全 文 ：皱盖假芝深层发酵液多糖提取工艺优化研究
王　谦1 , 靳发彬1 , 2 , 张俊刚1 , 李　志1 , 付　强1 , 卢　婕1
(1.河北大学 生命科学学院 , 河北 保定　071002;2.华北制药集团 新药研究开发有限责任公司 ,河北 石家庄　050015)
　　摘　要:研究了皱盖假芝深层液体发酵液多糖提取的工艺条件.用正交试验的方法对皱盖假芝深层液体
发酵液粗多糖提取工艺条件进行优化 ,研究了温度 、时间 、酸碱条件对其的影响.确定了皱盖假芝深层液体发
酵液粗多糖提取的最适条件为:温度 80 ℃,盐酸浓度 0.3 mol/L ,时间 2 h.
关键词:皱盖假芝;多糖;提取;正交试验
中图分类号:Q 936　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-1565(2005)04-0405-03
皱盖假芝(Amauroderma rude),别名皱盖乌芝 ,灵芝科假芝属真菌 ,分布于热带及亚热带地区如澳大利
亚 、南非等地 ,在我国主要分布于华南及西南地区如福建 、海南 、云南等省;子实体一年生[ 1] .子实体损伤伤
口处分泌血样液体 ,故又名血芝.近年来利用丰富的药用真菌宝库研发新药的工作日显重要与紧迫 ,且已有
多项成功[ 2] ,但研究皱盖假芝的液体培养条件并探究其多糖提取工艺的报道尚未见到.
1　材料与方法
1.1　供试菌株
皱盖假芝(Amauroderma rude)由河北大学食药用真菌研究所提供 , 4 ℃低温保存 , 6个月转管 1 次 ,
25 ℃放置 24 h活化.
1.2　培养基
1.2.1　PDA培养基[ 3]
1.2.2　液体种子培养基(g/ L)　MgSO4·7H2O 1.5 ,KH2PO4 2 ,CaCO3 1.5 ,酵母膏 3 ,葡萄糖 35 ,补水 ,除酵
母浸膏粉外其余均为分析纯 , pH 4.5 ～ 5 ,0.1 MPa灭菌 20 min[ 4-5] .
1.2.3　液体发酵培养基(g/ L)　玉米粉 10 ,豆饼粉 10 ,加水煮沸后 ,微沸 20 min ,纱布过滤 ,弃滤渣;在滤液
中加入 MgSO4·7H2O 1 , KH2PO4 1 ,酵母膏 2 ,葡萄糖 20 ,补水 ,pH 自然 ,0.1 MPa灭菌 20 min[ 4-5] .
1.3　液体培养
起始 pH 5.5 ,培养温度 28 ℃,摇床转速 180 r/ min ,摇瓶装量每 250 mL 摇瓶 100 mL.
1.4　多糖提取工艺研究
1.4.1　对照品溶液的制备　精密称取 105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品 125 mg ,置 250 mL 容量瓶
中 ,加入去离子水使溶解并稀释至刻度 ,摇匀即得.
1.4.2　测定波长的选择　取葡萄糖对照品溶液(10 mg/L)和皱盖假芝深层发酵液提取物溶液 ,经苯酚-浓
硫酸显色后 ,进行光谱扫描.对照品溶液与供试品溶液在(490±2)nm 处均有最大吸收峰 ,峰形一致 ,且不含
皱盖假芝深层发酵液提取物的空白对照无吸收 ,故可选择 490 nm作为样品测定的波长.
　收稿日期:2004-11-20
　基金项目:河北省生物工程重点学科资助项目
　作者简介:王　谦(1962-), 男 ,北京市人 , 河北大学研究员 ,主要从事食药用真菌方面的研究与开发工作.
第 25卷　第 4期
2005年　7月
河北大学学报(自然科学版)
Journal of Hebei Universi ty(Natural Science Edit ion)
Vol.25 No.4
Jul.2005
图 1 葡萄糖标准曲线
Fig.1　Standard curve of glucose
1.4.3　标准曲线的绘制 　精密吸取对照品溶液 100 ,
200 ,300 ,400 ,500 , 600 , 700 , 800 ,900 , 1 000 μL 分别置于
25 mL具塞试管中 , 依次加水至 2.0 mL , 摇匀 , 另取
2.0 mL水作空白对照 ,各管再加入体积分数为 5%的苯
酚试液1.0 mL ,摇匀 ,迅速滴加浓硫酸各 5.0 mL ,振荡
5 min ,冷至室温 ,照分光光度法在 490 nm 波长处分别测
定吸光度 ,标准曲线见图 1 ,吸光度为纵坐标 ,质量浓度为
横坐标.标准曲线方程为
　　　y =9.175 82 x +0.002 77.
1.4.4　皱盖假芝发酵液的处理　皱盖假芝发酵液经细
胞匀浆机粉碎匀浆处理备用.
1.4.5　皱盖假芝深层液体发酵液粗多糖的提取方法[ 6]
以正交试验的方法确定皱盖假芝深层液体发酵液粗多糖的提取方法.通过预备实验选择 3个主要因素:
温度(A)、酸碱条件(B)、时间(C),每个因素各取 3个水平(见表 1),采用 L9(34)正交表进行实验 ,以粗多糖
得率为考察指标(见表 2).
表 1　正交因素-水平设计表
Tab.1　Factor_level table of orthogonal test
水平 因素温度(A)/ ℃ 酸碱条件(B) 时间(C)/ h
水平 1 80 0 2
水平 2 90 0.3 mol/ L 盐酸 3
水平 3 (98±1) 0.5 mol/ L 氢氧化钠 4
表 2　正交试验结果
Tab.2　Results of orthogonal tests
试验号 因素
A B C 多糖提取率＊
1 1 1 1 f 1=0.450
2 1 2 2 f 2=0.452
3 1 3 3 f 3=0.338
4 2 1 2 f 4=0.187
5 2 2 3 f 5=0.332
6 2 3 1 f 6=0.268
7 3 1 3 f 7=0.195
8 3 2 1 f 8=0.359
9 3 3 2 f 9=0.261
K 1 Ⅰ 1=1.24 Ⅰ 2=0.832 Ⅰ 3=1.077
K 2 Ⅱ 1=0.787 Ⅱ 2=1.143 Ⅱ 3=0.9
K 3 Ⅲ 1=0.815 Ⅲ 2=0.867 Ⅲ 3=0.865
R T 1=0.453 T 2=0.311 T 3=0.212
　　　＊每升发酵液中多糖的克数
1.4.6　酚-硫酸法测定多糖含量[ 7]
·406· 河北大学学报(自然科学版) 2005 年
1.4.7　最佳工艺的验证
由表 2可知 ,因素 A对结果有显著性影响 ,其次为因素 B和 C ,本实验的最佳工艺条件为 A1B2C1.取 3
份皱盖假芝发酵液 ,分别按最佳工艺条件提取 ,以粗多糖得率为考察指标 ,结果如表 3.
表 3　多糖提取最佳工艺的验证结果
Tab.3　Rresults of amylose abstract under optimized technics
编号 多糖提取率 平均多糖提取率
1 0.497
2 0.508 0.512
3 0.531
2　结果与分析
从表 3的结果可以得出 ,影响皱盖假芝粗多糖提取率的主次因素顺序依次是 A(温度)>B(酸碱条件)>
C(提取时间).从正交试验结果和极差分析可知 ,提取皱盖假芝粗多糖的最优组合为 A1B2C1 ,即温度80 ℃,
盐酸浓度 0.3 mol/ L ,时间 2 h.温度是皱盖假芝深层发酵液多糖提取的主要影响因素 ,其次是酸碱条件和提
取时间.由表 4可知 ,按照正交试验所优选而得的最佳工艺进行提取试验 , 3次结果的多糖提取率均处于较
高水平 ,这说明该最佳工艺是稳定可行的.
3　结论
实验结果得出皱盖假芝粗多糖最佳提取工艺为A1B2C1 ,即温度80 ℃,盐酸浓度 0.3 mol/L ,时间 2 h.从
深层液体发酵液中得到的皱盖假芝粗多糖具有抗衰老 、增强抵抗力的作用 ,如果将其研制成不同系列保健产
品 ,可为人民群众的生活健康做出巨大贡献 ,为企业创造巨大的利润 ,故本项目具有较大的应用前景.
参　考　文　献:
[ 1] 赵继鼎 , 张小青.中国真菌志:18 卷[ M] .北京:科学出版社 , 2000.1-204.
[ 2] 徐锦堂.中国药用真菌学[ M] .北京:中国医科大学出版社 , 1997.1-836.
[ 3] 林树钱.中国药用菌生产与产品开发[ M] .北京:中国农业出版社 , 2000.1-450.
[ 4] 王　谦 , 闫蕾蕾 ,王永利 , 等.金顶侧耳的深层液体培养及相关检测[ J] .菌物系统 , 2002 , 21(1):102-106.
[ 5] 王　谦 , 冀　宏 ,汪　虹 , 等.灵芝营养液的发酵法制备及分析[ J] .河北大学学报(自然科学版), 1999 , 19(1):50-52.
[ 6] 高观世 , 郑跃玲.影响金耳多糖提取率因素的正交试验[ J] .中国食用菌 , 2001 , 20(4):41-43.
[ 7] 鲁晓岩.硫酸苯酚法测定北冬虫夏草多糖含量[ J] .食品工业科技 , 2002 , 23(4):69-70.
Submerged Culture of Amauroderma rude and Optimum Extraction
Process of It s Polysaccharide
WANGQian1 , JIN Fa-bin1 ,2 , ZHANG Jun_gang1 ,LI Zhi1 ,FU Qiang1 ,LU Jie1
(1.College of Life Sciences , Hebei University , Baoding 071002 ,China;
2.New Drug Research and Developmental Center , North China Pharmaceutical Co., Shijiazhuang 050015 , China)
Abstract:The polysaccharide ex tracting of Submerged culture of Amauroderma rude was studied.And the
process of poly saccharide ext ract ing of Amauroderma rude was optimized by orthogonal design based on three
factors temperature , time and pH.The opt imum polysaccharide ext racting condition:temperature 80 ℃, add HCl
to 0.3 mol/L , time 2 h.
Key words:Amauroderma rude;poly saccharide;ext racting;o rthogonal design (责任编辑:赵藏赏)
·407·第 4 期 王　谦等:皱盖假芝深层发酵液多糖提取工艺优化研究