全 文 ：中国农学通报 2012,28(24):250-255
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
中国是农业大国，农业生产安全在国民经济中占
有举足轻重的位置。因此对于植物病害的防治一直是
农业生产中的重中之重。而植物病毒病又是引起植物
基金项目：北京市科技新星计划资助项目“裂褶菌中抗植物病毒蛋白的基因克隆”(2009B28)。
第一作者简介：李洋，男，1985年出生，辽宁抚顺人，在读硕士，研究方向：果树生理学研究。通信地址：100097中国农业大学西校区科研楼1233室，
E-mail：liyangfastgo2010@126.com。
通讯作者：王红清，女，1965年出生，副教授，博士，研究方向：果树生理学研究。通信地址：100097 中国农业大学西校区科研楼 1233室，Tel：
010-62732288，E-mail：wanghq@cau.edu.cn。
收稿日期：2011-12-09，修回日期：2012-03-30。
裂褶菌蛋白粗提液抗植物病毒活性初探
李 洋 1，周 莹 2，李兴红 2，王红清 1
（1中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193；2北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097）
摘 要：为了研究裂褶菌(Schizophyllum commune)蛋白的生物活性，对裂褶菌蛋白粗提液进行了抗烟草
花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)活性测定。使用
硫酸铵沉淀法，从裂褶菌中得到蛋白粗提液，采用喷施法和局部枯斑法，研究其诱导TMV的抗性，体外
钝化TMV的效果及其对由CMV侵染引起的辣椒病毒病和由TMV侵染引起的番茄病毒病的控制作
用。活性检测结果表明：当蛋白粗提液浓度达到100 μg/mL时，诱导烟草抗TMV的侵染枯斑抑制率可
达 74.11%±3.7%，对TMV的体外钝化作用的枯斑抑制率为 70.05%±1.25%，其对由CMV侵染引起的辣
椒病毒病的平均防效为66.46%，对由TMV侵染引起的番茄病毒病的平均防效为68.50%。表明裂褶菌
蛋白粗提液通过诱导抗病性和体外钝化作用达到了控制TMV和CMV的作用。
关键词：裂褶菌；蛋白粗提液；烟草花叶病毒；辣椒病毒病
中图分类号：S432.4+1 文献标志码：A 论文编号：2011-3670
Preliminary Research on the Activity of Anti-tobacco Mosaic Virus and Anti-pepper Virus of
Crude Protein Extracts from Schizophyllum commune
Li Yang1, Zhou Ying2, Li Xinghong2, Wang Hongqing1
(1China Agricultural University, the College of Agriculture and Biotechnology, Beijing 100193;
2Institute of Plant and Environment Protection, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science, Beijing 100097)
Abstract: To reveal the bioactivity of Schizophyllum commune, the activity determination of anti-tobacco
mosaic virus (TMV) and Cucumber mosaic virus (CMV) were studied with crude protein extracts of S.
commune. The crude protein was extracted from S. commune by the ammonium sulfate precipitation method, and
the activity of inducing tobacco resistance to TMV, anti-TMV in vitro and control cayenne pepper virus caused
by CMV and tomato virus disease caused by TMV were studied. The activity detection results showed that when
the concentration was 100 μg/mL, the inhibition ratio of inducting resistance to TMV and anti-TMV in vitro
were 74.02%±3.61% and 70.05%±1.25%, respectively. The control ratio of cayenne pepper virus disease and
tomato virus disease were 66.46% and 68.50%, respectively. It showed that the crude protein extracts from S.
commune could keep high activity of resistance of TMV and CMV by inducing resistance and anti-activity in
vitro.
Key words: Schizophyllum commune; crude protein; Tobacco mosaic virus (TMV); Cucumber mosaic virus
(CMV)
李 洋等：裂褶菌蛋白粗提液抗植物病毒活性初探
病害的一种重要病原物，植物病毒病在农业生产中十
分普遍，且危害严重，轻者减产 20%~30%，严重时损
失 50% ~60%，防治十分困难。烟草花叶病毒
(Tobacco mosaic virus，TMV)是烟草花叶病毒属病毒
的典型成员，其寄主范围非常广泛，能侵染茄科、藜科、
苋科、葫芦科、十字花科、番杏科、豆科和商陆科等共
30科300多种植物[1]。
黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是黄
瓜花叶病毒属典型成员，是迄今已知病毒中寄主范围
最广泛的病毒，能侵染 85科 365属 1000多种单子叶、
双子叶、木本及草本植物[2]。
为了控制植物病毒病，人们采取了很多措施防治
植物病毒[3]，但是由于植物病毒自身没有完整的免疫
代谢系统等特点，以及防治方法的种种局限性，目前，
人们还未能完全防止植物病毒病造成的危害。因此，
人们将目光投向了从自然界生物中寻找抗植物病毒活
性物质，这是一种利用植物自身抗性资源来控制植物
病害的技术手段。
为了控制植物病毒病并进一步减少经济损失，国
内外学者从植物，动物和微生物中分离得到了大量抗
植物病毒活性物质。其中大部分成分具有抗TMV活
性[4]。这些植物体内的活性物质大体可分为植物大分
子（蛋白质，多糖等）和植物小分子（苦木素、生物碱、甾
体、木脂素等）[5-9]。其中，食用菌作为一种大型真菌，具
有丰富的自身抗性资源，在食品和药品等方面都有很
好的应用前景[10]。基用该领域的一些研究基础[11]，人
们从食用菌中筛选出了多种活性蛋白，Kobayashi等[12]
从香菇中获得一种抗 TMV 的蛋白 (fruiting body
protein，FBP)，当其浓度为 20 μg/mL时可完全抑制
TMV对植物的侵染。随后从杨树菇 [13]、榆黄蘑 [14]、金
针菇[15]、毛头鬼伞[16]中均发现了抗病毒蛋白。
裂褶菌(Schizophyllum commune)又称白参、树花，
属于真菌门，担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、裂褶菌
科、裂褶菌属[17]。裂褶菌分布广泛，具有很高的营养价
值和药用价值。中国对于裂褶菌的研究还处于起步阶
段，前人的研究表明，裂褶菌中含有多种抗菌消炎、抗
肿瘤，抗辐射等自身抗性物质[18-20]。
从裂褶菌中得到的蛋白粗提液，对TMV和CMV
有很好的抑制作用。目前食用菌中抗植物病毒活性蛋
白方面的研究还未见报道。该研究也将为裂褶菌抗植
物病毒药物的开发奠定一定的基础。
1 材料与方法
1.1 供试菌种
裂褶菌(Schizophyllum commune)，由北京市农林
科学院植物保护与环境保护研究所植病综防研究室保
存。
1.2 供试毒源
烟 草 花 叶 病 毒 普 通 株 系 (Tobacco mosaic
virus-ordinary strain)保存于北京市农林科学院植物保
护与环境保护研究所植病综防研究室，繁殖于普通烟
(Nicotiana tobacum)‘哈瓦那 38号’，温室内隔离，活体
保存；CMV繁殖于枯斑三生烟(Nicotiana tobacum cv.
Samsun NN)，温室内隔离，活体保存。
1.3 寄主植物
枯斑三生烟作为 TMV枯斑测定寄主；辣椒
(Capsicum frutescens L.)‘茄门’，作为CMV测定寄主。
1.4 裂褶菌液体培养基
可溶性淀粉6%、葡萄糖5.5%、小麦粉3%、玉米粉
4%、酵母膏 0.6%、黄豆粉 1%、蛋白胨 0.6%、KH2PO4
0.1%、MgSO4 0.05%、VB1 0.001%，其余为水。
1.5 实验仪器及主要生化试剂
离 心 机 Eppendorf Centifuge 5804R，pH 计 为
Thermo MODEL868、磁力搅拌器为旋涡 79-3型，干燥
箱为上海一恒DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱，连
续 光 谱 酶 标 仪 为 Molecular Devices Sunnyvale
CA94089，粉碎机为天津市泰斯特仪器有限公司
FW177型中草药粉碎机，试剂为国产分析纯。
1.6 裂褶菌的液体培养
（1）母种活化：将裂褶菌母种转接在PDA固体培
养基上活化，27℃培养10天，菌丝长满平板。
（2）一级菌种制备：将活化得到的平板菌丝切成小
于 1 mm的小块，转入装有 100 mL液体基础培养基的
500 mL摇瓶中，于 28℃、240 r/min条件下进行发酵培
养6天，获得一级菌种。
（3）液体培养：按照体积百分比为10%的接种量将
一级菌种培养液接种到装有 100 mL液体基础培养基
的 500 mL摇瓶中，于 28℃、240 r/min条件下进行发酵
培养6天。
（4）将上述发酵混合液抽滤收集菌丝于 40℃烘箱
中烘干，粉碎得到裂褶菌菌丝粉。
1.7 裂褶菌蛋白粗提液的制备
称取菌丝粉 15 g，加入 150 mL 磷酸缓冲液
(0.025 mol/L，pH 8.0)，4℃浸提 2 h，10000 r/min离心
20 min，收集上清液；往上清液中加入硫酸铵，使其饱
和浓度达到85%，4℃放置，过夜，然后将其10000 r/min
离心 20 min，取沉淀。将沉淀用少量磷酸缓冲液
(25 mmol/L，pH 8.0)溶解，将其装入透析袋，于去离子
水中4℃透析，过夜，中间换水。将透析后得到的的溶
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液10000 r/min离心10 min，上清即为裂褶菌蛋白粗提
液。
1.8 测定蛋白浓度
BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Pierce公司），按
使用说明书进行操作。
1.9 抗病毒效果试验
1.9.1 病毒接种液的制备 实验时间2011年4月。将感
染TMV的普通烟烟叶、感染CMV的枯斑三生烟烟叶
分别去除主脉，与 pH 8.0的 10 mmol/L的磷酸缓冲液
(PBS)按 1 g:20 mL的比例混合，每 20 mL PBS缓冲液
中加入15 mg金刚砂，将叶片充分研磨，然后用四层纱
布过滤，得到病毒汁液，备用。
1.9.2 裂褶菌蛋白粗提液诱导烟草对TMV的抗性 以
5~6叶期的枯斑三生烟为实验对象，去顶心及多余叶
片，留中部3片叶。用超纯水将1.7制备的裂褶菌蛋白
粗提液稀释到终蛋白浓度为 100 μg/mL，对枯斑三生
烟进行整株处理3次重复，每个重复3棵植株，每棵植
株 3片叶子；同时以清水喷施枯斑三生烟作为对照
(CK)，3次重复，每个重复 3棵植株，每棵植株 3片叶
子。喷雾处理枯斑三生烟72 h后接种TMV，采用常规
摩擦接种法接种，接种72 h后调查叶片上的枯斑数，然
后通过公式(1)计算枯斑抑制率。
……………………………………………………… (1)
1.9.3 裂褶菌蛋白粗提液对TMV的体外钝化作用 采
用局部枯斑发[21]。以5~6叶期的枯斑三生烟为实验对
象，去顶心及多余叶片，留中部 3片叶。用超纯水将
1.7制备的裂褶菌蛋白粗提液稀释到终蛋白浓度为
100 μg/mL，并与1.9.1中制备的TMV病毒接种液等量
混合，将其静置 30 min；采用半叶法接种枯斑三生烟，
左半叶为裂褶菌蛋白粗提液和TMV提取液混合接种，
右半叶为清水和TMV提取液混合接种，3个重复，每
个重复3棵植株，每棵植株3片叶子。接种72 h后调查
叶片上的枯斑数，利用公式(1)计算枯斑抑制率。
1.9.4 裂褶菌蛋白粗提液对由CMV侵染引起的辣椒
病毒病的控制作用 将 100 μg/mL的裂褶菌蛋白粗提
液喷施于3~4叶期的辣椒叶片上，同时以清水为对照，
每个处理24株，重复3次，72 h后，进行第2次喷施，选
取其中 3片叶接种CMV病毒汁液。待发病明显后调
查病情指数，并计算防效。
病害分级标准：
0级：无病；
1级：轻型花叶，株高未发生变化；
3级：花叶，轻微畸形，植株不矮化；
5级：花叶，植株矮化，较正常植株矮化少于1/2；
7级：植株落叶，植株矮化，较正常植株矮多于
1/2；
9级：整株死亡。
病情指数计算：
……………………………………………………… (2)
防效按照如下方法计算：
……………………………………………………… (3)
1.9.5 裂褶菌蛋白粗提液对TMV侵染引起的番茄病毒
病的控制作用 将 100 μg/mL的裂褶菌蛋白粗提液喷
施于3~4叶期的番茄叶片上，同时以清水为对照，每个
处理24株，重复3次，72 h后，进行第2次喷施，选取其
中 3片叶接种TMV病毒汁液。待发病明显后调查病
情指数，并计算防效。
病害分级标准参照1.9.4节的标准。
病情指数计算用公式(2)计算，防效用公式(3)计算。
2 结果与分析
2.1 裂褶菌蛋白粗提液诱导烟草对TMV的抗性测定
裂褶菌蛋白粗提液诱导烟草对TMV的抗性结果
如表1所示，当裂褶菌蛋白粗提液的浓度为100 μg/mL
诱导枯斑三生烟时，对 TMV的枯斑抑制率达到
74.02%±3.61%，结果见图 1。说明裂褶菌蛋白粗提液
具有很好的诱导烟草抗TMV活性。
2.2 裂褶菌蛋白粗提液对TMV的钝化作用
裂褶菌蛋白粗提液对TMV的钝化结果如表 2所
示，当100 μg/mL裂褶菌蛋白粗提液与TMV病汁液等
体积混合接种枯斑三生烟时的枯斑抑制率为
70.05%±1.25%，结果见图 2。说明裂褶菌蛋白粗提液
对TMV具有很好的体外钝化作用。
处理
100 μg/mL裂褶菌蛋白粗提液
CK
重复一
平均枯斑数
27
104
抑制率/%
74.49
—
重复二
平均枯斑数
25
110
抑制率/%
77.61
—
重复三
平均枯斑数
32
107
抑制率/%
70.20
—
平均值/%
74.02
107
标准偏差
3.61
—
表1 裂褶菌蛋白粗提液诱导烟草对TMV的抗性
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李 洋等：裂褶菌蛋白粗提液抗植物病毒活性初探
2.3 裂褶菌蛋白粗提液对由CMV侵染引起的辣椒病
毒病的防治作用
裂褶菌蛋白粗提液对由CMV侵染引起的辣椒病
毒病的防治作用室内测定结果如表 3、图 3所示。用
100 μg/mL的裂褶菌蛋白粗提液处理辣椒植株后，其
对CMV的平均防效为66.46%。说明裂褶菌蛋白粗提
液对CMV有很好的抗性。
2.4 裂褶菌蛋白粗提液对由TMV侵染引起的番茄病
毒病防治作用
裂褶菌蛋白粗提液对TMV侵染引起的番茄病毒
病防治作用室内测定结果如表 4、图 4所示。用
100 μg/mL的裂褶菌蛋白粗提液处理番茄植株后，其
图1 裂褶菌蛋白提取物诱导烟草对TMV的抗性
处理
100 μg/mL裂褶菌蛋白粗提液
枯斑抑制率/%
重复一
70.67
重复二
68.62
重复三
70.87
平均值/%
70.05
标准偏差
1.25
表2 裂褶菌蛋白粗提液对TMV的钝化作用
左半叶为裂褶菌蛋白粗提液和TMV提取液混合接种，左半叶为PBS
(10 mmol/L，pH 8.0)和TMV提取液混合接种
图2 裂褶菌蛋白粗提液对TMV的钝化作用
处理
100 μg/mL裂褶菌蛋白粗提液
CK
病情指数
重复一
7.87
43.98
重复二
34.72
52.42
重复三
9.72
59.03
平均病情指数
17.44
51.81
平均防效/%
66.46
—
表3 裂褶菌蛋白粗提液抗CMV活性测定
左为PBS(10 mmol/L，pH 8.0)和CMV提取液混合接种，右为裂褶菌蛋白粗提液和CMV提取液混合接种
图3 裂褶菌蛋白粗提液抗CMV活性测定
左叶片为裂褶菌蛋白粗提液处理，右叶片为PBS(10 mmol/L，pH8.0)对照。
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处理
100 μg/mL裂褶菌蛋白粗提液
CK
病情指数
重复一
25.00
75.00
重复二
20.45
72.62
重复三
22.50
68.18
平均病情指数
22.65
71.93
平均防效/%
68.50
—
表4 裂褶菌蛋白粗提液抗TMV活性测定
左半叶为裂褶菌蛋白粗提液和TMV提取液混合接种，右半叶为PBS(10 mmol/L，pH8.0)和TMV提取液混合接种
图4 裂褶菌蛋白粗提液抗TMV活性测定
对TMV的平均防效为68.50%。说明裂褶菌蛋白粗提
液对TMV具有很好的防治效果。
3 讨论与结论
随着全社会对食品安全和环境安全关注度的不断
提高，植物病害的防治由传统的有机化学物质逐渐转
变为对人畜、环境安全性更高的和谐型生物农药。因
此，天然产物抑制剂的利用与开发为抗病毒制剂的研
制开辟了一条崭新的途径[22]。食用菌作为一类功能丰
富的大型担子菌，是研究人员非常热衷的活性物质筛
选源之一。裂褶菌是一种大型野生药食兼用菌，其中
含有丰富的蛋白质，裂褶菌营养菌丝粗蛋白的质量分
数为 28.76%，居于 20%~30%之间，这是一般粗蛋白含
量中比较高的。从裂褶菌中抽提到的蛋白粗提液，进
行诱导烟草对TMV的抗性实验，当蛋白粗提物浓度达
到 100 μg/mL时，其对TMV的抗性为 74.02%±3.61%；
进 行 对 TMV 的 体 外 钝 化 实 验 ，抑 制 率 达 到
70.05%±1.25%；在控制由CMV引起的辣椒病毒病和
由 TMV引起的番茄病毒病实验中，其防效分别为
66.46%和68.50%。说明裂褶菌蛋白粗提液对TMV和
CMV都有很好的抗性，同时对于由CMV侵染引起的
辣椒病毒病和由TMV侵染引起的番茄病毒病具有良
好的控制作用。这一结果为裂褶菌中抗病毒蛋白的进
一步研究和应用奠定了理论基础，进而为生物农药的
研发提供了思路。
本实验使用的是裂褶菌蛋白粗提液，预示着其中可
能含有一种单独起作用的蛋白或是几种蛋白的共同作
用，今后可以更加进一步提取出单一蛋白或几种蛋白，
使其抗植物病毒效果更加明显，为裂褶菌抗病毒蛋白的
研究奠定基础。目前从其他食用菌中也分离出了抗植
物病毒蛋白[23]，这些蛋白之间可能存在某种关系，还有这
种蛋白对其他植物病毒的效果也需要进一步验证。
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