全 文 ：第 27卷　第 5期 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报 Vol. 27　 No. 5
　 2007年 10月 Journal o f Central South Univ er sity o f Fo rest ry& Techno log y Oct. 2007　
文章编号: 1673- 923X ( 2007) 05- 0074- 05
思茅松胚性愈伤组织的诱导
吴　涛 1 ,陈少瑜 1 ,陈　芳 1 ,王寅冰 2 ,易善军 2 ,陈善娜 3
( 1.云南省林业科学院森林植物培育与开发利用重点实验室 ,云南昆明 650204;
2.西南林学院 ,云南 昆明 , 650224; 3.云南大学生命科学学院 ,云南昆明 650091)
摘　要: 　以思茅松成熟胚和不同发育时期的未成熟胚为外植体 ,在 DCR、 1 /2LM和 1 /2P6培养基上分别添加不同种类及质量浓度
组合的植物激素 ,进行胚性愈伤组织诱导试验 .结果表明:一定激素质量浓度范围内的 DCR和 1 /2LM培养基上 ,成熟胚可以诱导愈伤
组织 ,但都为非胚性愈伤组织 ;思茅松不同发育时期的未成熟胚在含 2, 4-D 1. 1 mg· L- 1、 BA 0. 45 mg· L- 1和 K T 0. 43 mg· L- 1的
1 /2P6培养基上也可以诱导产生愈伤组织 ,但只有用处于顶端分生组织原基还不能明显可见时的未成熟胚为外植体进行诱导 ,才可
以得到胚性愈伤组织 ,诱导率为 1. 8% ;思茅松未成熟球果在普文林场思茅松种子园内最佳采样时期为 7月下旬 .
关键词: 　遗传育种 ;思茅松 ;胚性愈伤组织 ;诱导 ;体胚发生
中图分类号: 　 S791. 24; Q943. 1　　　　文献标志码:　 A
Inducement Study of Embryonic Calluses fromPinus kes iya var. langbianensis
WU Tao
1
, CHEN Shao-yu
1
, CHEN Fang
1
, W ANG Yin-bing
2
, YI Shan-jun
2
, CHEN Shan-na
3
( 1. The Key Labo ratory of Fo res t Plant Cul tivation and Utili zation, Yunnan Academy of Forest ry, Kunming 650204, Yunnan, China;
2. Southw es t Fores t ry Col leg e, Kunming 650224, Yunnan , China;
3. School of Life Science, Yunnan Universi ty, Kunming 650091, Yunnan, China )
Abstract: Cal lus es w ere ind uced f rom mature zyg otic em bryos of Pinus kesiya var. lan gbianensis on DCR and 1 /2LM medium
supplem ented w ith a certain concen tration of 2, 4-D, BA, b ut th e ind uced calluses w ere non-embryonic ones. Emb ryonic cal luses w ere
initi ated f rom dif ferent d evelopmen tal period s of immature zyg otic emb ryos of th e pin e on 1 /2P6 medium append ed wi th 2, 4-D
1. 1 mg· L- 1 , B A 0. 45 mg· L- 1 and KT 0. 43 mg· L- 1 and it s initi ation rate w as 1. 8% . Th e optimal t ime for s am pling th e
immature zygot ic embryo in i ts s eed orch ard in Puw en Forest Stat ion is th e las t ten days of July.
Key words: genetic th remmatology; Pinus kesiya var. langbianensis; embryonic callus; inducem ent; emb ryog enesis
体细胞胚胎发生具有繁殖效率高 ,系数大 ,不受自然条件制约 ,可以作为林木基因工程中遗传转化的优良
受体系统等优点 ,在苗木快速繁育、种质保存、人工种子、基因工程、胚拯救、原生质体融合等方面具有重要的意
义和广阔的应用前景 [1, 2 ] .针叶树种的体细胞胚胎培养需要经过胚性愈伤组织的诱导、体细胞胚胎的增殖、成熟
和萌发等阶段 ,其中胚性愈伤组织的诱导是其关键环节 [3 ] .自 Hakman和 von. Arno ld[4 ]首次报道由欧洲云杉
Picea abies的未成熟合子胚培养中获得体细胞胚并再生植株以来 ,针叶树的体细胞胚胎发生研究已取得可喜
的进展 .据不完全统计 ,目前已从冷杉属 Abies、落叶松属 Larix、云杉属 Picea、松属Pinus、黄杉属Pseudotsuga和
北美红杉属 Sequv ia等至少 20种不同的针叶树种中培养产生了体细胞胚 .其中欧洲云杉、火炬松 Pinus taeda、
辐射松 Pinus radiata及北美黄杉 Pseudotsuga menziesii等树种的体细胞胚胎诱导和植株再生已用于生产 ,稳
定的基因转移及表达调控在这些树种上也获成功 .但作为针叶树主要造林和用材树种中最重要也是种类最多
的松属 ,其体细胞胚胎发生仍有不少困难 [5～ 9 ] .在我国 ,黄健秋等 [10 ]用马尾松的成熟合子胚成功诱导体细胞胚
发生 ,并形成完整小植株 .唐巍 [ 11]建立了火炬松体细胞胚胎发生体系 .齐力旺 [12 ]建立了落叶松高效体细胞胚胎
收稿日期: 2007-01-08
基金项目: 国家林业局 948项目“松属树种抗虫基因遗传转化技术引进” ( 2003- 4- 44) .
作者简介: 吴　涛 ( 1979- ) ,男 ,云南宣威人 .研究实习员 ,硕士 ,主要从事林木遗传育种和生理生化研究 .
DOI : 10. 14067 /j . cnki . 1673 -923x . 2007. 05. 020
发生系统 .贾彩风和李悦 [13 ]对华山松胚性愈伤组织的诱导进行了研究 .李茜等 [ 14]用未成熟合子胚诱导得到白
皮松胚性愈伤组织 .
思茅松 Pinus kesiya var. langbianensis是云南省主要用材及采脂树种 ,其分布面积占云南省林地面积的
11% ,拥有 1亿 m3的蓄积量 ,在云南省林业生产和生态环境建设中起着极其重要的作用 [ 15] .本文中以思茅松成
熟胚和未成熟胚为外植体 ,用 DCR、 1 /2LM和 1 /2P6培养基 ,通过调节不同激素种类及质量浓度 ,对思茅松胚
性愈伤组织的诱导进行了初步研究 ,为建立该树种体细胞胚胎发生技术提供实验资料和技术支持 .
1　材料与方法
1. 1　试验材料
思茅松成熟种子 2004年购于云南省种苗站 (镇沅种源 ) ;未成熟种子于 2006年 4月下旬至 8月下旬在云南
省西双版纳州普文林场思茅松种子园采集 ,每隔 7～ 10 d采集 1次 .纸袋包装 ,保存于 4℃冰箱中 ,尽可能在短时
间内接种 .
表 1　思茅松胚性愈伤组织诱导培养基及编号
　　Table 1　 The culture media and number for callus induction
of P inus kesiya var. langbianensis
处理编号 外植体 培养基 激素用量 / ( mg· L- 1 )
BA 2, 4-D K T NAA
1
2
3
4
5
6
7
8
成熟胚
DCR
0 0 0 0
1. 0 2. 0 0 0
2. 0 4. 0 0 0
4. 0 8. 0 0 0
1 /2LM
0 0 0 0
1. 0 2. 0 0 0
2. 0 4. 0 0 0
4. 0 8. 0 0 0
9
10
11
12
13
未成熟胚 1 /2P6
0 0 0 0
0. 45 1. 1 0. 43 0
0. 45 0 0. 43 2. 0
0. 63 1. 1 0. 61 0
0. 63 0 0. 61 2. 0
1. 2　试验设计
思茅松胚性愈伤组织诱导试验选用成熟胚和
不同发育时期的未成熟胚为外植体 .参照黄健
秋 [16 ]、贾彩风等 [13 ]的研究 ,思茅松成熟胚的胚性
愈伤组织诱导培养基选用 DCR和 1 /2LM ,在 2005
～ 2006年以成熟胚为外植体 ,对 2, 4-D( 1～ 10 mg
· L- 1 )、 K T( 1～ 5 mg· L- 1 )和 BA( 1～ 5 mg·
L
- 1
)进行了不同质量浓度组合的诱导研究后 ,认
为诱导效果较佳的是 2, 4-D和 BA的质量浓度比
为 2∶ 1,本研究以 2, 4-D和 BA质量浓度比例为 2
∶ 1作为重点 ,每升培养基中附加肌醇 1 000 mg、
水解络蛋白 500 mg、蔗糖 30 g和琼脂 7 g , pH5. 8,
121℃灭菌 ,冷却至约 55℃时加入谷氨酰胺 450
mg.参照 Pul lman[ 17]成功诱导火炬松胚性愈伤组
织的研究结果 ,思茅松未成熟胚的胚性愈伤组织
诱导试验采用 1 /2P6培养基 ,每升培养基中附加 AgNO3 3. 4 mg、肌醇 20 g、麦芽糖 15 g、水解络蛋白 500 mg、谷
氨酸 2 mg、活性炭 50 mg, pH5. 8,其余同上 .激素使用了 2, 4-D、 BA、 KT和 NAA不同质量浓度组合 ,具体处理
见表 1.每个处理接种成熟或未成熟胚 50粒 ,重复 3次 .
1. 3　材料处理
成熟种子使用前用自来水浸泡 48 h,用手搓洗后用流动自来水冲洗 10～ 30 min.超净工作台上 ,用 0. 1%升
汞消毒 15～ 20 min,之后用灭菌水涮洗 4～ 5次 ,每次 3min,备用 .未成熟种子先从球果中取出 ,之后拿到超净工
作台上 ,用 70%乙醇浸泡 3 min,无菌水冲洗 3次 ,再用 10%次氯酸钠 ( NaHCl)表面灭菌 10～ 15 min,无菌水冲洗
3～ 5次 ,备用 .
1. 4　培养及统计
( 25± 3)℃条件下黑暗培养 .观察 4～ 6周后 ,统计愈伤组织发生情况 .
2　结果与分析
2. 1　思茅松成熟胚诱导愈伤组织的结果
根据 Gupta和 Pullman的研究结果 [ 18] ,松属树种诱导形成的胚性愈伤组织形态特征为:白色 ,半透明丝状 ,
黏度高 ,湿度大且相对疏松 .非胚性愈伤组织的形态特征为: 白色至淡黄色 ,不透明 ,结构紧密或疏松 ,表面干
燥 ,最主要的特点是继代培养时只发生体积上的增大而无进一步分化的能力 .本研究主要通过以上形态特征的
区别对所获得的愈伤组织进行判断 .
选用成熟胚作外植体 ,在培养过程中 ,发现少数胚几乎没有变化或只是体积上稍微增大一点 ,之后不再发
75第 5期 吴　涛等:思茅松胚性愈伤组织的诱导
表 2　思茅松成熟胚愈伤组织诱导的结果
　 Table 2　 The results of callus induction from mature
embryos of P inus kesiya var. langbianensis
处理 接种胚数 /个 具有活力的胚数 /个 愈伤数量 /块 愈伤诱导率 /%
1 150 112 0 0
2 150 99 90 90. 9
3 150 105 87 82. 9
4 150 100 91 91. 0
5 150 106 0 0
6 150 98 89 90. 8
7 150 107 96 89. 7
8 150 102 100 98. 0
生任何变化 ,研究中把此类外植体归为不具活力的胚 (外植
体 ) ,而大部分胚皆愈伤化 ,诱导结果见表 2.从表 2可以看
出 ,排除污染和不具活力的胚 ,思茅松成熟胚在无激素的
DCR与 1 /2LM培养基上都直接萌发成苗 (见图 1) ,但在附
加了激素的所有处理上均可以诱导出大量的愈伤组织 ,诱
导率最高可达 98% , DCR培养基与 1 /2LM培养基的平均诱
导率分别为 88. 3%和 92. 8% ,但继代培养 1～ 3个月后 ,绝
大多数愈伤组织都逐渐褐化 ,死亡 .此外 ,从愈伤组织的形
态特征上看 ,其颜色从乳白色到浅黄色 ,半透明 ,结构紧密
至疏松 ,表面干燥 (见图 1) ,继代培养后只发生体积上的增
大 ,无分化能力 ,继代培养多次后都逐渐褐化 ,死亡 .
图 1　思茅松成熟胚在 DCR培养基 (左图 )和 1 /2LM培养基 (右图 )上的诱导结果 (黑色线条表示 3 mm)
　　　　　 Fig. 1　 The results of callus induction from mature embryos of P inus kesiya var. langbianensis
on DCR medium ( lef t) and 1 /2LM medium ( right ) ( black bar= 3 mm)
2. 2　思茅松未成熟胚诱导胚性愈伤的结果
以不同发育阶段的未成熟胚作外植体 , 1 /2P6配方为基本培养基 ,选用 2, 4-D、 BA、 K T和 NAA不同激素种
类和质量浓度配比 ,均可以得到数量不等的愈伤组织 ,采种时间及诱导结果见表 3.
表 3　思茅松未成熟胚诱导胚性愈伤的结果
Table 3　 The results of callus induction from immature embryos in dif ferent stages of P inus kesiya var. langbianensis
处理 采集日期 接种的外植体 /个 具有活力的外植体 /个 愈伤数量 /块 愈伤诱导率 /% 胚性愈伤数量 /块 备注
9
07- 22 90 60 0 0 0
08- 01 90 64 0 0 0
接种的胚在培养基上直接萌发成苗
10
04- 27 150 0 0 0 0
05- 20 150 0 0 0 0
05- 27 150 0 0 0 0
06- 03 150 50 45 90. 0 0
06- 10 150 41 40 97. 6 0
06- 16 150 91 86 94. 5 0
06- 23 150 32 30 93. 8 0
06- 30 150 49 45 91. 8 0
07- 07 150 67 67 100 0
07- 15 150 77 77 100 0
接种的实际是包括胚的完整胚乳 . 4月 27日采集的 ,完全无变化 ; 5月 20日、 27日采集的 ,只是整体膨大 ,然后褐化死亡 ; 6月 3日至 7月 15日采集的 ,极少数珠孔处有细胞团喷出 (推测可能是胚在培养基上后熟 ,然后长出胚根 ) ,绝大多数整体膨大 ,表面愈伤化 ,继代后逐渐褐化死亡 .
07- 22 150 84 84 100 2
08- 01 150 80 80 100 1
只接种胚 .诱导的愈伤略有水浸状 ,极少数半透明 ,丝状 .
08- 10 150 121 116 95. 9 0
08- 20 150 117 110 94. 0 0
08- 30 150 125 125 100 0
只接种胚 .诱导的愈伤白色 ,结构紧密 ,表面干燥 .继代后只发生体积上的增大 .
76 中　南　林　业　科　技　大　学　学　报 第 27卷
续表 3
The cont inuation of table 3
处理 采集日期 接种的外植体 /个 具有活力的外植体 /个 愈伤数量 /块 愈伤诱导率 /% 胚性愈伤数量 /块 备注
11
07- 22 100 56 56 100 0
08- 01 90 51 51 100 0
12
07- 22 100 62 60 96. 8 0
08- 01 90 64 64 100 0
13
07- 22 100 71 70 98. 6 0
08- 01 90 57 57 100 0
只接种胚 .诱导的愈伤多呈浅黄色 ,非透明紧密状 ,继代培养后逐渐褐化 ;少部分为白色 ,非透明松散颗粒状 ,继代培养后只发生体积上的增大 .
图 2　思茅松未成熟胚诱导形成的胚性愈伤 (白色线条表示 2 mm)
　 Fig. 2　 The embryogenic calluses induced from immature embryos
of Pinus kesiya var. langbianensis (white bar= 2 mm)
采种前期 ( 4月 27日至 7月 15日 ) ,由于胚还
未发育 (或处于发育前期 ,胚过于幼嫩 ) ,接种操作
中 ,不能把胚取出 ,只能将剥去种壳和种皮的整个
胚乳作为外植体进行接种 . 7月 22日以后采集的
种子 ,接种时取出其未成熟的胚作为外植体 .从表
3可以看出 ,只有处于一定发育时期的胚才可以
产生愈伤组织 ,过于幼嫩的胚不易愈伤化 ,从 4月
27日～ 5月 27日采集的未成熟种子在处理 10中
无一愈伤化 .合子胚发育时期越接近成熟阶段 ,越
容易诱导愈伤组织 ,但全部为非胚性愈伤 , 6月 3
日～ 8月 1日采集的种子 ,其未成熟胚愈伤诱导率
逐渐增高 ,最高可达 100% ,但只有处于适宜时期
(胚发育 2～ 4期 [ 19] , 7月 22日和 8月 1日 )的思茅
松未成熟胚接种在处理 10上获得的愈伤组织与
Pul lman描述的胚性愈伤组织相似 (见图 2) ,认为
成功诱导得到胚性愈伤组织 ,诱导率为 1. 8%
( 3 /164) .因接种数量有限 ,胚性愈伤组织只获得 3
块 ,目前正在对其进行增殖培养 .
贾彩风和李悦 [ 13 ]将华山松各发育时期的幼
胚接种到 1 /2LM培养基中 ,培养 4周后观察发
现 ,经华山松的幼胚诱导形成的愈伤组织有 2种
类型 .一种为非胚性愈伤组织 ,颜色浅黄或黄色 ,
透明或半透明 ,结构疏松 ,表面湿润而粗糙或显结晶状 .在低倍光学显微镜下观察 ,细胞较大 ,近圆形 .这种愈伤
组织继代培养后只发生体积上的扩增 ,没有体细胞胚胎的分化 .另一种颜色浅白或白色 ,半透明 ,粘质状且结构
较疏松 ,表面常呈透明丝状 .在低倍光学显微镜下观察 ,细胞较小 ,近圆形 ,具较大的细胞核 ,胞质浓厚 ,为胚性
愈伤组织 ,具有分化能力 .本研究得到的胚性愈伤组织与后者类似 ,为半透明浅白色晶莹愈伤 ,丝状结构 ,从而
进一步确定了所获得的是胚性愈伤组织 .
　 a:处于合子胚发育的第 2～ 4时期 ,适宜进行思茅松体细胞胚胎发生研究的未成熟胚 ; b:处于合子胚发育的第 5时期的思茅松胚 ,明显可见
顶端分生组织原基 ; c.处于合子胚发育的第 9时期的思茅松胚 ,子叶弯曲、紧密相连且明显可见 ; d:思茅松成熟合子胚 . (白色线条表示 1mm)
图 3　思茅松合子胚不同发育时期的形态
Fig. 3　 The morph of dif f erent developmental stages of zygotic embryos of Pinus kesiya var. langbianensis
77第 5期 吴　涛等:思茅松胚性愈伤组织的诱导
　　本研究发现 ,用思茅松未成熟胚作外植体 ,得到了胚性愈伤组织 ,说明这是思茅松体细胞胚胎发生一个可
能的途径 .在用未成熟胚作外植体时 ,所接种的胚的发育时期是关键因素 ,适宜进行诱导的胚的采种时间在云
南省西双版纳州普文林场思茅松种子园为 7月下旬 . Pullman对火炬松合子胚的发育阶段进行了研究 ,将其划
分为 9个时期 [19 ] ,并认为只有处于 2～ 4期的未成熟合子胚才是适宜进行体细胞胚胎诱导的最佳外植体 [20 ] .本
研究结果与此观点相符 ,认为未成熟胚顶端分生组织原基还不能明显可见 ,即处于合子胚发育第 2～ 4期的未
成熟胚 (见图 3)才适宜用作胚性愈伤诱导外植体 .
3　讨　论
目前对于针叶树种进行体细胞胚胎发生的研究 ,几乎均以合子胚为外植体 ,云杉属 Picea树种用成熟胚成
功诱导出胚性愈伤组织 ,但松属 Pinus植物中只有火炬松、马尾松、糖松和云南松等少数树种用成熟胚诱导得
到胚性愈伤组织 ,并且诱导率很低 [3, 4 ] . Pullman等通过深入研究火炬松合子胚不同发育时期的渗透压及 pH值
等 ,对培养基成分及添加物进行调整 ,用处于适宜发育时期的未成熟胚为外植体 ,成功诱导出胚性愈伤 ,使胚性
愈伤组织平均诱导率从的 16%提高到 38. 5% [2 1, 22] .
植物体细胞胚胎发生过程比较复杂 ,需要经过胚性愈伤组织诱导、愈伤组织的扩繁、体胚的发育和成熟、体胚
的萌发 4个基本过程 ,松属树种也如此 ,但由于树种特性 ,其胚胎发生较其它树种更为困难 .在此过程中 ,胚性愈伤
组织的成功诱导是研究体细胞胚胎发生的根本基础 ,其影响因素包括:外植体的基因型、外植体的发育阶段和生
理状态、培养基与激素的组合、添加物的成分和质量浓度等 .本研究以思茅松成熟胚为外植体 ,选用 DCR、 1 /2LM
两种基本培养基 ,未能获得胚性愈伤 ;以思茅松处于不同发育时期的未成熟胚为外植体 ,在1 /2P6培养基上添加 2,
4-D 1. 1 mg· L- 1、 BA 0. 45 mg· L- 1和 KT 0. 43 mg· L- 1 ,成功获得胚性愈伤组织 .用思茅松未成熟胚作外植
体时 ,所接种的胚的发育时期是关键因素 ,在胚顶端分生组织原基还不能明显可见时 ,即胚发育 2～ 4期的未成熟
胚才适宜用作胚性愈伤诱导外植体 .下一步将通过改良培养基 ,扩大基因型选择范围 ,提高思茅松胚性愈伤组织
的诱导率 .
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[本文编校:谢荣秀 ]
78 中　南　林　业　科　技　大　学　学　报 第 27卷