶枝上静止，呈拟态状，与茶枝呈 30 ～ 60°角，该龄
幼虫不善爬动，多数时间静止不动，有时将身体的上部左右
摆动，对食料要全部食尽方再移动。4 龄及以后幼虫有的可
将自身的蜕皮吃掉;幼虫在取食叶片后，立即爬向茶枝，呈拟
态状，在茶枝上休息。幼虫在白天蜕皮进入下一龄，而以中
午最盛，幼虫取食以黄昏和早晨最盛。
2． 2． 4 蛹。幼虫老熟后在白天入土化蛹，以午后最盛，预蛹
期 1． 5 ～4． 0 d，入土深度一般在 3 cm，入土部位多数在茶树
基部 30 cm范围内，越冬蛹在茶丛南面较多。
3 防治措施
3． 1 农业防治 茶尺蠖在 1 ～ 2 龄幼虫时，趋嫩芽叶为害，
及时分批采摘鲜叶，可捏死和带走一些幼虫。茶尺蠖在山东
为点片发生，如防治失时，可在幼虫期人工捉虫，或及时扒被
害茶树基部捉蛹。同时可利用冬季茶树基部培土越冬消灭
越冬蛹。发蛾盛期采取灯光诱杀或性诱杀。
3． 2 生物防治 茶尺蠖的天敌有鸟类、螳螂、蜘蛛、绒茧蜂、
悬茧蜂、寄蝇、圆孢虫疫霉、白僵菌、拟青霉真菌和茶尺蠖核
型多角体病毒等。在充分保护好自然天敌、充分发挥天敌的
自然控制作用的同时，在幼虫孵化盛末期至 2 ～ 3 龄初期喷
施茶尺蠖核型多角体病毒或苏云金杆菌。
3． 3 化学防治 茶尺蠖在山东为点片发生，可及时根据发
生情况进行挑治。可用 2． 5%鱼藤酮 EC 300 ～ 500 倍液，
0． 36%苦参碱 AS 1 000 ～ 1 500 倍液，0． 2%甲氨基阿维菌素
苯甲酸盐 EC 2 000倍液，10%溴虫腈 SC 3 000 ～ 5 000倍液，
2． 5%联苯菊酯 EC 3 000 ～4 000倍液叶面喷雾，都有较好的
防治效果。
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(上接第 10141页)
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67101 安徽农业科学 2014 年