全 文 ：第 41 卷 第 7 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 41 No． 7
2013 年 7 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Jul． 2013
1)国家自然科学基金项目(31160254)。
第一作者简介:卢玲，女，1975 年 5 月生，包头师范学院生物科
学与技术学院，讲师。
通信作者:崔凯，中国林业科学研究院资源昆虫研究所，助理研
究员。E－mail:cafcuikai@ 163． com。
收稿日期:2012 年 7 月 23 日。
责任编辑:任 俐。
高山栲种子的超低温保存1)
卢 玲 王海英
(包头师范学院，包头，014030) (中国林业科学研究院资源昆虫研究所)
图 雅 门中华 崔 凯 赵耀新
(包头师范学院) (中国林业科学研究院资源昆虫研究所) (邯郸市林业局)
摘 要 高山栲种子是一种典型的顽拗型种子，在常规保存手段下，其种子发芽率丧失很快。将高山栲种子
脱水干燥至 5． 01% ～ 25． 35% 5 个含水量梯度，置于液氮中保存 6 个月，结合不同的回湿处理后测定种子发芽率、
相对电导率、脯氨酸(Pro)质量分数、丙二醛(MDA)质量摩尔浓度 4 个指标，评价超低温条件保存高山栲种子的效
果。结果表明，将种子含水量脱水至 20． 36%，置于液氮中保存，然后用质量分数为 20%的聚乙二醇(PEG)回湿处
理 10 h效果最佳，在此条件下，种子发芽率明显高于对照和其他处理;适宜的含水量和回湿处理使种子在储藏过
程中丙二醛质量摩尔浓度降低，脯氨酸质量分数增高。
关键词 高山栲;超低温保存;种子发芽率
分类号 S339． 3+2
Cryopreservation of Castanopsis delavayi Seeds /Lu Ling(Baotou Normal College，Baotou 014030，P． R． China) ;Wang
Haiying(Research Institute of Insect Resources，CAF) ;Tu Ya，Men Zhonghua(Baotou Normal College) ;Cui Kai(Re-
search Institute of Insect Resources，CAF) ;Zhao Yaoxin(Handan Forestry Bureau)/ / Journal of Northeast Forestry Uni-
versity． －2013，41(7)． －6 ～ 8，14
Castanopsis delavayi seeds are typical recalcitrant seeds，and they drastically lose its viability with routine storage
methods． The seeds were dried to different moisture contents from 5． 01% to 25． 35% to explore the effects of cryopreser-
vation，and then stored in LN2 for six months． The seed germination rate，the electrical conductivity，the contents of pro-
line (Pro)and malondialdehyde (MDA)were investigated with different combination treatments of humidification． The
optimum condition of cryopreservation is 20． 36% of seed moisture content and pre-humidification for 10 hours with 20%
PEG． In this condition，the vigor of seeds is distinctly higher than others． The results of three physiological indices indi-
cate that the malondialdehyde content is decreased and the proline content is increased because of the moderate moisture
content and humidification．
Keywords Castanopsis delavayi;Cryopreservation;Seed germination rate
高山栲(Castanopsis delavayi Franch．) ，属壳斗科
(Fagaceae)栲属(Castanopsis)植物，是亚热带一种重
要的高山树种，分布在我国云南、贵州、四川、广西等
省区。在滇中常生于海拔 1 600 ～2 200 m，滇南 900 ～
1 600 m，滇西北可达海拔 2 800 m。木材坚久耐用，可
供建筑、枕木、车辆等用材;果可食，干种仁含淀粉
86． 86%、单糖 1． 38%、双糖 3． 25%、鞣质 0． 26%、脂
肪 0． 22%、纤维素 1． 99%，树皮含单宁 10． 23%;根、
茎皮、果实可入药［1］。是生态公益林建设的优良树
种，具有重要的生态及经济开发价值。高山栲的种子
属于顽拗型种子，耐储性很差，成熟的种子在常温下
储藏半年基本失去生活力;同时由于种子淀粉含量较
高，在储藏过程中极易遭虫蛀;经过前期试验，用冷藏
的方法储藏该种子，半年发芽率调查只有 14%左右，
因此，探索适宜的长期保存其种子的方法对于开发利
用高山栲这一资源具有非常重要的意义。
超低温保存是 20 世纪 70 年代发展起来的一项
现代保存技术，因常以液氮为冷源，又称液氮保
存［2］。是植物细胞和组织长期稳定保存的较好方
法，可以节省空间，避免继代、病虫害和气候等因素
造成的种质丢失，并且设备简单、操作简便［3－7］。目
前，国内外有许多成功应用超低温储藏植物种质资
源的报道，而且其中有多例关于顽拗型种子的［8－10］。
本研究以高山栲种子为试验材料进行超低温储藏，
旨在研究超低温储藏高山栲种子的可行性，并研究
了种子在储藏过程中一些生理生化指标的变化情
况，这将为顽拗型种子种质保存研究提供一些借鉴。
1 材料与方法
试验用材料于 2011 年 10 月中旬采自云南省昆
明市西山森林公园，采集时选择性状优良植株上的
成熟饱满种子。
种子含水量梯度的获得:将种子置于盛有变色硅
胶的干燥器内(m(硅胶)∶ m(种子)= 6 ∶ 1)，结合烘箱
50 ℃烘干，每隔 12 h对种子称质量并且更换硅胶。最
终得到5． 01%、10． 23%、15． 40%、20． 36%、25． 35% 5个
含水量梯度。把不经脱水处理并保存在冰箱 4 ℃的种
子作为对照(CK)，其含水量为 38． 27%。
液氮储藏、回湿处理和发芽试验:将不同含水量
种子装到布袋中，先在冰箱中 4 ℃预处理 1 h，然后
放进液氮中储藏 6 个月;取出时，先将种子在常温下
解冻 15 min，然后用质量分数分别为 0、5%、10%、
15%、20%的 PEG(聚乙二醇，相对分子质量 6000)
溶液对其进行回湿处理，处理时间分别为 6、8、10、
12、14 h。整个试验为 3 因素、5 水平设计，采用 L25
(56)正交设计［11］进行因子水平安排。参照《国际种
子检验规程》规定。各试验 4 个重复，每重复 50 粒。
计算出种子的发芽率。
生理指标测定:电导率测定参照宋松泉等［12］的
方法，选取大小一致且无机械损伤的种子 20 粒，用
双蒸水冲洗数次，用滤纸吸干表面水分，分别装入试
管中，加入 10 mL双蒸水浸泡(25 ℃)8 h。然后，用
DDS－11A型电导仪测量电导率。以双蒸水为对照，
减去对照电导值，即为种子外渗液的电导值。脯氨
酸质量分数测定采用茚三酮比色法;丙二醛质量摩
尔浓度测定采用硫代巴比妥酸法［13］。
数据处理:结果为百分数的数据经平方根反正
弦变换，数据经单因素方差分析和 LSD多重比较。
2 结果与分析
2． 1 液氮保存对种子发芽率的影响
新采集的高山栲种子含水量为 43． 11%，发芽
率为 82． 73%。在常温下保存半年，全部丧失发芽
率，经冰箱 4 ℃保存半年的种子(CK)其发芽率为
19． 4%，而采用液氮保存结合 PEG 回湿处理的种子
发芽率最高可保持在 49． 31%。表明液氮保存结合
回湿处理可以有效地维持高山栲种子的发芽力。
2． 2 不同含水量种子的发芽率比较
新采集的种子发芽率为 82． 73%。从图 1 中可
以看出，高山栲种子发芽率对脱水很敏感，经脱水处
理的种子其发芽率有显著变化，如当种子含水量控
制在 25． 35%时，种子发芽率保持在 13% ～ 36%;当
种子含水量为 20． 36% 时，种子发芽率为 25% ～
48%;当种子含水量降至 5． 01% 时，发芽率不足
5%;含水量梯度中发芽率最高的是 20． 36%含水量，
显著高于其他种子含水量(P＜0． 05)。由此表明，液
氮保存高山栲种子较为适宜的含水量为 15% ～20%;
本研究中 20． 36%为脱水处理的最佳含水量。
2． 3 不同质量分数 PEG处理对种子发芽率的影响
不同质量分数 PEG 回湿处理对种子发芽率影
响显著(图 1A)。总体来看，发芽率随着 PEG 质量
分数的升高呈上升趋势，在种子含水量为 5． 01%
时，这种趋势不明显，随着含水量的升高，不同质量
分数 PEG对种子发芽率的影响越来越大。如当种
子含水量为 20． 36%时，不用 PEG 做回湿处理的种
子发芽率为 26． 14%，显著低于采用 20% PEG 回湿
处理的种子发芽率(48 ． 59%)。此外，10 ． 23%、
15． 40%、20． 36%和 25． 35% 4 个含水量梯度种子
用不同质量分数 PEG处理时，发芽率都呈现显著差
异(P＜0． 05) ，其中以 20% PEG处理效果最好。
2． 4 不同 PEG处理时间对种子发芽率的影响
经不同时间 PEG回湿处理，种子发芽率有显著
差异(P＜0． 05) (图 1B) ，随着 PEG 处理时间的增
加，种子发芽率呈单峰曲线变化。比如种子含水量
为 15． 40%时，当处理时间从 6 h 增加到 10 h 时，发
芽率从 36． 11%上升至 45． 28%，当 PEG 处理时间
超过 10 h，发芽率便会下降，处理 14 h 时，发芽率降
到 31． 5%。在 10． 23%、15． 40%、20． 36%和 25． 35%
4 个含水量梯度当中，PEG 回湿处理 10 h 的种子要
显著高于其他处理(P＜0． 05)。
A．不同质量分数 PEG处理对种子发芽率的影响;B．不同 PEG处理时间对种子发芽率的影响;同一种子含水量梯度不同底纹柱子上的不同小
写字母表示依据 LSD多重比较有显著差异(P＜0． 05) ，误差线代表标准差。
图 1 不同处理对种子发芽率的影响
7第 7 期 卢 玲等:高山栲种子的超低温保存
2． 5 液氮保存对种子电导率的影响
对照种子的电导率为 148． 17 μS·cm－1，从表 1
可以看出，经不同程度脱水后种子的电导率有很大
的变化，尤其是种子脱水至 10． 23%以下时，种子电
导率超过 276． 94 μS·cm－1，可见过度的脱水对种子
造成一定伤害，使其细胞膜透性增强，电导率相应上
升。其中含水量 5． 01%种子的电导率为 283． 36 μS·
cm－1，大约是对照的 2 倍，说明此脱水过程对其细胞
膜造成严重伤害。15． 40%和 20． 36%含水量种子
的电导率是 5 个含水量梯度中较低的(P＜0． 05) ，说
明此程度的脱水对细胞膜伤害较轻。种子电导率随
着 PEG 质量分数的增大而降低，其中经 15% 和
20% PEG质量分数处理的电导率较低。PEG 回湿
处理 6 ～ 10 h，种子电导率呈降低趋势，超过 10 h，
电导率显著上升;在处理 14 h 时，电导率剧增至
287． 35 μS·cm－1，这可能是由于 PEG 溶液中的水
分慢慢蒸发后，打破了种子细胞液与溶液之间水势
平衡，造成种子的再次失水。多重比较表明，用
PEG回湿处理 10 h的种子，其电导率显著低于其他
的处理时间。
表 1 不同液氮处理对种子生理指标的影响
各试验处理
各处理不
同水平
相对电导率 /
μS·cm－1
脯氨酸质量分
数 /μg·g－1
丙二醛质量摩尔
浓度 /nmol·g－1
种子含水量 5． 01% (283． 36±19． 13)a (10． 04±0． 82)a (42． 44±6． 13)a
10． 23% (276． 94±23． 16)a (27． 38±3． 16)a (35． 18±4． 06)a
15． 40% (112． 52±14． 57)c (48． 16±5． 05)c (26． 52±1． 75)c
20． 36% (106． 42±8． 15)c (52． 47±6． 13)c (23． 47±3． 37)c
25． 35% (159． 47±22． 17)b (35． 24±4． 09)b (40． 29±3． 29)b
PEG处理质量分数 0 (261． 31±31． 93)a (24． 80±2． 35)a (25． 04±3． 83)a
5% (242． 36±15． 34)a (38． 13±4． 07)a (25． 31±4． 05)a
10% (146． 94±7． 05)b (45． 61±7． 02)b (31． 74±4． 22)b
15% (114． 74±11． 46)b (55． 37±4． 61)b (36． 58±2． 27)b
20% (89． 71±6． 11)c (56． 37±3． 82)c (22． 66±1． 72)c
PEG处理时间 6h (166． 48±19． 13)b (32． 73±2． 15)a (33． 15±5． 65)b
8h (141． 37±16． 17)c (31． 29±3． 52)a (26． 93±1． 52)c
10h (128． 43±19． 13)d (34． 07±5． 72)b (19． 33±1． 58)d
12h (144． 65±22． 52)c (36． 12±1． 82)b (21． 05±1． 72)c
14h (287． 35±37． 27)a (28． 44±4． 31)a (35． 31±5． 11)a
注:表中数据为平均值±标准差;同一处理的不同水平经 LSD多重比较，在 0． 05 水平
有显著差异的用不同小写字母表示。
2． 6 液氮保存对种子脯氨酸质量分数的影响
对照种子的脯氨酸质量分数为 17． 64 μg·g－1
(表 1) ，经脱水处理后，除了 5． 01%含水量种子脯
氨酸质量分数下降之外，其他都有明显积累，以含水
量 15． 40% ～20． 36%种子积累较多，分别达到 48． 16、
52． 47 μg·g－1;各 PEG 质量分数中，以 20% PEG 回
湿处理后种子的脯氨酸质量分数最高。随着 PEG
处理时间的增多，种子中脯氨酸质量分数的积累存
在显著差异(P＜0． 05) ，并呈单峰曲线变化，峰值出
现在处理时间为 10 h。
2． 7 液氮保存对种子丙二醛质量摩尔浓度的影响
液氮保存后，种子中丙二醛质量摩尔浓度明显
增高，由表 1 可看出，5 个含水量梯度当中，5． 01%、
10． 23%、25． 35%含水量种子的丙二醛质量摩尔浓
度都高于对照(32． 54 nmol·g－1) ，极差达到 9． 90
nmol·g－1。不同脱水处理中，以 20． 36%含水量种
子丙二醛质量摩尔浓度最低;PEG 质量分数梯度
中，以 20%质量分数处理的种子的丙二醛质量摩尔
浓度最低;PEG处理时间梯度中，以 10 h 处理种子
的丙二醛质量摩尔浓度最低。这表明适宜的种子含
水量和 PEG处理有助于减轻膜脂过氧化的发生。
3 结论与讨论
超低温保存机理是利用低温把生物材料细胞内
的液态水除去后，细胞内的一切生命活动停滞，处于
“假死”状态，当恢复到常态时，便能保持正常细胞
的活性、形态发生潜能，而且不发生任何遗传变异，
从而达到长期保存的目的［14］。大量研究表明［15］:
材料适宜储藏的含水量、投入液氮前对材料的预处
理、液氮保存后材料的回湿处理是液氮保存的重要
环节。适宜的储藏含水量常因材料而异，如张志娥
等［16］将野生人参种子(Panax ginseng)的含水量自
然风干至 6% ～8%再进行超低温储藏，储后种子发
芽率达到原始种子的一半。刘燕等［17］对 47 种园林
花卉种子进行了超低温保存，结果自然含水量状态
下的种子经超低温保存后发芽率低于经脱水处理的
种子。李庆荣［14］对一些顽拗型种子脱水后进行超
低温保存，其发芽率要高于自然含水量的种子。本
研究中选取的 5 个含水量梯度中以 20%为最佳含
水量，这与郑郁善等［18－19］对壳斗科的板栗(Castanea
mollissima)、锥栗(C． henryi)种子的研究结果相似。
在一些相关报道中表明［18－23］，甘油、二甲亚砜、蔗糖
溶液、甘露醇、PEG、脱落酸等非渗透性物质常被用
来做冷冻保护剂，结果显示预处理对离体胚、茎尖、
花粉等材料作用明显。PEG 是一种较好的渗透调
节剂，可以修复细胞膜，减轻种子的吸胀损伤［19］。
本研究中从 5 个质量分数梯度和 5 个时间梯度中筛
选出 20%质量分数的 PEG回湿处理 10 h 效果为最
佳。综上所述，高山栲种子较为适宜的超低温储存
方法为:含水量 20%的种子于冰箱中 4 ℃预处理 1
h，投入液氮冷藏，常温解冻 15 min，之后用质量分数
20%的 PEG回湿处理 10 h。
电导率是细胞膜系统稳定性的指标。丙二醛是
膜脂过氧化的最终产物，是具有细胞毒性的物质，能
与膜结构上的蛋白质和酶结合、交联而(下转 14页)
8 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41 卷
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
(上接 8 页)使之失去活性，从而破坏酶结构并使质
膜透性加大［24－25］。脯氨酸通常可以作为一种渗透
调节剂、自由基清除剂或细胞质酶的保护性物
质［26－27］;在本研究中高山栲种子在经过脱水处理和
液氮处理后电导率明显增大，丙二醛质量摩尔浓度
升高，这标志着种子的细胞膜因失水、低温胁迫后受
到很大程度的伤害;经过不同的回湿处理，各种子脯
氨酸质量分数有明显积累，这表明适宜的回湿处理
有助于减轻膜脂过氧化。本试验为高山栲种子的长
期保存提供了一些参考，但试验中存在许多问题如
材料放入液氮时有种皮炸裂现象，储后种子发芽率
偏低以及材料的储藏机制有待于进一步研究。
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