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甜叶菊苷类提取工艺研究



全 文 :基金项目:新疆维吾尔自治区科技支疆项目(2013911135)
作者简介:何巧丽(1990-),女,在读硕士,研究方向:中药化学。
通信作者:田树革,博士,教授,博士生导师,研究方向:中药质量控制及评价,E-mail:tsgyz@sina.com。
甜叶菊苷类提取工艺研究
何巧丽1,李柯翱2,季志红2,田树革3
(1新疆医科大学中医学院,乌鲁木齐 830011;2新疆奇康哈博维药有限公司,乌鲁木齐 830026;3新疆医科大学中心实验室,乌鲁木齐 830011)
摘要:目的 优化甜叶菊苷类的提取工艺条件。方法 通过考察料液比、提取温度、提取时间和提取次数对
甜叶菊中甜菊苷(Stevioside,St)和莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)含量的影响,设计正交试验,以RA含量为评价
指标,优选出甜叶菊回流提取的最佳提取工艺。结果 最佳条件:料液比(m/v)为l g∶20mL、提取温度为80℃、
提取时间为1h、提取次数为2次。结论 经过重复性实验验证,该提取工艺稳定可行。
关键词:甜叶菊;正交试验;甜菊苷;莱鲍迪苷A
中图分类号:R94  文献标识码:A  文章编号:1009-5551(2016)03-0327-04
doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.03.016
Study on extraction process of Stevia rebaudiana Bertoni by orthogonal design
HE Qiaoli 1,LI Keao2,JI Zhihong2,TIAN Shuge3
(1 College of TCM,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China;2 Xinjiang Qi Kang
Ha Bo Medicial Company,Urumqi,830026,China;3 Central Laboratory of
Xinjiang Medical University,Urumqi,830011,China)
Abstract:Objective To optimize the extraction process of Rebaudioside A and Stevioside in Stevia rebaudiana Ber-
toni extracts by single-factor experimental conditions and orthogonal design method.Methods By investigating
solid-liquid ratio,extraction temperature,extraction time and efects of extraction times on the contents of sweet
leaf chrysanthemum stevioside(St)and rebaudioside A(rebaudioside A,RA),design orthogonal test,put RA
content as evaluation indexes to optimize a extraction procedure of Stevia rebaudiana reflux extraction.Results 
The best conditions:solid-liquid ratio(m/v)was 1g∶20mL,extraction temperature was 80℃,extraction time
was 1h,extraction times was 2times.Conclusion The extraction process is stable and feasible,and the extrac-
tion eficient is high.
Keywords:Stevia rebaudiana Bertoni;Orthogonal test;Stevioside;Rebaudioside A
  甜叶菊 (Stevia rebaudiana Bertoni),又称甜菊、
甜茶,是菊科甜叶菊属植物[1]。为多年生草本植物,
其叶含30多种甜菊糖苷类化学成分[2-3],甜叶菊原
产于南美巴拉圭和巴西交界的高山草地,我国于1976
年引种,它是一种新的甜味剂植物[4-5]。甜菊糖,提
取自甜叶菊的叶片,是一系列甜菊糖苷类的混合物,
其中RA(莱鲍迪苷A,Rebaudioside A)和St(甜菊苷,
Stevioside)为甜菊糖中2种主要组分[6-7]。作为一种
天然甜味剂,由于甜叶菊中RA具有高甜度、低热量、
安全无毒等特点,长期食用不会使人发胖。故可作为
肥胖症、低血糖、高血压、心脏病等患者的非热性甜味
剂,也可把它用于糖尿病患者的辅助治疗药物。甜叶
菊有强壮身体和调节胃酸等作用,被称为“健康长寿”
之药[8-10]。甜叶菊糖苷传统提取方法为热水浸提法,
该方法耗时长、能耗高,增加了后续分离纯化的难度。
本研究采用回流提取法,以甜叶菊中的RA含量为指
 第39卷 第3期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Vol.39 No.3
 2016年3月 Journal of Xinjiang Medical University Mar.2016
标进行评价,利用正交试验优化筛选最优化提取工
艺,为甜叶菊后续开发利用提供参考价值。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 AK-100摇摆式中药粉碎机(温岭
市奥力中药机械有限公司),METTLER TOLEDO型
电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司),KQ-200KDE型
超声清洗器(昆山市超生仪器有限公司),HH-S6水
浴锅(金坛市医疗仪器厂),TDL-40B型离心机(上海
安亭科学仪器厂),Agilent-1220LC-高效液相色谱仪、
DAD检测器、二元泵(美国Agilent公司)。甜菊苷对
照品(成都曼斯特生物科技有限公司,批号:MUST-
14102111)、莱鲍迪苷A对照品(曲阜香洲甜菊制品有
限责任公司,批号:20150203),乙醇、磷酸钠等均为分
析纯(沈阳化学试剂厂),乙腈为色谱纯试剂(Fisher),
实验用水为自制蒸馏水。
1.2 实验药材 甜叶菊于2013年9月在新疆阜康
市采集,经新疆医科大学中医学院生药学教研室徐海
燕副教授鉴定为菊科多年生草本植物甜叶菊 (Stevia
rebaudiana Bertoni)的干燥叶片。
1.3 实验方法
1.3.1 原材料的实验预处理 取甜叶菊叶,干燥后
用粉碎机粉碎,过3号筛,备用。
1.3.2 St和RA的提取方法 称取甜叶菊粉末加入
一定量的70%乙醇,浸泡30min,回流提取一定时间
后,将提取液离心,收集上清液,浓缩,蒸干,用流动相
[乙腈-磷酸钠缓冲液(32∶68,pH=2.60)]定容至50
mL,进行 HPLC分析,测定提取液中St和 RA的
含量。
1.3.3 甜菊苷和莱鲍迪苷A含量测定方法
1.3.3.1 色谱条件 Agilent·Zorbax·SB-C18色谱
柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相:乙腈-磷酸钠缓
冲液(32∶68,pH=2.60),流速1mL/min,柱温
40℃,检测波长210nm。在此色谱条件下的理论塔板
数为2 000,分离因子为1.52,分离效果较好,见图1。
1.3.3.2 对照品溶液制备 分别称取干燥至恒重的
St和RA对照品适量,加入流动相溶解,制成浓度分
别为0.426mg/mL和0.908mg/mL的对照品溶液,
备用。
1.3.3.3 对照品溶液标准曲线的制备和线性关系的
考察 将“1.3.3.2”项下试验方法制备的对照品溶液
在“1.3.3.1”项下色谱条件测定,进样量分别为1、2、
3、4、5μL和2、3、4、5、6μL,以对照品的含量(μg)为
横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,回归方程分
别为:Y=105.7X-6.312(r=0.999 9)和Y=179.
4X-14.55(r=0.999 9),St对照品溶液含量在0.
426~2.130μg间线性关系良好,RA对照品溶液含
量在1.816~5.448μg间线性范围关系良好。
图1 St和RA的液相色谱图(A:RA,B:St)
1.3.3.4 精密度试验 分别精密吸取“1.3.3.2”项
下对照品溶液各10μL,按“1.3.3.1”项下色谱条件进
样,分别测定St和RA峰面积,计算St和RA的峰面
RSD(n=6)分别为1.19%和0.58% ,表明进样方法
和仪器精密度良好。
1.3.3.5 重复性试验 精密称取甜叶菊样品1.0g,
按“1.3.2”项下方法制备甜叶菊样品溶液,分别精密
吸取10μL,按“1.3.3.1”项下色谱条件进样分析,依
据峰面积积分值采用标准曲线计算St和RA含量,2
组分含量的RSD(n=6)分别为0.33%和0.21%,表
明样品制备方法重复性良好。
1.3.3.6 加样回收率试验 精密称定已知St和RA
含量的甜叶菊佯品粉末约0.5g,平行称定6份,每份
按高、中、低3种浓度分别加入St和RA对照品适量,
按“1.3.2”项下方法制备甜叶菊样品溶液,按“1.3.3.
1”项下色谱条件进样分析,测定峰面积,采用标准曲
线计算含量,求取待测组分的平均回收率。St和RA
平均回收率分别为(99.54±0.48)%和(99.92±0.
30)%,RSD(n=6)分别为0.480%和0.304%。
1.3.4 单因素试验
1.3.4.1 料液比考察 精密称取预处理后的甜叶菊
粉末2g,分别加入(1:14、1:16、1:18、1:20、1:22倍量
的70%乙醇),在温度为80℃条件下回流1h,由试验
结果探讨不同料液比对St和RA含量的影响。
1.3.4.2 提取时间考察 精密称取预处理后的甜叶
菊粉末2g,加入20倍量70%乙醇,在温度为80℃条
件下分别回流0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h,由试验结果
探讨不同提取时间对St和RA含量的影响。
1.3.4.3 提取次数考察 精密称取预处理后的甜叶
菊粉末2g,加入20倍量70%乙醇,在温度为80℃条
件下分别回流提取1、2、3、4次,由试验结果探讨不同
提取次数对St和RA含量的影响。
1.3.5 正交试验优选 在单因素试验基础上,主要
以甜叶菊粉末中RA的含量为指标,选取料液比、提
823 新 疆 医 科 大 学 学 报 第39卷 
取时间、提取次数为考察因素,采用正交试验优化甜
叶菊药材中甜菊苷及莱鲍迪苷A的提取工艺条件,
因素水平表,见表1。
表1 因素水平表
水平
因素
A:料液比(g/mL) B:时间/h  C:次数/次
1  1:18  0.5  1
2  1:20  1  2
3  1:22  2  3
2 结果
2.1 单因素试验
2.1.1 料液比对St和RA含量的影响 在保持温
度、提取时间、提取次数一定的情况下,由于料液比的
增加,含量也随之逐渐升高后慢慢趋于平稳。在料液
比较低时,含量较低,当料液比>1:20时,RA含量达
到最高基本不再增加,表明甜叶菊粉末中的RA已基
本提取完全,故选取料液比为1:20作为正交试验指
标之一,见图2。
图2 料液比对甜菊苷和莱鲍迪苷A含量的影响
2.1.2 提取时间对St和RA含量的影响 在保持温
度、料液比、提取次数一定的情况下,由于提取时间的
增加,含量也随之逐渐升高,逐渐趋于平稳状态。由
图可知,在提取时间较短时,含量较低,当提取时间大
于1h时,由于RA含量达到最高基本不再增加,表明
甜叶菊粉末中的RA已基本提取完全,故选取提取时
间1h作为正交试验指标之一,见图3。
图3 提取时间对甜菊苷和莱鲍迪苷A含量的影响
2.1.3 提取次数对St和RA含量的影响 在保持温
度、料液比、提取时间一定的情况下,由于提取次数的
增加,含量也随之逐渐升高后逐渐趋于平稳状态。由
图可知,在提取次数较少时,含量较低,当提取次数大
于2时,RA含量达到最高基本不再增加,表明甜叶菊
粉末中的RA已基本提取完全,故选取提取次数2次
作为正交试验指标之一,见图4。
图4 提取次数对甜菊苷和莱鲍迪苷A含量的影响
2.2 正交试验 各因素对St和RA含量的影响大
小顺序对于St和RA均是C(提取次数)>A(料液
比)>B(提取时间);每个因素3个水平之间的趋势分
别为A2>A3>A1,B2>B3>B1,C2>C3>C1,直观分
析最佳提取工艺条件为A2B2C2,即提取时间为1h,
提取次数2次,料液比1∶20。方差分析结果表明:提
取次数C在试验中为显著性影响因素,对提取物中甜
菊苷含量影响最大,而B、C差异对St和RA的提取
含量无统计学意义,提取次数C在试验中为显著性影
响因素,对提取物中甜菊苷和莱鲍迪苷A含量影响
最大,而B、C因素对其影响较小,结果见表2~5。
表2 正交试验结果表
No  A  B  C  St/% RA/%
1  1  1  1  4.72  8.92
2  1  2  2  5.65  10.70
3  1  3  3  5.45  10.98
4  2  1  2  6.02  11.62
5  2  2  3  5.85  11.55
6  2  3  1  5.25  9.15
7  3  1  3  5.10  10.78
8  3  2  1  5.07  9.50
9  3  3  2  5.75  11.20
表3 正交设计试验结果及分析结果
项目
St/%
A  B  C
RA/%
A  B  C
K1  15.82  15.84  15.04  30.6  31.32  27.57
K2  17.12  16.57  17.42  32.32  31.75  33.52
K3  15.92  16.45  16.40  31.48  31.33  33.31
R  0.43  0.24  0.79  0.57  0.14  1.98
最佳水平 A2 B2 C2 A2 B2 C2
923 第3期 何巧丽,等:甜叶菊苷类提取工艺研究
2.3 验证试验 以所得最佳工艺条件提取3批样
品,测定样品提取液中St和RA含量分别为6.08%、
5.98%、6.02%和11.12%、11.16%、11.08%,平均值
分别为6.03%和11.12%,与预测值接近,表明优选
的提取条件稳定可行。
表4 甜菊苷方差分析表
因素 离差平方和 自由度 均方(MS) F值 临界值 P值
料液比 0.35  2  0.17  7.10  F0.05(2,2)=19.0 <0.1
提取时间 0.10  2  0.05  2.08  F0.01(2,2)=99.0 <0.1
提取次数 0.95  2  0.48  19.34  F0.10(2,2)=9.0 <0.05
误差 0.05  2  0.02
表5 莱鲍迪苷A方差分析表
因素 离差平方和 自由度 均方(MS) F值 临界值 P值
料液比 0.49  2  0.25  1.29  F0.05(2,2)=19.0 <0.1
提取时间 0.04  2  0.02  0.11  F0.01(2,2)=99.0 <0.1
提取次数 7.60  2  3.80  19.96  F0.10(2,2)=9.0 <0.05
误差 0.38  2  0.19
3 讨论
本研究以提取时间、提取次数、溶剂用量等为影
响因素,通过对正交试验结果进行方差分析,确定了
甜叶菊中甜菊苷St和RA的最优化提取工艺。从方
差分析结果可直观分析出提取次数在试验中为最显
著性影响因素。从正交试验结果确定了各因素最佳
的水平组合为A2B2C2,经重复性实验验证此工艺条
件稳定可行,优化提取工艺方案科学合理。
乙醇提取法以其无毒、溶媒极性可调、操作简便、
提取效率高、环境污染小、适合大规模工业生产等诸
多优点而被广泛应用于植物化学组分的分离提取。
由于RA和St化学结构的差异使其具有不同的水溶
性,RA分子结构上具有3个葡萄糖基团,其亲水性
较St强,为了兼顾其极性和提高其提取率,本实验在
提取过程中选用70%的乙醇作为提取溶剂,RA和St
得率在纯水和纯乙醇的情况下远低于使用混合溶媒
的情况。目前,国内对甜菊苷的工艺控制的研究尚属
空白,本研究可为今后甜菊苷的提取提供参考依据。
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[收稿日期:2015-11-5]
(本文编辑 施洋)
033 新 疆 医 科 大 学 学 报 第39卷