全 文 ：思茅松丛生芽诱导及植株再生＊
李　丹1 , 3 , 陈宏伟1 , 2 , 陈少瑜1 , 2 , 吴　涛1 , 2 , 陈　芳1 , 2
(1.云南省林业科学院 , 云南　昆明 650204;2.云南省森林植物培育和开发利用重点实验室/国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护
和繁育实验室 , 云南　昆明 650204;3.西南林学院 , 云南　昆明 650224)
摘要:以思茅松成熟合子胚培育的无菌苗的带子叶顶芽为外植体 , 建立了思茅松组培的丛生芽诱导 、 伸长和生
根的植株再生体系。丛生芽诱导培养基为 1/ 2MS+2.0～ 3.0 mg · L-1 6-BA+0.05 ～ 0.1 mg · L-1NAA , 其诱
导率为 93.3 %;丛生芽伸长诱导培养基为 1/ 2 MS+0.05 mg· L-1NAA;丛生芽小芽不定根诱导培养基为 1/2
MS+2.0 mg · L-1 IBA , 其生根率为 46.67 %。
关键词:思茅松;合子胚;丛生芽诱导;植株再生
中图分类号:S 791.24　　文献标识码:A　　文章编号:1672-8246 (2010) 01-0069-04
Induction of Clustered Buds and Regeneration of Pinus kesiya var.langbianensis
LI Dan1 , 3 , CHEN Hong-wei1 , 2 , CHEN Shao-yu1 , 2 , WU Tao1 , 2 , CHEN Fang1 , 2
(1.Yunnan Academy of Forest ry , Kunming 650204 Yunnan , Chin a;2.Yunnan Provincial Key Laboratory for Cu ltivat ion and Exp loi tat ion of
Forest Plants;Yunnan Laboratory for Con servation of Rare , Endangered &Endemic Forest Plan ts , S tate Fores try Adminis t rat ion ,
Kunming 650204 Yunnan , China;3.Sou thw est Forest ry C ollege , Kunming 650224 Yunnan , China)
Abstract:We used ste rile top bud w ith coty ledon from matured zygo tic endosperm o f Pinus kesiya
var.langbianensis as explant to establish clustered bud induction , elongat ion and roo ting of regeneration
sy stem for the t ree.The cul ture fo r clustered bud induction w as:1/2 M S + 2.0-3.0mg/ L 6-BA +
0.05-0.1 mg/ L NAA , the induct ion rate w as 93.3 %;the culture fo r elongation of clustered bud w as:
1/2 MS +0.05mg/L NAA ;the culture fo r inducing w ayw ard roots f rom clustered bud w as:1/2MS +
2.0mg/ L IBA , i t s rooting rate w as 46.67 %.
Key words:Pinus kesiya var.langbianensis;zygotic endosperm;induction of clustered bud;plant regeneration
思茅松 (Pinus kesiya var.langbianensis)是
云南省主要用材及采脂树种 , 其林地的分布面积占
云南省林地面积的 11 %, 拥有 1亿 m3的林木蓄积
量 , 在云南省林业生产和生态环境建设中起着极其
重要的作用。为了充分扩展思茅松林木资源 , 营建
思茅松人工林 , 近几年开展了其无性繁殖技术。其
中 , 以思茅松的扦插繁殖技术发展较快 。李炽 、 何
林西 、李福秀等都用扦插方法成功获得思茅松扦插
苗 , 其生根率达 90 %以上。另外 , 李福秀还对思
茅松针叶束水培生根进行了研究 , 结果表明 3年生
思茅松林木针叶束的生根率最高 , 平均生根率为
91 %, 且呈现出随着林木年龄的增加 , 其针叶束
生根率随之下降的规律 。而对思茅松林木组织培养
繁殖技术的研究较缺乏 。本项研究通过试验 , 筛选
出有利于思茅松丛生芽诱导及生根壮苗的培养基配
方 , 以此初步建立了思茅松丛生芽诱导及生根的组
织培养技术体系 , 为增加思茅松优良苗木的来源 ,
推进思茅松优良无性系造林的进程提供了技术支
撑 。
　第 39卷　第 1期
　2010 年 3 月 　　　　　　　　　
西　部　林　业　科　学
Journal of West China Fo restry Science
　　　　　　　　　　 V ol.39　No.1　
March.2010　
＊ 收稿日期:2009-10-30
　　　基金项目:国家发改委国家生物育种高技术产业化专项 “思茅松用材林良种高技术产业化示范与研究”。
　　　第一作者简介:李　丹 (1981-), 女 , 云南石屏人 , 研究实习员 , 硕士研究生 , 主要从事生态学方面的研究。
　　　通讯作者简介:陈少瑜 (1968-), 女 , 广东潮州人 , 副研究员 , 博士研究生 , 主要从事林木遗传育种和生理方面的研究。
1　材料和方法
1.1　种子处理及材料准备
本项研究供试用的思茅松成熟种子 2004 年购
于云南省种苗站 , 为镇沅种源 , 其种子置于 4℃条
件下保存 。试验时用自来水浸泡 48 h , 舍弃漂浮
种子 , 搓洗余下种子后用流动自来水冲洗 10 ～ 30
min。超净工作台上用 0.1 %升汞消毒 15 ～ 20
min , 之后用无菌水涮洗 4 ～ 5次 , 每次 3 min。用
镊子和解剖刀剥出种子中的合子胚 , 接种于 1/2
MS 培养基上培养无菌苗 , 备用。
1.2　丛生芽的诱导试验
选择培养 20 天左右 、 生长健壮的思茅松无菌
苗 , 切取其带子叶的顶芽为外植体进行丛生芽的诱
导试验 。诱导培养基以 1/2MS作为基本培养基 , 首
先进行其培养基添加不同浓度的细胞分裂素 6-BA
的单因素试验。参试的 6-BA 浓度梯度为:0 、
0.5 、 1.0、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 、 6.0 (单位:mg ·
L-1)。在此基础上 , 选择最佳浓度的 6-BA , 进行
配合添加 0 、 0.01 、 0.05 、 0.1 、 0.2 、 0.4 (单位:
mg·L-1)不同浓度梯度生长素 NAA 的单因素试
验。依据两次试验结果 , 筛选较佳的思茅松丛生芽
诱导培养基。两个试验分别于接种后一个月记录外
植体生长状况并计算丛生芽的诱导率。
诱导率=(有芽的外植体数/接种的外植体总
数) ×100 %。
1.3　丛生芽的伸长诱导试验
在筛选出的较佳思茅松丛生芽诱导培养基上对
思茅松丛生芽进行一个月左右的诱导培养 , 将分化
丛生芽的外植体转移至添加浓度为 0 、 0.01 、
0.02 、 0.05 、 0.l 、 0.2 (单位:mg ·L -1)生长素
NAA的 1/2M S培养基上进行思茅松丛生芽的伸长
诱导试验 。4 ～ 5周后观察丛生芽的伸长情况。
1.4　丛生芽小芽不定根的诱导试验
将长至1.2 ～ 1.5 cm 的思茅松丛生芽小芽从基
部单个切下 , 接种到生根培养基上进行不定根诱
导。生根培养基中添加不同浓度梯度的生长素
IBA:0 、 0.5 、 1.0 、 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 (单位:
mg ·L -1)。5周后统计生根率 。
生根率=(生根的丛生芽小芽数/接种的丛生
芽小芽总数)×100 %。
以上各试验中每处理均接种外植体 10个 , 重
复 3次。培养基除添加的激素浓度不同外 , 均以
1/2MS 培养基作为基本培养基配方 , 添加蔗糖 30
g ·L-1 、琼脂 7 g ·L-1 , 其 pH 值 5.8 , 在 121℃
下灭菌 20 min。培养温度为 22±3℃, 光照强度 4
000 Lux , 光照时间 14 h 。
2　结果与分析
2.1　思茅松丛生芽的诱导效果
2.1.1　6-BA 对思茅松丛生芽诱导的影响
思茅松带子叶顶芽外植体接种到诱导培养基后
4周左右 , 在未添加 6-BA 的培养基上 , 其外植
体保持绿色 , 几乎无生长迹象 , 无丛生芽的分化;
而在添加 6-BA 的培养基上 , 可以观察到外植体
基部和顶芽均有一定程度的膨大 , 少数外植体在其
针叶的基部有小芽形成 , 生长较好。不同浓度的 6
-BA 对思茅松丛生芽的诱导结果见表 1 。从表 1
可以看出 , 随着培养基中添加 6-BA 浓度的升高 ,
思茅松丛生芽的诱导率 、平均丛芽数总体上亦呈现
升高状态;但平均芽长在 2.0 mg · L-1 6-BA 时
最高 , 为 3.5 mm , 之后随6-BA添加的浓度升高
而呈现下降状态。综合丛生芽诱导率 、平均丛芽数
和平均芽长的数据 , 初步确定思茅松丛生芽诱导适
宜的 6-BA 浓度为 2.0 ～ 3.0 mg ·L-1 。
表 1　不同浓度的 6-BA 对思茅松丛生芽的诱导结果
Tab.1　Result of induced bud o f Pinus kesiya va r.langbianensis
under diffe rent concentra tion of 6-BA
浓度
/ mg · L -1
接种外
植体数
/株
有芽外
植体数
/株
丛芽诱
导率
/ %
平均丛
芽数
/条
平均
芽长
/ mm
0 30 0 0 0 0
0.5 30 12 40.0 1.2 1.8
1.0 30 18 60.0 1.2 2.2
2.0 30 26 86.7 2.6 3.5
3.0 30 27 90.0 2.6 3.0
4.0 30 26 86.7 3.2 2.2
5.0 30 30 100 3.1 2.0
6.0 30 30 100 3.1 2.0
2.1.2　NAA 对思茅松丛生芽诱导的影响
由于 6-BA 浓度为 2.0 mg · L-1时 , 对外植
体的诱导率较高 、 丛芽生长状态较好 , 故选择在培
养基中添加 2.0 mg ·L-1的 6-BA 作配合添加不
同浓度 NAA 的进一步优化思茅松丛生芽的诱导试
验 。结果表明 , 在培养基中添加 2.0 mg ·L-1的 6
70 西　部　林　业　科　学 　　　　　　　　　　　　　2010年　
-BA基础上 , 又添加 0.01 ～ 0.1 mg ·L-1浓度的
NAA后 , 思茅松丛生芽诱导率约为 90 %, 丛生
芽平均芽长增加 , 其中以 NAA 浓度为 0.05 mg ·
L
-1的效果较佳;添加 0.2 mg · L -1 、 0.4 mg ·
L-1NAA时 , 其丛生芽的芽体数量虽有增加 , 但
形成的芽体小 、 生长缓慢 (表 2)。
表 2　不同浓度的 NAA 对思茅松丛生芽的诱导结果
Tab.2　Result of induced bud of Pinus kesiya var.langbianensis
under different concentration of NAA
浓度
/ mg · L-1
接种外
植体数
/株
有芽外
植体数
/株
丛芽诱
导率
/ %
平均丛
芽数
/条
平均
芽长
/ mm
0 30 26 86.7 2.6 3.5
0.01 30 27 90.0 4.2 3.9
0.05 30 28 93.3 6.1 4.7
0.1 30 28 93.3 5.0 4.2
0.2 30 30 100 4.1 3.0
0.4 30 30 100 4.4 2.9
在思茅松丛生芽的诱导过程中 , 其诱导培养基中
单添加 6-BA , 可诱导丛生芽形成 , 但芽的长度较
短 , 生长较慢 , 若再配合添加一定浓度的 NAA 后 ,
形成的小芽其生长状态较佳。说明在添加6-BA的诱
导培养基中再添加 NAA 对思茅松丛生芽的诱导 、分
化与生长均有促进作用。综合两试验结果 , 初步确定
最佳的思茅松丛生芽诱导培养基为 1/2MS+2.0 ～ 3.0
mg ·L-16-BA+0.05 ～ 0.1 mg ·L-1NAA。
图 1　思茅松丛生芽的伸长状况
F ig.1　The e longation of cluster ed bud of
Pinus kesiya va r.langbianensis
2.2　思茅松丛生芽的伸长诱导效果
在添加不同浓度的 NAA 培养基中 , 思茅松丛
生芽在 NAA 浓度为 0.01 ～ 0.05 mg ·L-1的范围内 ,
基部呈现一定程度的膨大 , 丛生芽有一定程度的伸
长 , 针叶鲜绿色 (见图 1), 伸长效果以添加 0.05
mg ·L-1NAA为最佳 , 其丛生芽平均长度达到 1.8
cm;当添加NAA的浓度达到0.1 ～ 0.2 mg ·L-1时 ,
思茅松丛生芽基部膨大并愈伤化 , 愈伤组织褐变 、
硬化 , 针叶从叶尖开始变枯。由此 , 确定较佳的思
茅松丛生芽伸长诱导培养基为 1/2MS+0.05 mg ·
L-1NAA。
2.3　思茅松丛生芽小芽不定根的诱导效果
思茅松丛生芽小芽不定根的诱导结果见表 3 。
表 3　不同 IBA浓度下思茅松丛生芽小芽不定根
的诱导结果
Tab.3　Adventitio us r oo t induction of cluster buds o f
P inus kesi ya var.langbianensis
浓度
/ mg · L -1
接种
小芽数
/株
生根
小芽数
/株
生根
率/ %
平均
根数
/条
平均
根长
/ cm
0 30 0 0 0 0
0.5 30 9 30.00 1.1 0.6
1.0 30 11 36.67 2.6 1.1
2.0 30 14 46.67 3.2 2.8
3.0 30 6 20.00 4.0 1.0
4.0 30 4 13.33 3.4 0.5
5.0 30 4 13.33 3.3 0.4
单个思茅松丛生芽小芽接种到添加不同浓度
IBA 的生根培养基上 , 3 周后 , 无激素培养基
(IBA浓度为 0 mg · L-1)上的芽体基部没有愈伤
组织产生 , 茎有一定伸长生长 , 无不定根的分化;
在含不同浓度 IBA 的培养基上多数芽体切口处产
生白色愈伤组织 , 但没有不定根的分化。5 周后 ,
无激素培养基上的芽体仍无不定根的分化;而添加
了 IBA 的培养基上均有一定数量的芽体长出白色
的不定根。随着生根培养基中添加 IBA 浓度的升
高 , 其生根率随之升高然后降低 , 其平均根数与平
均根长均亦先升高然后降低。将已生根小芽转接入
无激素的1/2MS培养基中 , 4周后 , 经添加 2.0 mg
·L-1 IBA生根培养基诱导的已生根小芽的不定根伸
长 , 根细而白;6周后 , 主根上有侧根长出 , 颜色
呈淡绿色 (图 2), 其平均根数 3.2 条 , 平均根长
2.8 cm 。当添加的 IBA 浓度低于 2.0 mg ·L-1时 ,
其芽体的生根率 、 平均根数与平均根长都较低;当
添加的 IBA 浓度达到并超过 3.0 mg · L-1时 , 虽
71　第 1期　　　　　　　　　李　丹等:思茅松丛生芽诱导及植株再生
然芽体的平均根数有所增加 , 但生根率与平均根长
均有下降 , 由此确定思茅松丛生芽小芽不定根诱导
的最佳培养基为:1/2M S+2.0 mg ·L-1 IBA 。
图 2　思茅松丛生芽的生根状况
Fig.2　The roo ting o f cluste red bud o f
Pinus kesiya var.langbianensis
3　结论与讨论
(1)本项研究以思茅松成熟合子胚培育的无菌
苗的带子叶顶芽为外植体 , 初步建立了思茅松丛生
芽诱导 、 伸长及生根的组培体系:丛生芽诱导培养
基为 1/2MS+2.0 ～ 3.0 mg · L-1 6-BA +0.05 ～
0.1 mg ·L-1NAA;丛生芽伸长培养基为 1/2MS
+0.05 mg ·L-1NAA;丛生芽小芽不定根诱导培
养基为:1/2M S+2.0 mg ·L-1 IBA 。
(2)在松属 (Pinus)树种组培的丛生芽诱导
及植株再生的过程中 , 丛生芽诱导一般较为容易 ,
但生根诱导则较为困难。本项研究所获的思茅松丛
生芽诱导率 , 最高可达 100 %, 但生根率则只有
46.67 %, 类似的结果在其他松属树种的组织培养
中亦有报道。丛生芽的诱导虽然较为容易 , 但其质
量和状态将直接影响下一步的培养效果 。故而在进
一步的体系优化研究中可从外植体的基因型 、外植
体的发育阶段和生理状态 、培养基与激素的组合等
因素上进行较为系统的研究 , 以提高其组培苗的生
根率和后期的生长质量。
(3)目前 , 云南正在加大思茅松人工林的营造
力度 。已建成的思茅松种子园虽然进入结实期 ,
但种子产量低 , 且不稳定 , 无法供应足够 、优良的
思茅松种子而满足生产上的培育思茅松优质苗木的
用种需求。同时 , 松类树种经营普遍存在育种周期
长 、遗传增益衰退 、林分质量下降等严重问题 。为
此 , 许多学者提出走无性系改良途径不仅可以缩短
其育种周期 , 而且可提高单位时间的遗传增益和林
分质量 。著名林木遗传育种学家马常耕指出 “我国
松类今后的良种化必须沿着有性和无性利用结合的
两条腿走路的方针 , 改变 20年来单一走种子园道
路的政策” 。无性系改良主要的两种技术手段一是
采用扦插 、 嫁接等的常规无性繁殖技术;另一种是
组织培养的快繁技术。在组培快繁技术体系中 , 通
过诱导松属植物外植体产生丛生芽 , 再诱导小芽生
根的丛生芽途径与常见的诱导愈伤组织 、 再诱导芽
和根形成的器官发生途径相比较而言 , 其操作过程
较简单 、周期相对较短 , 是一种可行性较强的组培
快繁途径。本项研究初步建立了思茅松丛生芽诱导
及植株再生的组培技术体系 , 对该体系作进一步的
优化后 , 可为思茅松优良无性系造林提供一条高效
的育苗途径 。
参考文献:
[ 1] 吴　涛 ,陈少瑜 , 陈　芳 ,等.思茅松成熟胚无菌萌发
及农杆菌介导的遗传转化[ J] .东北林业大学学报 , 2008 , 36
(2):10-12 , 15.
[ 2] 孟　梦 ,陈宏伟 , 王达明 ,等.优良的纸浆材树种———
思茅松[ J] .西南造纸 , 2004 , 33(3):13-15.
[ 3] 黄宝祥 ,符树根 , 舒惠理.湿地松丛生芽的增殖研究
[ J] .现代农业科技 , 2007(13):13-14.
[ 4]何月秋 ,叶建仁.湿地松丛生芽的诱导及试管苗的生
根研究[ J] .南京林业大学学报(自然科学版), 2005 , 29(5):
13-16.
[ 5] 朱丽华 ,郑　丹 , 吴小芹.黑松丛生芽的诱导及植株
再生[ J] .南京林业大学学报(自然科学版), 2006 , 30(3):27-
31.
[ 6]朱丽华 ,吴小芹.火炬松丛生芽诱导及植株再生[ J] .
林业科技开发 , 2006 , 20(3):36-38.
[ 7] 李福秀 ,张晓明 , 周体林 ,等.思茅松针叶束水培生根
的研究[ J] .西南林学院学报 , 2005 , 25(1):24-27.
72 西　部　林　业　科　学 　　　　　　　　　　　　　2010年