全 文 ：第 35 卷第 4 期
2011 年 4 月
水 产 学 报
JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
Vol． 35，No． 4
Apr．，2011
文章编号:1000 － 0615(2011)04 － 0551 － 08 DOI:10． 3724 /SP． J． 1231． 2011． 17238
收稿日期:2010 12 02 修回日期:2011 02 01
资助项目:广东省科技计划项目(2008B022900012)
通讯作者:马家海，E-mail:mjh25@ sh163． net
宽礁膜原生质体的分化与发育
谢恩义1， 花卫华2， 马家海3*
(1．广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088;
2．江苏省水产技术推广站，江苏 南京 210036;
3．上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)
摘要:为缩短传统育苗时间，开发室内种质保存技术，满足大规模栽培苗种需求，实验用 4%的
果胶酶和 2%纤维素酶混合，将来自于不同月份和不同藻体部位的宽礁膜切段，分别在相同条
件下解离成原生质体，详细研究了这些不同部位和不同生长时期细胞的再生、分化和发育途
径。根据体细胞后代的外形、有无假根、有无公共膜、细胞大小和排列方式，以及它们最终的发
育分化趋势，将宽礁膜原生质体发育方式分为 8 种结果，既可形成体细胞，也可形成生殖细胞。
形成体细胞的发育途径又分 3 种类型 7 种结果，即细胞团、畸形苗和正常苗 3 种类型，其中发
育成细胞团的类型又分为规则细胞团和不规则细胞团 2 种结果，发育成畸形苗的类型又分为
假根为主的畸形苗、有类假根的畸形苗、无假根的畸形苗和管状畸形苗 4 种结果。各种发育类
型与藻体的日龄、大小及部位有关，其原生质体直接发育形成正常形态藻体的发育方式只是 8
种发育结果的一种。
关键词:宽礁膜;酶制剂;原生质体分离;分化;发育
中图分类号:Q 942． 5;S 917 文献标识码:A
据作者不完全数据统计，到目前为止，全世界
至少已经报道了 89 种海藻原生质体的分离和培
养工作，包括海带(Laminaria japonica)、裙带菜
(Undaria pinnatifida)、巨藻(Macrocystis pyrifera)
和江蓠(Gracilaria lemaneiformis)等，其中绿藻不
少于 16 种，部分种类已经再生出完整植株［1 － 9］。
对石莼目藻类原生质体分离与培养已有不少种
类，如 裂 片 石 莼 (Ulva fasciata)、缘 管 浒 苔
(Enteromorpha linza)、浒苔(E． prolifera)、肠浒苔
(E． intestinalis)、扁浒苔(E． compressa)等［1 － 2，5 － 9］。
有关礁膜属原生质体的研究多集中在原生质体的
培养与再生成株，而对其分化发育途径的系统观
察研 究 较 少，如 张 大 力［2］ 分 离 出 袋 礁 膜
(Monostroma angicava)的原生质体，经培养只形
成管状幼苗，而不形成正常植株;SAGA 等［10］分
离培养了袋礁膜的原生质体，但不进一步分化;
CHEN［11 － 12］分离到宽礁膜(M． latissimum)的原生
质体，并对来自不同藻体部位的原生质体进行了
发育途径的初步研究，得到细胞团、管状体和丝状
体 3 种发育类型，原生质体没有直接发育成正常
形态的植株。KITO 等［13］ 研 究了礁膜 (M．
nitidum)与条斑紫菜(Porphyra yezoensis)的细胞质
融合及杂种的生长。KRISHNA 等［14］用 3%纤维
素酶解离尖种礁膜(M． oxyspermum) ，并对所得原
生质体的发育分化进行了培养观察，发现有两种
发育类型:一种是先形成孢子囊，孢子囊成熟后放
散具有两鞭毛的游孢子，游孢子固着并发育形成
正常藻体;另一种是原生质体经多次细胞分裂，形
成不具假根的叶状体。UPPALAPATI［8］对礁膜和
尖种礁膜进行了酶解实验，发现原生质体产率达
9． 6 × 106 ～ 10． 2 × 106 ind /g鲜藻，再生率为 90%，
但实验中未提出是否能再生成苗。谢恩义等［15］
对礁膜原生质体的分离及培养进行了报道，观察
到原生质体的 3 种发育方式。
水 产 学 报 35 卷
宽礁膜隶属于绿藻门(Chlorophyta)、石莼目
(Ulvales)、礁膜科 (Monostromaceae)、礁膜属
(Monostroma)。在绿藻中宽礁膜是食用价值较高
的一种，具有较大栽培前景［16 － 17］。谢恩义等［17］
报道了宽礁膜的人工育苗与栽培，但传统的采苗
方法耗时长，苗种培育受杂藻影响较大，难以在室
内保存，且易发生病害。近年来发展起来的海藻
原生质体分离与培养技术有助于这些问题的解
决。国内学者已对紫菜体细胞育苗技术进行了生
产性应用试验，结果表明，将细胞技术运用于紫菜
生产，完全可行，其前景十分广阔［18 － 19］。本文旨
在为宽礁膜的快速育苗提供一个新的途径，利用
无性繁殖，缩短传统育苗周期，并使宽礁膜人工栽
培种子化，为大规模栽培宽礁膜随时提供栽培种
苗。另外，研究宽礁膜原生质体的发育分化，对开
展原生质体培养、融合、基因转化等具有一定的理
论意义，也为绿藻门其它种类原生质体研究提供
借鉴。
1 材料与方法
1． 1 材料
实验用宽礁膜酶解材料是 2008 年 10 月、11
月和 2009 年 1 月采自广东省硇洲岛大浪海区的
1 ～ 3 cm的幼嫩藻体，用内放冰袋的保温瓶或泡
沫箱当日带回实验室。
1． 2 方法
藻体的预处理 挑选正常健康的藻体，在
过滤海水中用毛笔轻轻地反复洗刷藻体正反面多
次，去除其表面的杂藻和附泥，清洗干净后培养瓶
中充气培养，培养液为盐度 22． 2 ～ 26． 1 且内含氮
磷比为 10 × 10 －6 ∶ 1 × 10 －6营养盐的无菌海水，培
养瓶置于光照培养箱内，设定光照强度 16 ～ 48
μmol /(m2·s) ，光周期 12L ∶ 12D，温度 10 ℃左
右，充气培养 4 ～ 5 d。4 ～ 5 d 后挑选长势较好的
藻体放入含有 10 mL 混合抗生素液(1 g 氨苄青
霉素，1 g卡那霉素，25 mg制霉菌素和 0． 2 g新霉
素溶于 100 mL双蒸水中)的 100 mL 的灭菌海水
培养液中相同条件下继续培养 24 h，然后进行酶
解实验。酶解前培养藻体黑暗一昼夜，以减少细
胞壁物质的合成积累，使酶解更加容易，获得更多
的酶解细胞。
酶液的制备 酶液制备基于谢恩义等［15］
的方法并稍加改进，具体为 4%果胶酶，2%纤维
素酶，40 mmol /L CaCl2，0． 7 mol /L 甘露醇，pH 6．
0。首先量取 30 mL 盐度为 22． 2 的消毒海水，加
入重蒸水 20 mL，称取 2 g 果胶酶、1 g 纤维素酶、
0． 222 g CaCl2、10． 930 2 g 甘露醇溶解其中，用
1%稀盐酸调节 pH 到 6． 0(温度 12 ℃)。随后酶
液用冷冻离心机(0 ～ 3 ℃)6 000 r /min 离心 10
min，取上清液装在棕色试剂瓶中，保存于 － 20 ℃
的冰箱内待用。
原生质体的分离 取生长较好并预处理过
的无菌藻体投入紫外光消毒过的组织捣碎机中捣
碎。消毒无菌海水清洗捣碎组织数次后，用消毒
60 网目筛绢过滤去除切碎的细胞质。将所滤得
的组织块收集，放入离心管中，加入酶液，放入摇
床中 80 ～ 100 r /min酶解 3 h，酶解温度为 24 ℃，
此原生质体的分离过程在黑暗中进行，以促使藻
体细胞壁易于破裂，使原生质体酶解出来。酶解
结束后，将含有原生质体的酶解液用消毒 60 网目
筛绢过滤以去除未酶解的组织块。将所得过滤液
以 800 ～ 1 000 r /min离心 5 min后，倒去 3 /4 上悬
液，以盐度为 39． 2 相同体积的过滤消毒海水补
充，此过程重复 3 次，以消弱酶液中酶和酶溶剂的
影响。
原生质体的鉴定 把原生质体放入低渗
溶液中，显微镜下观察原生质体在低渗溶液中
吸水涨破的过程，如果是真正的原生质体，在胀
破后，其残迹消失。有活力的原生质体的鉴定
可由室内培养原生质体时实际的分裂再生情况
决定。
原生质体的培养 将纯化的原生质体少许
悬浮液，约含 8． 0 × 104个原生质体，直接加入含
10 mL盐度为 39． 2 的消毒过滤海水的培养皿中，
或先滴于培养皿中的载玻片上，静置 2 ～ 4 h，原生
质体即可附着，然后向培养皿中加入 10 mL 盐度
为 39． 2 的高渗海水。先进行 24 h 的黑暗或弱光
培养，初期培养置于散光灯下，光照强度控制在
6． 4 ～ 24 μmol /(m2·s) ，形成细胞壁后增强为 32
μmol /(m2·s)以上，并将培养液盐度逐步调整至
22． 2 ～ 26． 1。培养箱的温度设置为 10 ℃，光周期
为 12L∶ 12D。每隔 7 天更换培养液一次。在整个
静置培养过程中，每天以光学显微镜观察记录具
活性的原生质体生长发育情况，并拍摄照片，在培
养后的第 3 天和第 7 天随机取 10 个显微视野统
计原生质体的存活率。
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4 期 谢恩义，等:宽礁膜原生质体的分化与发育
2 结果
2． 1 宽礁膜原生质体的发育类型
宽礁膜藻体绿色，细胞表面观多角形、方形或
椭圆形(图版-1)。1． 0 g 湿重宽礁膜可获原生质
体(12． 3 ～ 25． 8)× 106个，而刚酶解所得的原生质
体(图版-2)呈圆形或椭圆形，大小为(10 ～ 10． 5)
μm ×(10 ～ 12． 5)μm，黄绿色块状的叶绿体位于
原生质体一侧，占据整个原生质体的大部分体积。
将这些原生质体放入低渗溶液中，由于渗透压失
衡，大部分胀破，并且其痕迹消失。大部分原生质
体高渗溶液中培养 24 h 后，长出新的细胞壁。统
计培养的原生质体第 3 天的存活率为 92． 7%，第
7 天为 87． 6%。根据体细胞后代的外形、有无假
根、有无公共膜、细胞大小和排列方式，以及它们
最终的发育分化趋势，可将原生质体发育方式分
为 8 种结果，既可形成体细胞，也可形成生殖细
胞。形成体细胞的发育途径又分 3 种类型 7 种结
果，即细胞团、畸形苗和正常苗 3 种类型，其中发
育成细胞团的类型又分为规则细胞团和不规则细
胞团 2 种结果，发育成畸形苗的类型又分为假根
为主的畸形苗(假根丝细胞)、类假根畸形苗、无
假根畸形苗和管状畸形苗 4 种结果。
第一种发育结果是形成生殖细胞(图版-3 ～
8)。经过 12 d培养，一部分原生质体经过规则有
序分裂后，先出现颗粒化，并逐步形成细胞壁，发
育成配子囊(图版-3)。配子囊成熟放散时，囊壁
变薄，透明状，囊内配子不停运动，当透明囊壁溶
解破裂后，配子(梨形，体前端具 2 根等长鞭毛)
即放散出来(图版-4)。放散后，配子囊消失，没有
留下空壳的痕迹。刚放散的配子活力强，3 ～ 4 h
后，大部分直接或接合为合子固着于培养皿底，不
久即变为圆球形(图版-5)。20 d 后，固着的圆形
配子或合子进一步发育成孢子囊(图版-6)。孢子
囊直径为 35 ～ 55 μm，囊内呈明显的颗粒状，具有
较厚的细胞壁。孢子囊能以二分裂进行增殖，使
孢子囊密度加大。孢子囊成熟后可放散出 16 ～
32 个四鞭毛的游孢子(图版-7) ，把游孢子附于筛
绢上充气培养，则可发育成正常形态的叶状体
(图版-8)。这种发育途径在室内短期完成了宽礁
膜生活史中从孢子体发育至配子体的异型世代交
替的生活史过程，所得原生质体又来源于培养的
单株藻体，在遗传育种上有应用价值。
第二种发育成不规则细胞团(图版-9)。经过
22 d培养，原生质体细胞形成表面凹凸不平的单
层组织块。细胞大小与正常苗的细胞相同，但排
列不紧密，形状一般为圆形或椭圆形，细胞有两两
成对现象，无公共膜，无假根。组织块继续发育到
2 ～ 3 mm肉眼可见后，就不再继续生长发育。将
其转入充气瓶内继续充气培养 10 d 后，其生长状
况与静置培养结果一样，无明显改变。
第三种发育成规则细胞团(图版-10)。细胞
团成圆形或卵圆形，一般分裂至 8 ～ 32 个细胞就
停止分裂。单个细胞较大，约 1． 5 倍于正常叶状
体，呈多边形、长卵圆形或长方形，有两两成对现
象，单层，排列紧密，有明显的公共膜。这类细胞
团继续培养不再分化成正常幼苗。
第四种发育成假根为主的畸形苗(图版-11)。
这种细胞刚萌发时，多数呈蝌蚪形，通过培养发
现，较细的一端会不断拉长，形成细长的根丝，其
中一部分出现分叉现象。这种假根丝细胞的假根
丝部分具有较厚的细胞壁，内含物的颜色呈淡绿
色;较粗的单细胞一端大部分不会进一步分裂，始
终处在一个单细胞状态，即根丝细胞状态，其中少
部分有一分为二的迹象，并进一步分裂分化，形成
畸形苗，具多细胞的叶片和一个假根。这些畸形
苗继续培养，不形成肉眼可见的正常形态，也不
成熟。
第五种发育成无假根畸形苗(图版-12)。培
养的原生质体第 4 ～ 6 天进行第一次分裂，为均等
分裂。继续培养，细胞进一步分裂分化，20 d左右
形成 8 ～ 16 个细胞，这些个体边缘较光滑，内部细
胞排列规则，呈平面分布，60 d 时发育成 40 个细
胞左右的叶状体。这种叶状体与自然生长状态下
的宽礁膜藻体叶片特征相似，细胞排列紧密，有公
共胶质膜，但无固着器，也无细胞分化出固着器的
迹象。部分叶状体有多个叶片现象，这些叶状体
的营养细胞是否能发育成配子囊，并放散配子，乃
至形成孢子囊，放散游孢子，发育成正常配子体，
还需以后实验观察验证。
第六种发育成类假根畸形苗(图版-13)。原
生质体先发育成有公共胶质膜的组织块，组织块
的外形、颜色、细胞大小和排列方式及色素体的形
状与正常叶状体相同，然后组织块基部个别含色
素体的细胞呈乳头状突起，构成类假根，这种类假
根大部分较短，不分枝，继续培养，不会再分化出
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水 产 学 报 35 卷
真正的假根。类假根畸形苗继续培养，一直保持
原状，不会转化成正常叶状体。
第七种发育成管状畸形苗(图版-14 ～ 15)。
原生质体形成的细胞先行有丝分裂，形成细胞排
列紧密的细胞团，然后细胞团里的一部分细胞发
育成由许多根丝细胞组成的假根(图版-14) ，另一
部分则发育成管状体(图版-15)。部分管状体分
叉形成多个分枝，每个分枝由多列细胞形成，细胞
排列紧密，边缘凹凸不平。
第八种发育成正常的叶状体(图版-16 ～ 20)。
在这个发育结果中，原生质体的第一次分裂出现
在开始培养后的第 7 ～ 10 天，从一端以出芽方式
开始萌发，为不均等分裂(图版-16) ，且分裂前，细
胞中的色素体会由块状变为环状，并紧贴细胞膜。
分裂形成的两个细胞，表现出极性(图版-17) ，即
一子细胞拉长变细，形成较短的根丝，将来发育为
假根，另一子细胞也拉长，但不变细，继续分裂分
化，最终发育成叶状体(图版-18 ～ 19)。经过将近
3 个月的培养，形成肉眼可见的具有成体植株特
征的正常叶状体(图版-20)。
2． 2 宽礁膜原生质体发育分化与藻体采集时间、
大小和不同部位的关系
藻体中去分化细胞的多少主要取决于藻体的
日龄、大小以及取材部位等因素，一般认为日龄
小、尺寸小的藻体所含的去分化细胞较多，用酶法
制作原生质体所用的藻体材料生长日龄较小为
好。在相同的酶解和培养条件下，宽礁膜原生质
体发育分化结果与藻体采集时间、大小和不同部
位的关系如表 1。从表 1 可知:采自 1 月较大藻
体(长 ＞ 3 cm)顶端正在发育成配子囊的藻体细
胞制得的原生质体多发育成生殖细胞，即配子囊。
采自 11 月的宽礁膜藻体个体较小(长 1 ～ 3 cm) ，
藻体中所含的去分化细胞较少，细胞的分化也在
迅速进行，导致酶解所得的原生质体发育成细胞
团和畸形苗的较多。而采自于 10 月的藻体(1 cm
左右) ，经酶解而来的原生质体直接发育成具有
成体植株特征的个体较多。
采用 1 月采集的 3 cm左右的藻体，从基部依
次取 0 ～ 1 cm，1 ～ 3 cm 的两组切段，分开酶解并
培养。两个月后观察发现，0 ～ 1 cm 切段组酶解
出的原生质体发育方式较多，8 种结果都有观察
到，以假根为主的畸形苗较多;而 1 ～ 3 cm切段组
酶解出的原生质体多发育形成配子囊，成熟的配
子囊放散配子。配子固着后，最终形成孢子囊，成
熟并放散游孢子，游孢子再发育成苗，即第一种发
育方式。
同一培养条件下，来自 1 月同一藻体的不同
部位的原生质体表现出不同的发育方式。基部固
着器的假根丝细胞酶解的原生质体只能发育成假
根丝细胞。处于藻体边缘部位的叶状体营养细胞
酶解的原生质体大多发育成配子囊，并可成熟放
散配子，以后经孢子囊的发育途径进行分化发育。
处于藻体中心部位的叶状体营养细胞酶解的原生
质体发育方式较多，细胞团、类假根的畸形苗、无
假根的畸形苗、管状畸形苗、管状苗和正常苗等都
可观察到。
表 1 宽礁膜原生质体发育分化与藻体采集时间、大小和不同部位的关系
Tab． 1 Developmental patterns of protoplasts related to the growth period，size and
original location of the thalli from which the protoplasts were isolated
发育方式
developmental pathway
采集时间 sampling time
Oct． Nov． Jan．
藻体大小(cm)size
0 ～1 1 ～3 ＞3
藻体切段部位 location of the tissue
0 ～1 cm(基部)1 ～3 cm(末端)
配子囊 + + + + + + + + +
规则细胞团 regular cell mass + + + + + + + + + +
不规则细胞团 irregular cell mass + + + + + + + + + +
假根为主的畸形苗 rhizoidal abnormal seedling + + + + + + + +
无假根畸形苗
rhizoid-deficient adnormal seedling
+ + + + + + + +
类假根畸形苗 rhizoid-like abnormal seedling + + + + + + + +
管状畸形苗 tubular abnormal seedling + + + + + + + + + +
正常苗 normal seedling + + + + + + + + + +
注:+ +代表所占比例较大，+代表观察到，但比例较小。
Notes:+ + indicated a certain developmental pattern of protoplasts occupied greater proportion，+ meant this pattern could be observed，but
occupied smaller proportion．
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4 期 谢恩义，等:宽礁膜原生质体的分化与发育
3 讨论
3． 1 原生质体的发育方式
本实验已初步得出，宽礁膜原生质体发育具
有 8 种方式。原生质体这种多样化的发育方式，
主要与酶解材料采集的时间、大小、部位等发育状
态不同引起的生理、生化和细胞分化调控物质不
同有关，另外受酶解和培养条件的影响，如光照、
营养盐和温度等［20 － 22］。原生质体的发育调控机
理复杂，未知的内因和外因影响因子多，调控原生
质体发育的研究具有理论和应用价值，是今后需
要深入研究的课题。宽礁膜叶状体中细胞具有二
大类分化类型，即体细胞和生殖细胞，体细胞又可
分为营养细胞和根丝细胞。本实验 11 月份藻体
酶解所得的原生质体培养多发育为细胞团，这可
能与藻体细胞处于旺盛的分裂生长期有关。1 月
份材料酶解所得的原生质体多发育形成配子囊，
这可能与藻体细胞正在发育为配子囊，酶解的原
生质体就朝着配子囊发育。同时发现原生质体培
养中加大光照强度、提高培养温度和营养盐充足
的条件下，多发育为配子囊，这与高温和高光照强
度等条件下叶片细胞易成熟有关。宽礁膜的不同
发育形式，可能和酶解的体细胞原先在组织中的
位置(假根丝细胞或营养细胞等)、发育阶段(营
养细胞或生殖细胞等)、培养条件(温度、光照等)
以及培养环境中的某些未知因素有关。
在已知的宽礁膜生活史中，并不包含管状体
这一阶段，本实验发现宽礁膜原生质体发育成管
状苗，CHEN等［12］报道宽礁膜原生质体形成的管
状苗继续培养可发育成叶状体，这种发育方式是
否说明浒苔、石莼、礁膜 3 个属之间存在一定的进
化演化关系，HILLARY 等［23］也用充分的证据证
明石莼属和浒苔属不是截然不同的属。
戴继勋等［24］、严兴洪等［20］、何培民等［25］对紫
菜体细胞的发育方式进行的研究结果与本实验所
得宽礁膜原生质体发育方式有许多相似之处。虽
然紫菜与宽礁膜分属不同的门，在遗传学上差距
甚大，但是细胞全能性分化发育为何如此相似，这
还有待于进一步研究。
3． 2 原生质体培养应用
体细胞发育方式的系统研究，是经济海藻体
细胞育苗的前提条件，在基础理论研究和应用研
究中都有价值，目前紫菜离体单细胞育苗在生产
上已有应用。因为大型海藻的传统育苗时间长，
幼苗培育中受杂藻和病害影响大，如果发展获得
大量有活性和高再生率的原生质体附于尼龙绳等
附着基上培育成苗，有望取代传统的采孢子附苗。
利用植物细胞全能性的原理，将植物体细胞解离
后，直接发育成幼苗，以此作为苗种的来源，这在
一些高等植物、大部分单细胞藻类和少数大型海
藻中已成为现实［8，19，21，26 － 27］。国内外学者在大型
海藻方面做了多次尝试，并有所积累［2，8，10 － 15］。
KRISHNA 等［9］和 REDDY 等［14］先后报道了尖种
礁膜原生质体的培养成苗，后者还获得了原生质
体粘附于尼龙绳发育成高密度的幼苗，CHEN
等［12］报道宽礁膜原生质体首先发育形成细胞团，
部分细胞团再继续长出管状藻体，再由管状体发
育出叶状体。就本实验而言，主要是探明了宽礁
膜原生质体的发育方式，为利用原生质体育苗应
用于生产奠定理论基础。形成正常幼苗的发育形
式对生产育苗最为直接、有利，形成配子囊再经配
子或游孢子发育成正常叶状体的发育方式，在单
性生殖和育种研究上有一定价值;形成细胞团和
畸形苗的发育方式应加以抑制或诱导转化。只有
对体细胞的发育方式进行全面的认识后，我们才
能从中筛选出体细胞育苗的最佳生产条件，趋利
避害，有效地指导实际生产。本实验以后要着重
完善材料日龄、温度和营养盐等内外因素对原生
质体发育影响的研究，特别是原生质体发育机制
的研究，为以后生产应用打下理论基础。因为还
有许多基础理论问题没有解决，原生质体育苗迟
迟不能在生产上应用推广，因而受到有些学者质
疑，但要实现海藻种苗“种子化”，原生质体的研
究仍是今后需要深入研究的课题，有较大研究空
间，并具有较好的应用发展前景。
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4 期 谢恩义，等:宽礁膜原生质体的分化与发育
Differentiation and development of protoplasts of Monostroma latissimum
XIE En-yi1，HUA Wei-hua2，MA Jia-hai3*
(1． Fisheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China;
2． Jiangsu Provincial Aquatic Technology Extension Station，Nanjing 210036，China;
3． College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)
Abstract:Monostroma latissimum is one edible Chlorophyta species，and is a potential new species for
economic seaweed cultivation by fishermen in China，for viable protoplasts could be potentially used as a source
for seed material of macrophytic marine algae cultivation and for other applied phycological research，so the aim
of this study was to develop a new breeding method by culturing the protoplasts of M． latissimum，to form
seedlings quickly，to shorten the traditional period of germlings cultivation，to maintain a stock of seedlings in
the laboratory for longer periods，and to provide abundant germlings for large-scale commercial cultivation．
Protoplasts were isolated respectively from different parts of the thalli of M． latissimum which are collected at
different time by enzymatic method (optimal enzyme composition consisted of 4% pectinase and 2%
cellulase)． And the regeneration，differentiation and development pathway of different derived protoplasts are
studied under uniform conditions of isolation and incubation． According to the cell morphology，such as the
formation of rhizoids，whether having hyaline sheath，or the size and arrangement ways of the cell，and the
eventual development and differentiation trend，the protoplast development can be divided into eight results，
include forming somatic cells and reproductive cells． The somatic cells formation can be classified into cell
mass which includes regular or irregular cell mass;abnormal seedlings which include rhizoidal，rhizoidal-like，
no rhizoidal and tubular abnormal seedlings;normal seedlings，3 types，7 results． The reproductive cells
formation developed into gametangia firstly，and then developed into sporangia． Each development pathway is
associated with age，size and location of algae． This is the first time to report that some protoplasts underwent
repeated cell divisions and developed directly into thalli similar to the parent thalli，and the application and
expectations of protoplast culture were also discussed．
Key words:Monostroma latissimum;enzyme preparation;protoplast isolation;differentiation;development
Corresponding author:MA Jia-hai． E-mail:mjh25@ sh163． net
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水 产 学 报 35 卷
图版 宽礁膜原生质体的发育方式
1．宽礁膜配子体中部细胞表面观，× 500;2．刚分离的原生质体，× 400;3．配子囊，× 200;4．配子，× 400;5．固着的合子，× 200;6．
孢子囊，× 200;7．游孢子，× 100;8．幼苗，× 40;9．不规则细胞团，× 100;10．规则细胞团，× 400;11．假根丝细胞，× 200;12．无假
根畸形苗，× 400;13．类假根畸形苗，× 400(标尺 600 μm) ;14． 管状苗的假根，× 400;15． 管状苗，× 200;16． 原生质体萌发，×
400;17．酶解原生质体萌发出假根，× 200;18．分裂中的细胞苗，× 400(标尺 600 μm) ;19．具发达假根的细胞苗，× 200(标尺 600
μm) ;20．带假根的幼苗，× 20。
Plate Development of protoplasts of M． latissimum
1． Surface view of the middle part of gametophyte of Monostroma latissimum，× 500;2． Protoplasts just isolated，× 400;3． Gametangia，×
200;4． Gametes，× 400;5． Settled zygotes，× 200;6． Zoosporangia，× 200;7． Zoospores，× 100;8． A juvenile thallus，× 40;9． A kind of
tissue，× 100;10． Cell clusters，× 400;11． Rhizoidal cells，× 200;12． A thallus with leaves，× 400;13． Abnormal germlings，× 400(scale
bar 600 μm) ;14． Rhizoids of a tubular thallus，× 400;15． A tubular thallus，× 200;16． Germination of somatic cell developed from
protoplast，× 400;17． A rhizoidal cell germinating from a somatic cell，× 200;18． Celluar germling dividing，× 400(scale bar 600 μm) ;19．
Celluar germling with rhizoids，× 200(scale bar 600 μm) ;20． A juvenile thallus with rhizoids，× 20．
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