全 文 ：第 27卷第 9期
2007年 9月
环　境　科　学　学　报
　ActaScientiaeCircumstantiae
Vol.27, No.9
Sep., 2007
基金项目:安徽省自然科学基金研究项目(No.070413132);安徽省教育厅自然科学研究项目(2006KJ162B);安徽大学 211工程学术创新团队
基金(No.02203109);安徽大学研究生创新计划项目
SupportedbytheNaturalScienceResearchProgrameofAnhuiProvince(No.070413132), theNaturalScienceResearchProgrameoftheEducational
OfficeofAnhuiProvince(No.2006KJ162B), theInnovativeResearchTeamof211 ProjectinAnhuiUniversity(No.02203109), andtheGraduate
StudentInnovativeProjectofAnhuiUniversity
作者简介:唐文忠(1982—),男 ,硕士研究生 , E-mail:twz36910010@ah163.com;＊通讯作者(责任作者), E-mail:jiarong@ah163.com
Biography:TANGWenzhong(1982—), male, E-mail:twz36910010@ah163.com;＊Correspondingauthor, E-mail:jiarong@ah163.com
唐文忠 ,荚荣 ,张良璞 ,等.2007.裂褶菌 F17对偶氮染料刚果红的脱色降解及其产物分析[ J] .环境科学学报 , 27(9):1451-1457
TangWZ, JiaR, ZhangLP, etal.2007.DecolorizationanddegradationofCongoRedbySchizophyllumsp.F17 andcataboliteanalysis[ J].Acta
ScientiaeCircumstantiae, 27(9):1451-1457
裂褶菌 F17对偶氮染料刚果红的脱色降解及其产物分
析
唐文忠 1 ,荚荣 1, ＊ ,张良璞 2 ,郑志侠3 ,程晓滨1 ,李旭东 1
1.安徽大学生命科学学院 ,安徽省生态工程与生物技术重点实验室 ,合肥 230039
2.合肥市环境监测中心站 , 合肥 230031
3.安徽省环境科学研究院 , 安徽省污水处理技术重点实验室 , 合肥 230061
收稿日期:2006-08-29　　　修回日期:2007-03-22　　　录用日期:2007-05-09
摘要:利用本实验室新构建的染料脱色降解体系 ,对裂褶菌 F17(Schizophyllumsp.F17)脱色降解刚果红进行了研究 ,分析了该菌的主要降解
酶 ,并对刚果红降解产物进行分离和鉴定.结果表明 ,裂褶菌 F17在此体系中对刚果红表现出较高的脱色降解能力 ,菌球加入 48h后脱色率达
到 91.5%;酶活检测表明 ,该菌主要产生锰过氧化物酶(MnP),并在脱色 48h时 , MnP酶活达到最大值 96.1U·L-1.此外 ,对脱色 96h和 192h后
的脱色液进行紫外-可见扫描 ,发现刚果红在可见光区 495nm处的吸收峰已消失 ,并在紫外区出现多个吸收峰.通过高效液相色谱分离得到 1
种刚果红降解产物 ,用质谱和傅立叶红外光谱鉴定 ,发现该产物相对分子量为 184.2,主要官能团为 —C6H4— 和芳基—NH2 ,结合刚果红结构
和该产物的核磁共振波谱推断其为联苯胺;并且随着降解时间的延长 ,联苯胺逐渐被降解.
关键词:裂褶菌 F17;刚果红;脱色;降解;联苯胺
文章编号:0253-2468(2007)09-1451-07　　　中图分类号:X172　　　文献标识码:A
DecolorizationanddegradationofCongoRedbySchizophylumsp.F17 and
cataboliteanalysis
TANGWenzhong1 , JIARong1, ＊ , ZHANGLiangpu2 , ZHENGZhixia3 , CHENGXiaobin1 , LIXudong1
1.ColegeofLifeScience, AnhuiUniversity, AnhuikeylaboratoryofEcologicalEngineeringandBiotechnology, Hefei230039
2.HefeiEnvironmentalMonitoringCentralStation, Hefei230031
3.KeyLaboratoryofAnhuiTechnologicalResearchofSewageTreatment, AnhuiInstituteofEnvironmentalScience, Hefei230061
Received29August2006;　　　receivedinrevisedform 22March2007;　　　accepted9May2007
Abstract:CongoRed(CR)wasdecolorizedanddegradedbythemainenzymessecretedbySchizophylumsp.F17 whichwereinvestigatedinanovel
systemestablishedbyourlaboratory.CataboliteanalysisshowedthatCRwasdecolorizedanddegradedefectivelybySchizophylumsp.F17.The
decolorizationpercentageofCRreached91.5% 48haftermycelialpeletadditionandthemaximumactivityofMnP, themaindegradationenzyme,
reached96.1U·L-1.Furthermore, fromtheUV-VisspectrumofCR, theabsorptionpeakat495nmvanishedandnewabsorptionpeaksappearedinthe
ultravioletregionafter96hand192 hofdecolorization.Benzidineisinitiallyproducedinthedegradationprocess.ItwasisolatedbyHPLCandits
identitywasconfirmedbyFT-IR, massspectrometryandNMR.Thebenzidinewasitselfdegradedgraduallyovertime.
Keywords:Schizophylumsp.F17;CongoRed;decolorization;degradation;benzidine
DOI :10.13671/j.hjkxxb.2007.09.006
环　　境　　科　　学　　学　　报 27卷
1　引言 (Introduction)
全球每年大约要生产 70×104t的染料 ,估计有
10% ～ 15%的染料在使用过程中被释放到环境中 ,
造成严重的污染 ,其中 80%是偶氮染料(Changet
al., 2001;李慧蓉 , 2005).刚果红是典型的双偶氮
染料 ,也是第一个人工合成的直接染料 ,被广泛应
用于纺织 、造纸和印染等工业(陈孔常等 , 2000).
人工合成的染料通常含有复杂的芳香环结构 、
化学稳定性高 、生物可降解性低 ,且多数染料及其
代谢中间产物具有致突变性 、致癌性和其它毒性
(许玫英等 , 2006).多数偶氮染料的合成是以芳香
胺为原料 ,在生物转化过程中会产生具有毒性的芳
香类化合物(Heissetal., 1992;Zolinger, 1991).
Zile等人(2005)报道 ,漆酶在降解 2种偶氮染料 ,
即 3-(4-二甲胺基 — 1-苯基偶氮)苯磺酸 和 3-(2-羟
基 — 1-萘基偶氮)苯磺酸的过程中均产生多种苯类
中间产物;Zhao等人 (2006)研究发现 ,白腐真菌
Pleurotusostreatus降解染料分散橙 3,即 4-(4 -硝基
苯基偶氮)苯胺 ,会产生中间产物 4-硝基苯胺 、硝基
苯和 4 -硝基酚.这些中间有毒产物仍是重要的环
境污染源 ,不能直接排放.为了使染料彻底分解 ,最
大限度地减少毒性污染物的排放 ,在研究白腐真菌
对染料脱色的同时 ,分析其降解产物和降解规律也
是十分必要的.目前 , 国内研究白腐真菌对染料脱
色降解的条件和影响因素的工作较多 ,但关于降解
产物的分析研究却极少.在国外 ,染料降解产物和
代谢途径已成为研究热点 (Martinsetal., 2003;
Tauberetal., 2005;Kumaretal., 2006),但降解过
程多是利用酶的作用 ,而菌体降解染料 ,反应体系
复杂 ,成分较多 ,降解产物的分离和鉴定存在困难.
刚果红属于难降解化合物 ,双偶氮结构造成的多数
目取代基决定了它脱色降解的难度 ,关于其生物降
解产物的研究一直未见报道.
本实验室在前期研究工作中 ,选育出 1株对多
种染料脱色降解能力较强的白腐真菌 ———裂褶菌
F17(Schizophylumsp.F17)(荚荣等 , 2004a),并构
建了一个新的脱色降解体系.该体系具有染料脱色
率高 、成本低 、成分简单和便于降解产物分析等优
点.本文在此基础上 ,研究裂褶菌 F17在此体系下存
在的主要降解酶 ,并对刚果红的降解产物进行分离
和鉴定 ,为研究偶氮染料的生物降解途径奠定基础.
2　材料与方法 (Materialsandmethods)
2.1　菌种和染料
　　裂褶菌 F17由本实验室分离 、保存.偶氮染料刚
果红结构式见图 1(染料购自上海试剂三厂).
图 1　偶氮染料刚果红的结构式
Fig.1　StructureofCongoRed(CR)
2.2　培养基和脱色降解体系
斜面培养基:土豆培养基(PDA).
生长培养基:100g土豆煮成的汁 ,蔗糖 20g,
KH2PO4 3.0g, MgSO4 · 7H2 O1.5g, 0.1 g·L-1 VB1
10mL, 用蒸馏水定容至 1000mL.
脱色降解体系:0.1mol·L-1乳酸缓冲液 (pH=
4.0)100mL,染料 100mg,松木屑 3.0g,用蒸馏水定
容至 1000mL.
2.3　实验方法
裂褶菌 F17接种于斜面培养基上 ,在 28℃、培
养 3 ～ 4d后用无菌水洗入三角烧瓶中 ,用匀浆器打
匀成碎菌丝片段 ,分别吸取 5mL等分到装有 95mL
的生长培养基烧瓶中 , 28OC、130r·min-1条件下摇床
振荡培养.培养 3d得到大小一致的菌丝球 ,用无菌
水冲洗过滤 ,将得到的菌球按湿重约 70.0g·L-1投
入脱色降解体系中 ,在 28℃、130r·min-1条件下摇床
振荡培养(12个平行).12个平行试验中 , 3个用于
测定酶活和脱色率 ,其余 9个每个时间段取一瓶过
滤(前 2个时间段为 12h和 24h, 以后每隔 24h取
样 ,直至 192h),得到菌球先测生物量 ,后测吸附率 ,
滤液保留做产物分析.
2.4　酶活测定
锰过氧化物酶(MnP)的测定(荚荣等 , 2004b):
反应体系为 0.1mol·L-1乳酸钠缓冲液(pH=4.5)
3.4mL、40mmol·L-1MnSO4 0.1mL、粗酶液 0.4mL、
1.6mmol·L-1 H2 O2 0.1mL;25℃下水浴 5min, 于
240nm测其吸光度 ,以 0.1mL缓冲液代替 MnSO4作
空白对照.定义每分钟氧化 1μmolMn2+为 Mn3+所
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9期 唐文忠等:裂褶菌 F17对偶氮染料刚果红的脱色降解及其产物分析
的酶量为一个酶活力单位(U).
木质素过氧化物酶 (LiP)的测定 (荚荣等 ,
2004b):反应体系为 0.2mol·L-1酒石酸缓冲液(pH
=3.0)1.5mL、15mmol·L-1藜芦醇 1.0mL、粗酶液
0.4mL、 15mmol· L-1 H2O2 0.1mL, 25℃下水浴
3min,于 310nm测其吸光度 ,以 0.1mL缓冲液代替
H2O2作空白对照.定义每分钟使 1μmol的藜芦醇氧
化成藜芦醛所需的酶量为一个酶活力单位(U).
漆酶(Lac)的测定(肖亚中等 , 2002):反应体
系为 50mmol·L-1(含 1mmol·L-1愈创木酚)琥珀酸
缓冲液(pH=4.5)4.0mL、粗酶液 1.0mL, 25℃下水
浴保温 30min,于 465nm测其吸光度 ,以 0.1mL缓
冲液代替 H2O2作空白对照.定义每分钟氧化 1μmol
的愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位(U).
2.5　脱色率 、吸附率和生物量的测定
脱色率的测定(李慧蓉等 , 1999):用分光光度
法测定并计算某一培养时间内培养液中剩余染料
浓度 a1(a为原染料浓度),则染料脱色率 η按下式
计算:
η=(a-a1)/a×100% (1)
吸附率的测定(李慧蓉等 , 1999;Kumaretal.,
2006):采用甲醇抽提法 ,将被菌体吸附的染料洗脱
下来 ,用分光光度法测定并计算浓度为 a2(a为原染
料浓度),则染料吸附率 γ按下式计算:
γ=a2 /a×100 % (2)
生物量的测定:菌体过滤并用蒸馏水数次冲洗
后 ,用滤纸吸去水分 ,测其湿重(包括吸附的染料).
2.6　降解产物分析
用 Ultrospec3100 pro紫外-可见扫描仪(日本)
对脱色 96h和 192h后的脱色液进行 200nm～ 600nm
扫描.分别取脱色 0h、96h和 192h脱色液 10mL,用
乙醚萃取(3×10mL)后蒸干 ,再用 1mL甲醇溶解用
于 HPLC分析.
高效液相色谱 (HPLC):Waters1525 Binary
HPLCPump, Waters2487DualλAbsorbanceDetector
(美国), AT-330ColumnHeater, SymmetryC18 5μm
(4.6 mm×150mm).流动相为甲醇∶水(含质量浓度
为 0.4%的 Na2HPO4)=85∶15(体积比),进样体积
20μL,流速 0.8mL·min-1 ,检测波长 270nm.
质谱(MS):ThermoFennigan公司(美国),型号
为 LCQAdventage, ESI直接进样.
傅立叶红外光谱 (FT-IR):Nesus870 FT-IR
ESP,波数 4000 ～ 400 cm-1 , KBr压片.
核磁共振波谱 (NMR):Brukeav500 NMR(瑞
士),室温 , 5mmTBI探头 ,溶剂为 DMSO-d6(二甲基
亚砜),内标物为 TMS(四甲基硅氧烷),观察频率为
500.1300046MHz.
3　结果(Results)
3.1　刚果红的脱色与吸附
将在生长培养基中纯培养 3d的菌球用无菌水
冲洗过滤 ,将得到的菌球投入灭菌后的脱色降解体
系中进行试验 ,测定不同时间段裂褶菌 F17对刚果
红染料的脱色率 、吸附率以及体系中生物量 , 结果
如图 2所示.由图可知 ,裂褶菌 F17在此脱色降解体
系中对刚果红有较高的脱色率 , 48h后染料脱色率
达到 91.5%, 192h后染料的脱色率为 95.1%.另
外 ,实验观察发现 ,菌球加入后 24h,菌球吸附大量
染料 ,菌球由白色变为紫色 ,但 24h后紫色逐渐褪
去 ,转变为淡黄色;表明 , 24h以前染料脱色主要是
以菌球吸附为主 , 24h后菌球吸附的染料逐渐被降
解.菌球在脱色过程中的生物量的变化也证明了这
一点 ,由图可知 ,菌球湿重在脱色 24h达到最大值
70.0g·L-1 , 48h菌球湿重略有下降 ,随后基本不变.
图 2　刚果红的脱色率和吸附率以及脱色降解体系中菌球的湿重
Fig.2　DecolorizationandadsorptionpercentageofCRandwetweight
of the mycelial pelets in the decolorization and
degradationsystem
3.2　裂褶菌 F17的主要降解酶研究
同步检测脱色降解体系中木质素降解酶系的
MnP、LiP和 Lac酶活 ,如图 3所示.裂褶菌 F17在脱
色降解体系中的产酶以 MnP为主 ,并有少量的 LiP,
而不分泌漆酶.脱色降解体系中 MnP在 24 ～ 96h都
保持较高酶活 ,在 48h酶活达到最大值 96.1U·L-1.
故可推断 ,裂褶菌 F17在本实验脱色降解体系中产
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环　　境　　科　　学　　学　　报 27卷
生的主要降解酶为 MnP.图 4显示了脱色降解过程
图 6　刚果红降解产物 HPLC洗脱分离图谱(a.0h, b.96h, c.192h)
Fig.6　HPLCchromatogramsofthedegradationproductsofCR(a.0h, b.96h, c.192h)
图 3　脱色降解体系中 LiP、MnP和 Lac酶活
Fig. 3　LiP、MnPandLacactivitiesinthedecolorizationand
degradationsystem
图 4　脱色降解体系的 pH变化情况
Fig.4　ThepH changeinthedecolorizationanddegradation
systemovertime
中体系的 pH变化情况.本实验脱色降解体系中的乳
酸缓冲液是为了维持菌体在产酶和降解过程中的最
适 pH,但同时可能作为一种碳源营养被菌体代谢 ,从
而导致脱色液 pH值在脱色 24h后上升 ,而 72h后 pH
值开始下降 ,说明菌体在脱色降解体系中代谢产酸.
3.3　降解产物的分离和鉴定
对脱色 96h和 192h后的脱色液进行紫外 -可见
扫描(图 5),发现 495nm处的可见吸收峰已消失 ,并
在紫外区出现多个吸收峰(230nm、270nm和 355nm),
表明在脱色 96h后刚果红已经基本被降解了.HPLC
分析脱色 0h、96h和 192h后的甲醇溶解样品 ,结果如
图 6所示.图 6显示 , 96h样品出现了一个 0h样品中
没有的谱峰 ,此峰的保留时间为 2.8min,但在 192h后
此峰值下降很多.可见 ,刚果红在脱色 96h和 192h后
脱色降解体系中产生一中间产物 ,并且随着时间的延
长 ,该产物被裂褶菌 F17进一步降解.
图 5　刚果红脱色 96h和 192h后吸收光谱的变化情况
Fig.5　ThechangeofabsorptionspectraofCRafter96hand192
hofdecolorization
1454
9期 唐文忠等:裂褶菌 F17对偶氮染料刚果红的脱色降解及其产物分析
　　图 7显示了该中间产物的质谱图 ,本实验质谱
采用的是直接进样 ,在大气压电离技术中的离子化
方式如下式(汪正范等 , 2000a):
(M +H)+(溶液) 　 (离子蒸发) 　(M +H)
+
(气相) (3)
图 7a中该产物的分子离子峰为 185.2,则由上
式可判断产物的相对分子量为 184.2.图 7b显示了
该产物的碎片离子峰 ,图谱中 168.1谱峰是分子离
子峰 185.2脱去 1分子 NH3而产生的 ,由于其结构
稳定 ,故有较高的丰度 ,可见产物中有氨基存在.
图 7　刚果红降解产物的 ESI-CID质谱图(a.一次离子化 , b.峰值 185.2二次离子化)
Fig.7　ESI-CIDspectraofdegradationproductofCR(a.firstionization, b.secondionizationofpeakm/z185.2)
图 8　刚果红降解产物的红外光谱图
Fig.8　FT-IRspectraofdegradationproductofCR
　　图 8和表 1显示了产物的红外光谱图及其分析
结果.图 8中 , 3399cm-1和 3280cm-1是典型的氨基
一对吸收峰;1627cm-1是氨基 N—H面内变形振动
峰;苯环的吸收峰在 1606cm-1处;1501cm-1是苯环
的骨架振动峰;1270cm-1是氨基 C—N伸缩振动峰;
1179cm-1是苯环面内弯曲振动峰;822cm-1的谱峰
是典型的苯环对位取代峰;700cm-1是苯环面外变
形振动峰;550cm-1以下是苯环 C—C键面外弯曲振
动峰(汪正范 , 2000b;Akalinetal., 2003).故该产
物的主要官能团为— C6 H4—和芳基— NH2 (见表
1).
表 1　刚果红降解产物基本官能团的红外吸收特征
Table1　Characteristicabsorptionbandsforthebasicfunctionalgroups
inthedegradationproductofCR
官能团 主要特征谱峰 /cm-1
对位双取代苯环 , — C
6
H
4
— C C1501, 1606(伸缩振动)
C—H 1179(苯环面内弯曲振动)
C—H 822(苯环面外弯曲振动)
C—H 700(面外变形振动)
芳基—NH2 N—H3399, 3280 (对称和非对称伸缩振动)
N—H1627(面内变形振动)
C—N 1270(伸缩振动)
综上并结合刚果红的结构 ,初步推断该降解产
物为联苯胺 ,结构式如图 9所示.图 10为该产物的
核磁共振图谱:图中 7.19983和 7.18318对应于质
子 3;6.57821和 6.56160对应于质子 2;质子 2和 3
互相有偶合作用 ,故均为双重峰 , 4.97948对应于质
子 1;3.32493、3.30255和 2.50097为溶剂 DMSO-d6
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环　　境　　科　　学　　学　　报 27卷
的共振峰;0.00028是内标物 TMS的共振峰.联苯胺
中质子 1、2和 3都另有 3个等价质子 ,故其对应峰
的峰面积之比应为 1∶1∶1 ,图中三者之比符合比例.
此外 ,在同样的 HPLC条件下 ,对联苯胺标样进行洗
脱 ,发现其洗脱峰的保留时间也为 2.8min,由此进
一步确认该产物为联苯胺.
图 9　联苯胺的结构式
Fig.9　Thestructureofbenzidine
图 10　刚果红降解产物的 1HNMR谱图
Fig.10　1HNMRspectraofthebenzidinedegradationproductofCR　
4　讨论(Discussion)
刚果红是 1种典型的双偶氮染料 ,它具有 2个
不饱和结构的发色基团 ———偶氮基 ,还有 4个助色
基团———氨基和磺酸钠基 ,在可见光区 495nm处有
一强吸收峰.脱色 96h后对脱色液进行紫外-可见扫
描发现该吸收峰已消失 ,可见光区并没有新的吸收
峰产生 ,说明此时刚果红的 2个偶氮键都发生断裂
了 ,与李慧蓉等人(2001)研究报道的偶氮键断裂是
白腐真菌对偶氮染料生物降解的关键步骤一致.
酶活检测结果表明 ,裂褶菌 F17在降解刚果红
过程中产生的降解酶以 MnP为主 , MnP是一种含铁
的血红蛋白 ,胞外酶.本实验脱色降解体系中的天
然物质松木屑含有 MnP所必需的还原底物锰离子 ,
通过运输可富集在菌丝体中.在有氧的条件下 ,体
系中的 H2 O2触发 MnP催化循环 ,循环始于含有
Fe3+的酶与 H2O2结合形成铁过氧化物联合体 ,同时
亚铁血红素上的 2个电子转移到 H2O2的双氧键上 ,
使其断裂释放出 1分子 H2 O,并形成活性氧络合
Fe4+卟啉联合体 MnP-CompoundⅠ (Hofrichteretal.
, 2002).接着由一个螯合的 Mn2+作为电子供体将
MnP-CompoundⅠ还原为 MnP-CompoundⅡ ,同时自
身被氧化为 Mn3 +,随后 MnP-CompoundⅡ 再被一个
螯合的 Mn2+还原回原型完成该循环 ,放出 2个分子
H2O.MnP的催化循环如下(Harazonoetal., 2005):
MnP+H2O2 MnPⅠ +H2O (4)
MnPⅠ +Mn2+ MnPⅡ +Mn3+ (5)
MnPⅡ +Mn2+ MnP+Mn3+ +H2O (6)
氧化态的 Mn3+被乳酸稳定 ,转而充当一种低分
子量的 、可扩散的氧化还原调节剂的作用 ———离开
酶的表面 ,通过夺取氢和电子的方式 ,非特异性地
进攻刚果红分子生成高度活性的自由中间体.刚果
红结构具有高度对称性 ,在被氧化时结构中的 2个
偶氮键断裂应该是同时的 ,偶氮键断裂可能形成
4, 4-二硝基联苯 ,而该物质属于高度氧化物 ,很难被
MnP继续氧化降解(李慧蓉 , 2005).此时 ,裂褶菌
F17可能会产生一种与细胞膜结合的芳烃硝基还原
酶 ,该酶能将 4, 4-二硝基联苯还原为联苯胺 ,胺是
过氧化物酶催化的氧化反应底物 ,则 MnP可以进一
步降解联苯胺形成其它产物(李慧蓉 , 2005).故推
测裂褶菌 F17降解刚果红产生联苯胺的可能途
径为:
刚 果 红 (MnP/Mn3+) 4, 4-二 硝 基 联 苯
(芳烃硝基还原酶)联苯胺
(MnP/Mn3+)其它产物
当然 ,由于刚果红分子带有较多的官能团 ,生
物降解过程非常复杂 ,本实验分离和鉴定的仅为染
料刚果红降解产物中的一种 ,要清楚地阐明其降解
机制和降解规律还有待于对更多降解产物的准确
定性和定量分析.
5　结论 (Conclusions)
1)裂褶菌 F17在本实验所采用的脱色降解体
系中对偶氮染料刚果红表现出较高的脱色降解能
力 ,加入染料 48h后脱色率就可达 91.5%,其主要
降解酶为 MnP, 并在脱色 48h酶活达到最大值
96.1U·L-1.
2)裂褶菌 F17降解染料刚果红的过程中产生
联苯胺 ,并且随着时间的延长 ,联苯胺逐渐被降解.
1456
9期 唐文忠等:裂褶菌 F17对偶氮染料刚果红的脱色降解及其产物分析
责任作者简介:荚荣(1964—),女 , 安徽大学教授 , 主要从事
环境生物技术方面研究.
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