全 文 ：第止 }卷
1 , 9 1年
第 l 斯 青 岛 海 洋 大 学 学 报 、 0 1 2 1 . N O
JO L R \ A L ` ) F O C E A 、 〔 、 l \ L R岛 IT 丫 O F Q IN G D AO J盆 n
,
19 9 1
角叉菜 ( C几o n d r us co el al tUS H ol m ) 原生
质体分离 、 培养与再生的研究 *
张全启
( 生物系 )
摘 要 从角叉菜 ( C h 口n d洲 s co el l at us H ol rn ) 的 抱子体 和 雌 配 子 体 中 ,分离了大量
的成活原生质体 。 分离的最适条件为 : 纤维素酶 3 % , 粉红鲍鱼酶 8 % , 山梨醉 1 . 2 m ol d/ m 3 ,
ph 6
.
0
, 温度为 15 O C 。 细 胞 壁的完全解离 , 已用荧光增白剂的染色不着色和原生质体在
低渗溶液中的易碎性证实 。 培养后再生的细胞 , 经均等分裂 , 随后发育成实心球状体 ; 或
出芽后不等分裂 , 发育成丝状体和愈伤组织状细胞团 。 在 PE s培养基中 , 经 30 一 40 d 培养 ,
部分球状体和愈伤组织状细胞团分化出完整植株 , 但丝状体未能分化 。 低 浓 度 的 IA A 、
6 一 F A和 c 一 75 1对球状体和愈伤组织状细胞 团的生长和分化都有促进作用 。 由原生质体
培养获得完整的再生植株 , 这在真红藻纲 ( lF o r l d阳 p yn ce ae ) 中为首例报道 。
关键词 角叉菜 ; 原生质体 ; 分化 ; 再生
七十年代发展 起来的藻类原生质体分离与培养的研究工作 , 远落后于高等植物 。 初
期的工作主要以淡水单细胞和丝状绿藻为材料 〔1 一 3〕 。 近几年来 , 由于工具酶的研究和
生产促进 了大型海藻原生质体分离工作 的开展 。 目前 , 已有九个属 , 共十多个种的大型
海藻的原生质体被分离 , 部分种类已经再生 出完整植株 。 但能再生植株者 , 都是分化程
度较低的种类 , 如绿藻和红藻 中的紫菜属 ( oP rP h y ar ) 的种类 。 而分化程度较高的种类 ,
都没有再生 。 海带 ( L山 ;l 儿 a r 必 7口加儿 ica ) 的 原 生 质 体 不 能 够 成 活 〔4一 ; 巨 藻
〔刀ac’ or cys lt’s 仍二 ife ar ) 和马尾藻 ( aS 烤as su 翔 川 ut ic u州 ) 的原生质体亦未 能 成 活 吮 :
两种江篱 ( G ar ` i l’a ir a le 阴 a n e lfo r m l’s , G . lt’ k做 h l’a e) 的原生质体 , 能进行 细 胞 分 裂 ,
并形成 了 16 至 32 个细胞的细胞团 , 但未 能再生 出植株呢 ; 裙带菜 ( U n da 瓜 两n 、 at ilf da )
的原生质体 , 能长出幼体 , 但也未能长出完整植株比 。
角叉菜属 ( C h口n d lr 巧 ) 属 于真红藻纲 ( F ot ir de oP 勿“ a e) , 是一 种重要 的经 济海
藻 。 它结构复杂 · 分化程度高 。 目前 . 只有hc o n , L C 一 M . 和 aT y olr ,人 R . 侣曾用组织培养获得
过 C . c r is 娜 is 的再生植株 , 其原生质体的分 离未见报道 。 本实验通 过 对 角 叉 菜 ( C
· 此文 系研究生毕业论 文 , 由方宗熙教授 、 戴继勋副教授指导 。
本文 于 川 8下年 ! 月 9 日收到 。 于 19 89 年 9 月 13 日收到修改稿
1 期 角叉菜 ( Ch o ” 口犷哪 口 c l e如 t us H oi r n) 原生质体分离 , 培养与再生的研究
o ce al tus H
o
lrn ) 的原生质体 的分离培养得到了再生植株 , 并对原生质体再生 与 分 化 的
过程进行 了观察和讨论 , 通过对原生质体的分离培养 , 证实其细胞发育的全能性 ; 观察
其再生和分化过程中的一些生物学特征 。 同时 , 通过无性克隆化 , 为角 叉菜的遗传 、 生
化和生理学研究 , 提供遗传上稳定一致的实验材料 :
1 材料与方法
1
.
1 材料的采集和预处理
实验所用材料 为角叉菜 ( C几。 ,心。 “ 叱 ie la l璐 H ol m ) 的抱子体和雌配子体 , 采 于青
岛沿岸 。 实验时将健康的成熟藻体在消毒海水中反复擦洗 , 以除去表面的污物及杂藻 。
选取远离藻体 基部的幼嫩分枝 , 用刀片切成 2 x Z m m Z的小块 , 置于高渗 海 水 ( 消 毒
海水 + 15 9 N a C I / L + z o m m o l / d m “ e : e l: )中搅动 一。一 15 m i n ,然后于 1 . o m 。 J / d m 3的葡萄 糖 榕
液 中 搅动 s m ln , 洗 去表面海水 , 即可用于原生质体制备 。
1
.
2 酶制剂及酶液制备
实验用纤维素酶 又 o on z旅 、 R 一 10 . 日本 ) ; 果胶酶和粉红鲍鱼酶 ( is g o a 公 司 , 美
国 ) ; 海螺酶 I 号 ( 青岛海洋大学产 ) 及鲍鱼酶 ( 黄海水产研究所产夕 。 根据实验需要
将不同酶溶于蒸馏水中 ,分别加入山梨醇 、 甘露醇 、葡萄糖或氯化钠作渗透剂 , 配成所需浓
度 。溶解后离心 ( 4 0 0 O r / 。 : 。 ) 除去杂质 ,用 0 . l m 。 z / d m ”的 N a 0 H和 H C I调 节p H值至 6 . 0后备 用 。
1
.
3 原生质体制备
将预处理后的藻块 0 . 5 9 置于 s ml 酶 液 中 , 在 15o C 下保温 2 一 3 h , 不断地轻
轻摇动并取样检查酶解情况 。 酶解结束后 , 向酶液中加入 5 ml 高渗海水 , 用 S P 5 8号筛绢
过滤 , 滤液经 15。。 : / m l 。 离心 3 m in ,弃 去上清液 ,然后用 2 . o m ol d/ m “葡萄糖溶液进行漂 浮离
心 ( 30 。。 r / m 山、纯化小自吸 出浮于离心管上层的原生质体 ,用高渗海水洗三次 , 每次用 150 。
r
/ m i
n 离心收集原生质体 ,最后将收集的原生质体制成 10 4一 l 。 “细胞 /mJ 的悬浮液 , 用于培
养与检查 。
1
.
4 原生质体的鉴定
将 V B L荧光增 白剂 ( 上海产 ) 配成 0 . 1% 的溶液 , 其中含 N ac oj . 8 m ol d/ m 几用。 . 4产 的
微孔掳膜抽滤后备用 。 检查时 , 滴两滴上述溶液于待检样品上 ,置于荧光显微镜下观察 ,
以是否发出荧光作为细胞壁存在与否的指标 。 或用蒸馏水处理待检样品 , 在显微镜下观
察细胞能否涨破 , 若能涨破 , 且破碎后无细胞壁残余存在 , 则为原生质体 。
新分离的原生质体 , 用 。 . 1 % 的粉藏花红染色 , 根据粉藏花红染色时 ,死细胞能够着色 .
活细胞不能着色的特性 ,测定原生质体的成活率 。 培养过程中 , 细胞的死亡 以其色素的消
退 和细胞的解体为标准 。
1
.
5 培养方法与培养条件
用高渗海水制成的原生质体悬浮液 , 可直接加入盛有高渗海水的培养皿中 , 或先滴
于 培 养 皿 中 的 载 片 上 , 静 置 2 一 4 h , 原生质体即可附着 。 然 后 向培 养
青 岛 海 洋 大 学 学 报 9 9 1 年
皿 中加入一定量的消毒海水 , 培养 24 h 后换为 P E S培养基吸 , 以后每两周换一次培养基 。
原生质体的培养温度 为 13 一 1o8 C , 光照时间为 14 L : 10 D , 光照强度为 1 5 0 ~ 20 0 xL
2 结果
2
.
1 影响原生质体产最和成活率的因素
2
.
1
.
1 材料的预处理方法
新鲜健康的藻体固然对提高原生质体的成活率是必要的 , 但材料的预处理方法 , 也
对原生质体产量和成活率有很大影响 。 在以山梨醇为渗透剂 、 以粉红鲍鱼酶为分解酶的
作用下 , 经过预处理的材料 , 其原生质体产量 为 1 x lo “个 g/ 鲜组织 , 成 活率为 83 % ,
而未经预处理的材料 , 其原生质体的产量 为 8 , 6 x l沪个 / g 鲜组织 , 成活率仅为 63 % 。
2
.
1
.
2 不同酶对角叉菜细胞壁的离解作用
粉红鲍鱼酶 、 鲍鱼酶和海螺酶 I 号 , 对 角叉菜细胞壁都具有一定分解作 用 , 由预备
实验得知 , 它们各 自的最佳作用浓度分 别为 8 % 、 3 % 、 3 % , 但是 , 在其它酶解条件
相同时 , 它们的作用效果有明显差异 , 如表 1所示 。 显然 , 用粉红鲍鱼酶时原生质体产
量高 , 成 活率也最高 : 在其他条件一定 时 , 2 % 一 4 % 的纤维素酶可使酶解产量和原生
质体 产率提高 10 % 。 果胶酶对角叉菜细胞 壁的离解作用很小 。
表 1
T
a
b
不同酶对角叉菜细胞壁的离解作用
1 E f f e c “ o f D l f f e r e n t E n z y m e s
酶种类 最 任冬浓度 ` % ) 产 星 成活率 % ) 其他酶解条件
七 n z v m 仁 凡 O r t 一m u “ 1 ) ’ x c l d S u r y 一、 , 1 R a t` O t h c r
C o n c e n t r a t一。 户 (二o n d lt 一o n ,
粉 红鲍 鱼酶 8 1 x l ( 6 8 3 纤维素酶
P u r r l c A卜a I0 n c E n Z丫 m c C c l l u l二星
鲍鱼酶 3 4 义 1 ( ;、 了异 u l 梨醉灵. 2 0 0一z刁 m ,
A b 2 1了〕 n e E n z、
,
rn c S o r b 一t o l
海螺酶 1 号 3 孟. Z X j ( 5 6习 P H 6 . 0 : 15 O e :
S e d s n J l l L n z v m e 入仁 - 2 . s h
. 表中产量为原生质体数 / g 鲜组织
、 尸 J e l d一 p r o r o P Ja 、 : Q u 扭 n t , : v p o r G r a m () f M 、 t e r , a l
2
.
1
.
3 不 同渗透剂的影响
1期 角 叉菜 ( ch 口月 d朋 口c e撇 tus H ol m ) 原生质体分离 , 培养与再生的研究
实验采用 了山梨醇 、 甘露醇 、葡萄糖和抓化钠为渗透剂 , 通过预备实验 , 找出其各自的
最适浓度分别为 : 山梨醇和甘露醇为 1 . Z m ol d/ m 3 ; 葡萄糖 1 . 5 m of d/ m 3 ; 氯化钠为 0 . 8
m ol d/ 护 。 对它们在各自最适浓度下的作用效果进行了比较 。 结果表明 (表 2 ) 以山梨醉
作渗透剂时最理想 , 其原生质体产量高 , 成 活率也高 , 甘露醇次之 。 以氯化钠作渗透剂
时 , 虽然原生质体成 活率高 , 但其产量太低 , 所以总体效果不理想 。
表 2 ’ 不 同渗透剂对酶解的影响
T a b 2 E f f e e st o f D 一f f e r e n r O s m u r l c a
渗透剂 最桂浓度 。 。 l / d m于 产量 成活率 《 % ) 其他醉解条件
O
s m o r一c a o p t l m u m Y I亡 ld S u r y 、 v 孟 l o r h e r D 一g e s r一o n
C o n e e n t r 日 t , o n R Z te C o n d r t 一o n s
山梨醉 1 . 2 1 X I ( J6 8 3 粉红鲍鱼酶 8 % ;
S o r b一r o J P u r pl e A 卜a l o n c
E n w m
e
甘露醇 1 . 2 6 X 10 5 7 2 纤维素醉 3 %
功 a n n 一t o { C e l l u l孟义
P日 6 0 , 1 S O C
葡萄糖 1 . 5 9 X 10 4 5 6 2 . s h
G l u c o 父
氯化钠 0 . 8 1 . 2 X 10 4 8 5
S o d l u m C h l o r l d e
. 产量为原生质体数 /` g 鲜组织
Y l e ld 一 P r o : 。 PI : s : Q u , n : i r、 Pe r G r: m o f M a t o r , : J
2
.
1
.
4 温度的影响
由图 1所示的原生质体产量及成活率与酶解温度的关系可以看出 , 在温度低于 20 “ c
时 , 原生质体的产量随温度的升高而迅速增加 . 成活率则无明显差异 。 当温度高于 ZOo c
时 , 原生质体产量 变化不大 . 而其成活率却随温度的 上升而大幅度下降 。 可见 , 酶解温
度过低会影响原生质体产量 , 过高则降低其成活率 ,因此 , 酶解温度一般控制在 巧一 20 O c
较合适 。
2
.
1
.
5 酶解时间的影响
从图 2 可以看 出 , 酶解开始 o . hs 内 , 原生质体产量很低 , 而且变化不大 , 经 1 -
3 h , 原生质体产量直 线 上 升 , 3 h 后 的增加又趋缓慢 。 在酶解初始 , 原生质体成
活率呈上升趋势 , 经 l h 后开始下降 , 当酶解时 间超过 2 . h5 后 , 成活率急剧降低 。 因
此 , 酶解时间一般控制在 2 一 3 h 较理想 , 此时 , 其原生质体产量和成活率都较高 。
青 岛 海 洋 大 学 学 报 1 9 9 1年
产量
t一一 产量一 .一成活率
成活率
(% )
90
10 6
087 6 54
10 5
10 4
10 3
. 酶解条件为 :粉红
Iso l
ar一o n Co n d l r io n s :
鲍鱼酶 8 % ; 纤维素
p u r p l c A b al o n e E n 砂吐 ; Ce l l u lZ s
酶 3 % ; 山梨醉 1 . Z m o l / d m 3
s o r b r 旧I
PH 60
,
2
.
s h
。
5 10 1 5 20 2 5 30 3 5 温度 ( 。 e ) 图 l
F一9 1
温度对酶解反应的影响
E f f e e st o f T e m CP r : ut r e o n
玫〕 l a r一o n
产量 啥一一 产童一一 . 成活率
`06口一_ / 尸月
成活率
( % )
90
10 5
10 4
103
.
2 3 4
时间
5
( h )
. 酶解条件为 : 粉红
Iso l
a 之一o n C o n d 一r x o n s :
鲍鱼酶 8 % ; 纤维素
p u r p l e A b a l o n c E n Z y m c
,
C e l lu l a se
酶 3 % ; 山梨醉 一 Z m o l / d 二 3 ;
S o r b 一t o ]
p H 6
.
O
; 15
o
C
。
图 2 ’ 时间与酶解反应的关系
F 孟名 2 E f f e e st o f T 一m e L a s t e · , d u r一n g
加 1a r i o n
807654
2
.
1
.
6 p H值的影响
当 p H在 5 一 6 . 5之间时 , 粉红鲍鱼酶 , 鲍鱼酶和海螺酶 I 号的活性 , 均无明显差异 ,
但其原生质体成活率却有所不 同 。 就粉红鲍鱼酶而 言 , p H 为 6 一 6 . 5时 . 原生质体成 活
率为 83 % , 而 当 p H为 5 . 0时 , 其成活率只有 74 % , 本实验在酶解时都选用 p H 6 . 0 。
] 期 角 叉菜 C h 。 ” d rus c oel l atus Hl om ) 原生质体分离
.培养与再生的研究 5 7
在最适酶解条件一粉红鲍鱼酶 8 % 、 纤维 素酶 3% 、 山梨醇 l .Zm l o川耐 、 p H6 .。 、 温
度为 16 一 。 酶 解 2 .5h 情况 下,酶解产物经 2 . Om 。 l d/ m 3 葡萄糖溶液漂浮纯 化后 ,用荧光增 白
剂进行染 色检查 ,结 果表明 ,产物中能被荧光染色的只 占 5 % , 即其原生质体产率为95 % 。
2
.
2 原 生质体的培养与再生
新分离的原生质体 (图版 , 图 1 ) 在消毒海水中培养 2 h4 后 , 换为 P E赔养基培养 。
在 4 8 h 内 . 约 有 孙 “一别 % 的原生质体 , 颜色 由褐色变为绿色或黄色 , 最后色素消失 ,
原生质 体死 亡一 , 只 有 2 ( 。气 一 3 ( % 能够存活 : 此后 , 原生质体基本上不再死亡 。 用灸光增
白剂染 色鉴定的结果表明 , 在 P E S培养基中培养 4 h8 后 , 7。 % 的成活原生质体周围 , 有
较弱的炙光 出现 , 说明此时细胞 壁已经开始合成 。 同时细胞色素逐渐变浓 , 体积增大 ,
细胞壁加厚 、 并于培养第 s d 开始 出现细胞分裂 。 约有 7 0 % 的细胞直接分裂成为两个相
等的子细胞 ( 图版 , 图 2 ) . 另一部分细胞 , 在细胞壁合成的同时 , 发生 了出芽现象 ,
原生质 从细胞一侧突 出 , 使细胞拉 长 , 这类细胞分裂后 , 形成 两个不等的子细胞 ( 图版 、
图 3 ) 。
进行均等 分裂的细胞 , 经 20 d 不断分 裂后 , 形成 了直径为 0 . 2一 0 . s m m的实心球状
体 ( 图版 , 图 4 , 其边缘规则 , 无突出的细胞和分枝丝状体 , 解剖结构与亲本藻体的
解 剖结构相同 , 也具 有明显的皮层 和髓部 t 图版 , 图 s a 曰 。 它们虽具假根丝 , 但附毫
力很弱 · 稍加震荡便脱 离基质 , 游离于培养 液中 。 进行不等分裂的细胞 , 继续分裂后形成
了具有假根 的深棕色愈伤组织状细胞团和分枝丝状体 ( 图版 , 图 6 ) 。 这些细胞团周 围
不规则 , 有许多突 出的细胞和丝状体 , 细胞间结构松散 , 易压碎 , 且所有细胞都含有色
素体 。 丝状体 和愈伤组织状细胞 团也不能牢固地附着于基质上 。
经 3。一 4 〔、 己培养 , 球状体 和愈伤组织状细胞团的大小均可达 0 . 5 一 1 m m , 并开始分
化 。 部分球状体从一侧伸长 ( 图版 , 图 了 ) , 或由一侧 出现一生长点 , 它可 以长成另一
球状体 , 然后 由次生球状体分化出植株 ( 图版 , 图 8 ) , 也可能由生长点去分化 , 从而
长出愈伤组织状细胞 团 。 愈伤组织状细胞 团的分化与球状体的分化基本一致 , 也由细胞
团先分化 出幼 ’ · 芽 ” (图版 , 图 9 ) , 之 后 , 幼 ` “ 芽 ` ’ 长成植株 。 不同的是 , 细胞团可
以同时分化出多个 二 芽 ” ( 图版 , 图 1() ) , 而球状体 只能分化出一个 。 在全部 4 个月的
培养 中 , 未观察到丝状体有分化产生 。
若将未分化的球状体和愈伤组织状 细胞团分组培养 , 并在 P E赔养基中分 别加入不
同植物激素 , 结果发现 , 在这些有菌培养 中 , 不同种类和不同浓度的激素 , 对球状体的
生长和分化 有不 同的影响 ( 表 3 ) : 低浓度的叫噪乙酸 、 IA A , l 。 引 L ) 、 6 一卞基嗓
岭 ( 6 一 F A , 1 m g/ / )L 和增产剂 ( c 一 7 51 , s rn 舒 L ) , 对球状体的生长和分化都具
有不 同程度的促进作用 , 较高浓度 的 IA A ( 20 m g L/ )对其生长和分化有 抑制作用 。 三种
激素对愈伤组织状细胞 团的作用 , 也表现出与上述相似的结果 。
抱子体和雌配子体的原生质体 , 其再生和分化方式是 相同的 , 再生植株的形态完全
一致 二 经四个月培养后 , 植株可达 2 一 3 c m长 , 并有分枝出现 ( 图版 , 图 1 1 ) 。 但是 ,
青 岛 海 洋 大 学 学 报 9 9 1年
在实验室 内培养条件下 , 再生植株中尚未 出现成熟个体 。
表 3 激素对球状体生长和分化的影响
( 处理后 2 0 d )
E f f e e st o f h o r m o n e s o n t h e g r o w t h a n d d l f f e r e n t l a t l o n
o
f
th e s P h e r , c a l st r u c ut r e s
( 2 0 d 习y s a f t c r t r e a r m e n r )
激素 浓度 ` 二 月 /毛 ) 球状体直径 ( 。 m ) 分化率 ( % )
H o r m o n e C o n 〔 ; n t r盛 c l o n D 二Z m e t e r o f S Ph e r 一c a l D 二f f e r亡 n r一刁 r一0 6
S r r u ` r u r e R a 比
对照 P曰培养基 0 . 8 2 2 0
C o n t r o l P E S M 之 d一 u rn
I人 A l 1 . 3下 2 7 . 8
I ^ ^ 2( ) 0
.
6 8 14
.
3
6
一
F A l 0
.
9吕 3 1 6
C
一下5 1 5 0 . 92 2 6 1
3 讨 论
3
.
1 提高原生质体产里与成活率
在原生质体分离过程中 , 有效地控制酶液的 P H值 、 酶解反应的温度和时间 , 对于
提高原生质体产量和成活率 , 是必不可少的环 节 , 这在现有文献中 ,是最常讨论的问题 。
但对于材料的预处理方法 、 工具酶的种类及渗透剂的选择 , 却较少有人涉及 。 本实验的
结果表明 , 采用适当的预处理方法 , 选择理想的工具酶和渗透剂 ,对于提高原生质体的产
量和 成活率同样也是必要的 。 不同的预处理方法 , 造成 了细胞的不同生理状态 , 因此影
响了原生质体的成活率 。 不同动物有不 同食性 , 对 同一种食物的消化能力也不同 , 因而
来 自不同动物的消化酶 , 对角叉菜细胞壁的离解作用也有明显差异 。 这一结论与戴继勋
在条斑紫菜 ( .P ye 韶 en s t’s) 中所获得的结果一致 〔1 。〕 。 这说明 , 在目前藻类原 生质 体
研究不够广泛的情况 下 , 广开酶源 , 寻找不 同物种所需要的特殊酶 , 对 于 促 进 海藻原
生质体的分离研究具 有重要意义 。
3
.
2 原生质体的极性
角叉菜的原生质体 , 在培养中出现了出芽现象 ,这在高等植物 中是常见的 。唐延林〔 l幻
曾观察到了圆紫菜 ( 尸. su b口 r 介 u 匆似 ) 原生质体的出芽 , 并且认为 , 这可能是由于培 养
液中有机炭源不足 , 造成 了细胞壁合成不均 匀 、 不连续 , 致使细胞生长时 , 细胞质从无
l 期 角叉菜 (C ho ” d邢 oc el 必扭 5H ol m j 原生质体分离 . 培养与再生的研究 59
. .
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图 版 说 明
图 l 新分离的原生质体
F r e 比 L yi, 兔盔优 d Pt o份 PI盆九
图 2 细胞壁再生后的均等分裂
Sym m e r r一e “ I d一v i si o n a f et r ce l l w 合 Il r亡 g 亡 n e r a t r o盯
图 3 原生质体出芽后细胞不等分裂
A叮 m m c r r一` a l d皿v一s zo n Z f te r b u dd i n名 Pr o “ s
图 4 培养 20 d 后形成的实心球状体
Sph e r一c a l s r r u e r u r e s
图 5 。 亲本藻体的解剖结构
^ n a r o m ,` 2 1 s t r u ` r u r e o f Pa r e o r rh Z l u s
图 s b 球状体的解剖结构
A n a t o m 皿` 2 ] s t r u e t u r c o f rh e s p h e r一e Z j s 〔r u e ut r c
图 7
图 8
图 分
图 1 (乃
图 1 1
球状体直接伸长形成植株
S Ph ` r .` a l s t r u c山 r` e l o n只 Z r e t o f o r m hr a ,. u s
次生球状体的产生及其分化
F。 : m : t o` n : n d d : f f c r亡 n r、么 t一o n o f 义` o o d盔 r y s ph亡 r i c Z I s t r u仁 ut r e s
愈伤组织状细胞团的分化
日一亡正匕「` n t盆Z t l o n o f c a l l让 , ll k e 认 ` u c ut r e s
愈伤组织状细胞团同时分化出几个芽
4 b ` d s f o r n l c d s l m u l一a n e o u s l梦 b丫 o o e e盆 l! u s 一 I i k e c e盆一 m a农 s
再生出的完整植株
R e名e n e r Z rc d w h o l e P l a n st
图 6 由不等分裂的细胞发育成的愈伤组织状细胞团和丝状体
C a l l u s
一
l一k` s之 r u c t u r c s Z n d f一] . m e n st f o r m e d b y Z砰 m m 亡 t r一e a l l y
d压v i d c d e e ] 15
60 青 岛 海 洋 大 学 学 报 1 9 9 1 年
壁或薄壁区突出成 “ 芽 ” 。 但是 , 在缺乏炭源的 P E赔养液 中 , 角叉菜原生质体仅少数
有此现象 , 这与上述结论相矛盾 。 众所周知 , 藻类的抱子和合子都具有一定极性 , 在丝
状藻类 , 特别是丝状红藻中 , 藻体片段和单个游离细胞也都具有极性 , 而上述极性 , 会
因离心和 电场等 的作用而被破坏 、 消失 , 甚至颠倒 〔1 2〕 。 大型海藻的体细胞是否保持这
种极性 , 并无确定看法 。 hsI iaz w a等观察到 , 香蕉菜 (B oe 耀粥s e 刀 l’a fo br o s 动 原生质片段 再
生成的圆形细胞 , 因单向光诱导产生了极性 〔1 3〕 。 但有关大型海藻体细胞极性问题的研
究 , 尚不多见 。 根据本实验的结果 , 作者认 为 , 角叉菜原生质体的出芽 , 也是一种极性
现象 。 它的产生有两种可能 , 一种是 : 角叉菜体细胞本身具有极性 , 在原生质体分离 、
离心收集及培养过程 中 , 使部分 细胞失去了极性 , 只有少数细胞的极性得到保持 ; 另一
种相反的可能是 : 角叉菜细胞无发育的极性 , 但由于一系列的操作和培养过程 , 使少部
分原生质体的内部物质发生重新分布 ,从而产生 了极性 。 当然 , 这些说法是否正确 , 尚待
进 一步探讨 。
3
.
3 植株的分化及其愈义
同一培养条 件下的 角叉菜原 生质体 , 同时出现 了实心球状体 、 愈伤组织状细胞团和
丝状体三种发育方式 , 这在其它海藻中尚未发现 。 细胞团的产生 , 是海藻原生质体发育
中的最常见方式 。 红藻中 , 坛紫菜 ( 尸 . h al’ et 儿 es l’s) 的原生质体再生成细 胞 团 , 然 后
由细胞团分化 出了植株 〔 1 引 ; 圆紫菜 ( 尸 . su b o r l’c 况必必 ) 的原生质体也长成 了细胞团 ,
但细胞 团却产生 了抱子 , 抱子放散后 萌发形成藻体 〔1 1〕 ; 两种江篱` . 如刀 a n e lfo 珊 之污和
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t l’k va h必哟原生质体 , 长出了 16 一 32 个细胞的细胞团 , 但未能分化 苏 。 丝状体的产生
在裙带菜 ( U . P l’n n at 夕记改) 中有过报道 比 , 同裙带菜中的情形一样 , 这 些 丝 状 体 也
未能分化 出植株 。 值得一提的是 , 裙带菜生活史中有丝状体阶段 , 而角叉菜没有 , 因此
为何 出现丝状体是值得进一步探讨的问题 。 条斑紫菜 〔尸刁夕尖Oe sn l’s) 泣 5〕 和 孔 紫菜
( 尸 . eP for ar 奴 ) 〔1 6〕的原生质体 , 可以直接再生出植株 , 裙带菜 ( U . P动 二 at 幼汰 z ) 的
原生质体也可 以象抱子一样萌发汗 , 而球状体的 出现从未见过报道 。 从实验结果看 , 球
状体具假根 , 且可以直接分化出植株 , 这似乎与坛紫菜的细胞团相似 〔1 4〕 , 但后者的结
构与亲本藻体不一样 , 而球状体 的解剖结构与亲本藻体的结构相同 , 这似乎更象一种直
接再生方式 , 可又与抱子 萌发不 同 。 因此 , 球状体的形 成是一种新的发育方式 。
通过原生质体分离培养 , 建立大型海藻的无性生殖系 , 是一种简单 、 快速的方法 。
这在理论上 、 实 践上都具有重要意义 。 然而 , 除 了分化程度较低的紫菜外 , 其他种类的
红藻和褐藻 , 都未能通过原生质体培养实现克隆化 。 本实验通过原生质体的分离培养 ,
获得了角叉菜抱子体和雌配子体的再生植株 , 实现了两种藻体的克隆化 , 这在真红藻纲
lF or ide oP h yce ae 中为首次报道 。 它可以为角叉菜的生理 、 生化和遗传学研 究 提 供 遗 传
上稳定一致的实验材料 ,同时为角叉菜体细胞遗传育种 ,开辟 养殖中种苗来源新途径 , 奠定
了初步基础 。
期 角 叉菜 ( C ho n d朋 oc el la t璐 H 国m ) 原生质体分离 , 培养与再生的研究 6 1
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参 考 文 献
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昊少 波 : 裙带菜原生质体的分离和培养 青岛海洋大学学报 2 O,门
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62 青 岛 海 洋 大 学 学 报 9 9 1 年
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