全 文 ：不同缓冲体系下 pH值对
裂褶菌 F17产锰过氧化物酶的影响
李旭东1 ,荚　荣 1 ,吕飒音 2 ,唐文忠 1
(1. 安徽大学 生命科学学院 ,安徽 合肥　230039;2. 安徽大学 现代实验技术中心 , 安徽 合肥　230039)
摘　要:研究 6组缓冲体系不同的 pH值对裂褶菌 F17产锰过氧化物酶的影响 , 并比较这 6组
缓冲体系在裂褶菌 F17产酶过程中对 pH值的缓冲调节能力 .结果表明 , 各缓冲体系对裂褶菌 F17
产酶的影响不同. 在酸性条件下 , 缓冲培养基的 pH 值变化不大;在碱性条件下 , NH4 C l -氨水和
2 -氨基 -2 -甲基 - 1, 3 -丙二醇两种体系的缓冲调节能力较其他体系要好. 灭菌后 pH 值为
7. 2 ～ 9. 5的缓冲培养基有利于裂褶菌 F17产锰过氧化物酶.
关键词:缓冲体系;pH值;裂褶菌 F17;锰过氧化物酶
中图分类号:Q935　　文献标识码:A　　文章编号:1000 -2162(2006)05 - 0078 -05
白腐菌是降解木质素及众多难降解污染物的最有效的微生物[ 1 -4] ,白腐菌在一些主要营养物(碳 、
氮 、硫 )受到限制时产生木质素降解酶系 ,包括木质素过氧化物酶 (Lignin perox idase, Lip)、锰过氧化物
酶 (Mn - dependen t peroxidase, Mnp)和漆酶 (Laccase). L ip和 Mnp是木质素降解酶系中起主要作用的两
种过氧化物酶 ,它们在白腐菌次生代谢过程中合成且被分泌到胞外 ,经 H2O2引发一系列自由基链反应 ,
依靠氧化还原反应对有机污染物进行降解和矿化 [ 5] .
锰过氧化物酶 Mnp能被大多数白腐菌产生. M np的降解潜能不只限于木质素 ,像腐殖质 、褐煤这样
的木质素衍生物以及各种有机污染物 ,都被证明对 Mnp的进攻敏感. 种类不同的白腐菌合成和分泌的
M np各具特点 ,且受生长环境多因素的影响 ,尤其是环境的 pH值与微生物有密切的联系. pH值影响细
胞膜所带电荷 ,改变培养基中化合物的离子化程度 ,从而影响细胞对营养物质吸收与代谢产物的分泌.
很多研究表明白腐菌生长适宜的 pH值为 4. 5 ～ 5. 5 [ 6] .李华钟等 [ 7] 、浦跃武等 [ 8]研究报道黄孢原毛平
革菌产 Mnp的最适 pH值为 4. 5,李翠珍等[ 9]研究显示白腐菌 F2产 Mnp的最适 pH值为 3. 6.
本实验室分离 、纯化了一株具木质素降解能力的白腐菌 ———裂褶菌 F17 (S ch izophy llum sp. F17),
在限氮液体培养下合成与分泌 Mnp.前期研究发现 ,裂褶菌 F17生长 pH值范围较宽(3. 0 ～ 9. 8),在 pH
值为碱性的条件下产 Mnp活力较高 ,有别于研究报道的其他真菌菌株. 另外 ,由于使用的是高碳低氮培
养基 ,在菌体生长代谢过程中 pH值下降较快 ,影响 F17菌株的产酶量. 因而 ,本实验选择 6组缓冲体
系 ,系统研究不同缓冲体系及不同 pH值对裂褶菌 F17产锰过氧化物酶的影响 ,分析产酶过程中的培养
基 pH值变化 ,旨在对该菌产酶的培养液进行适当的缓冲以维持菌体较高的产酶水平.
1　材料和方法
1. 1　菌　种
裂褶菌 F17 (S ch izophy llum sp. F17)(本实验室分离 、保藏)
1. 2　培养基
斜面培养基 ( /L):马铃薯 200g,葡萄糖 20g,琼脂 20g, KH2PO 4 3g,M gSO4 7H2O 1. 5g, 0. 1g /L VB1
收稿日期:2006 - 03 - 15
基金项目:安徽省教育厅自然科学基金资助项目(2006KJ162B)
作者简介:李旭东(1982 -), 男 ,湖南桂阳人 , 安徽大学硕士研究生;
荚　荣(1964 -), 女 ,安徽芜湖人 , 安徽大学教授 ,硕士生导师.
2006年 9月
第 30卷 第 5期
安徽大学学报(自然科学版)
Jou rna l of Anhui Un ive rsity Na tu ra l Science Ed ition
September 2006
Vo.l 30 No. 5
2 - 10mg, pH自然 , 0. 1M Pa, 121℃灭菌 20m in.限氮培养基:见参考文献 [ 10]
1. 3　菌体培养
裂褶菌 F17 (S ch izophy llum sp. F17)接种于斜面培养基上 , 28℃培养 10d左右 ,用无菌水洗入三角
瓶中 ,匀浆器打匀成碎菌丝片断 ,分别吸取 5mL菌悬液分装到含 100mL加入不同缓冲体系的限氮培养
基的三角瓶 (250mL)中 , 28℃、130rpm摇床振荡培养 ,形成大小一致的菌丝球.
1. 4　锰过氧化物酶 Mnp活性测定
0. 11mol /L乳酸钠缓冲液 (pH4. 5)3. 4mL, 40mmo l /L M nSO4 0. 1mL,粗酶液 0. 4mL, 1. 6mmo l /LH 2O 2
0. 1mL启动反应 , 25℃水浴 5m in,于 240nm测其光密度 ,以 0. 1mL缓冲液代替 MnSO4做空白对照 ,定义
每分钟氧化 1μmo lM n2+成为 Mn3+所需的酶量为一个酶活力单位(U).
1. 5　缓冲体系和 pH值测定
实验选择 6组缓冲体系 ,其成分 、pH值见表 1所示.
表 1　实验选择的 6组缓冲体系
缓冲体系 成分 A 成分 B pH值
① 甘氨酸 +N aC l缓冲体系 0. 1M 甘氨酸 +0. 1M NaC l 0. 1M HC l(NaOH) 3 ～ 11
② N a2HPO4 -柠檬酸缓冲体系 0. 2M Na2H PO4 0. 1M柠檬酸 3 ～ 7
　 NH
4
C l-氨水缓冲体系 0. 1M NH
4
C l 0. 1M氨水 8 ～ 11
③ 乳酸 -乳酸钠缓冲体系 0. 1M乳酸 0. 1M乳酸钠 3 ～ 6
　 H
3
BO
4
+KC l-Na
2
CO
3
体系 0. 2M H
3
BO
4
+2M KC l 0. 2M N a
2
CO
3 7 ～ 11
④ 广泛缓冲体系 0. 04M H3BO4 +0. 04M 乙酸 +0. 04M H3PO4 0. 2M NaOH 3 ～ 11
⑤ 丁二酸二甲酯缓冲体系 丁二酸二甲酯 - 3 ～ 11
⑥ 2 -氨基 - 2 -甲基 -1,
　 3 -丙二醇缓冲体系
2 -氨基 - 2 -甲基 - 1,
3 -丙二醇 - 7 ～ 11
　　缓冲体系① ～ ④由 A和 B两种溶液按不同比例混合配制而成 , pH值范围 3 ～ 11,其具体配制见参
考文献 [ 11] ;为了使配制的缓冲溶液有较强的缓冲能力 ,将其与 5倍浓缩的限氮培养基按 4∶1的比例
混合 ,混合后缓冲培养基的 pH值与原缓冲溶液的 pH值相等. 丁二酸二甲酯 、2 -氨基 - 2 -甲基 - 1, 3
-丙二醇在限氮培养基中的终浓度为 20mmo l /L,再用 HC l、N aOH溶液调节培养基到所需的 pH值. 每
个 pH值设两个平行 ,重复实验两次.
pH值测定:PHB5微机型酸度计 (上海 ).
2　结果与分析
2. 1　未加缓冲溶液时裂褶菌 F17产 Mnp的情况
培养基中不加缓冲溶液 ,直接用 HC l、N aOH溶液调节限氮培养基 pH值分别为 3、4、5、6、7、8、9、10、
11.裂褶菌 F17在 pH 11(灭菌后 pH 7. 2)条件下产酶活力最高 ,达到 129. 2U /L(如图 1所示).
图 1　未加缓冲溶液时裂褶菌 F17产 M np的情况 图 2　甘氨酸 +NaC l缓冲体系对裂褶菌 F17产 M np的影响
79第 5期 李旭东 ,等:不同缓冲体系下 pH值对裂褶菌 F17产锰过氧化物酶的影响
培养基经高温灭菌后以及菌体产酶代谢过程中 pH值的变化见表 2所示. 从表 2可以看出 , pH值
为 6 ～ 11的培养基 ,菌体代谢 3d后 pH值降到 5. 5以下;而 pH值为 3 ～ 5的培养基 , pH值变化幅度则
较小.
表 2　未加缓冲溶液时培养基各 pH值变化
pH值 灭菌后 培养时间(d)
2 3 4 5 6 7
3 3. 0 3. 0 3. 0 2. 9 2. 9 3. 0 3. 0
4 4. 1 4. 1 3. 9 4. 0 3. 7 3. 7 3. 7
5 4. 8 4. 5 4. 5 4. 3 4. 3 4. 2 4. 2
6 5. 7 4. 7 4. 5 4. 5 4. 4 4. 5 4. 6
7 6. 7 5. 7 4. 2 4. 3 4. 1 4. 3 4. 8
8 7. 0 6. 4 4. 3 4. 3 4. 4 4. 6 5. 1
9 7. 1 6. 8 4. 9 5. 1 5. 0 5. 0 5. 1
10 7. 1 6. 8 5. 0 5. 1 5. 1 5. 2 5. 2
11 7. 2 6. 9 5. 2 5. 4 5. 5 5. 4 5. 6
2. 2　甘氨酸 -NaC l缓冲体系 (pH 3 ～ 11)
因为不同批次培养的菌体的代谢能力有差异 ,因而在考察缓冲体系对裂褶菌 F17产 M np的影响
时 ,每批实验都设置一个对照.据 2. 1,这个对照为未加缓冲溶液的直接用 N aOH溶液调节 pH =11的限
氮培养基.
从图 2所示可看出 ,在甘氨酸 +NaC l缓冲体系中 ,裂褶菌 F17在 pH 11(灭菌后 pH 7. 7)条件下所
产的 Mnp酶活为 62. 4U /L,较其他 pH值条件下的酶活要高 ,但比未加缓冲溶液培养基(对照)中的酶活
90. 1U /L低. 因而甘氨酸 -N aC l缓冲体系对裂褶菌 F17产 Mnp不适宜.
菌体产酶代谢过程中 pH3 ～ 5的培养基 pH值较稳定 , pH 6 ～ 11的培养基在培养 3d后 pH值都降
到 5. 6以下 ,与未加缓冲溶液的培养基 pH值变化相似 ,由此得出甘氨酸 +N aC l缓冲体系对该菌在限氮
培养基的生长代谢表现出较差的缓冲能力.
2. 3　Na2HPO4 -柠檬酸 (pH 3 ～ 7)、NH4Cl-氨水缓冲体系 (pH 8 ～ 11)
在两种缓冲体系不同 pH值条件下 ,培养基 pH 11(灭菌后 pH 7. 6)时 ,裂褶菌 F17产 Mnp酶活力达
到 161. 5U /L,与对照酶活接近.因而 ,这组缓冲溶液对裂褶菌 F17产 Mnp影响不大.
在 N a2HPO4 -柠檬酸缓冲体系 (pH 3 ～ 7)中 ,随着菌体代谢 , pH值比较稳定 ,在 7d时间内基本维
持在灭菌后的 pH值.在 NH 4C l -氨水缓冲体系(pH 8 ～ 11)中 ,灭菌后 pH值达到 7. 2 ～ 7. 8,且持续到第
4d,与未加缓冲溶液时培养基 pH值变化相比 ,这组缓冲体系对培养基 pH值变化起到一定的缓冲作用.
2. 4　乳酸 -乳酸钠(pH 3 ～ 6)、H3BO4 +KC l-Na2CO3缓冲体系 (pH 7 ～ 11)
图 3所示在两种缓冲体系不同 pH值条件下 ,裂褶菌 F17产 Mnp酶活的情况.从图 3中可看出 ,在
H3 BO 4 +KC l -N a2 CO 3缓冲体系中 ,培养基 pH 11(灭菌后 pH 7. 2)条件下 ,M np酶活力达到 130. 8U /L,
是对照酶活的 2. 9倍. 因而 ,说明这个缓冲体系对裂褶菌 F17产 Mnp较适宜.
在两种缓冲体系中 ,随着培养时间的延长 ,培养基的 pH值基本恒定.但是在 H3 BO 4 +KC l-N a2CO 3
缓冲体系的培养基中 ,碎菌丝形成的菌球很小 ,几乎没有生长.
2. 5　H3BO4 +乙酸 +H3 PO4广泛缓冲体系 (pH 3 ～ 11)
图 4所示在 H3BO4 +乙酸 +H3 PO 4广泛缓冲体系中 ,最高的 Mnp酶活仍是在培养基 pH 11(灭菌后
pH 9. 5)的条件下出现 ,为 31. 4U /L ,是对照酶活的 1. 2倍.
随着培养时间的延长 ,各培养基的 pH值几乎没有发生变化 ,维持在灭菌后的 pH值. 同时 ,在此广
泛缓冲培养基中 ,菌丝形成的菌球很小 ,几乎没有生长.
80 安徽大学学报(自然科学版) 第 30卷
　　2. 4和 2. 5实验中 ,在 H3 BO 4 +KC l-Na2CO3缓冲体系和 H3BO4 +乙酸 +H3PO 4广泛缓冲体系中 ,碎
菌丝形成的菌球都很小 ,几乎没有生长 ,但在相同 pH值的其他缓冲体系培养基中 ,菌体却生长良好 ,说
明抑制菌体生长的不是 pH值 ,可能是两种缓冲体系中的共同成分 H 3BO4.
　　　图 3　乳酸 -乳酸钠 、H3BO4 +KC l -N a2CO3 图 4　广泛缓冲体系对裂褶菌 F17产
缓冲体系对裂褶菌 F17产 M np的影响 M np的影响
进一步用 NaOH溶液将含 0. 2mo l /L H3 BO 4的限氮培养基 pH值调节成 7、8、9、10、11.实验结果显
示 ,培养 7d内 ,各 pH值培养基中形成的菌丝球都很小 ,几乎没有生长 ,但在第 5d, pH 11(灭菌后 pH
9. 8)的培养基中酶活却达到 144. 0U /L,与未加缓冲溶液培养基 (对照)中的酶活 152. 5U /L相当 ,且各
培养基的 pH值维持恒定. 0. 2mo l /L H3 BO 4抑制了菌体的生长 ,但在发酵液中存在较高 Mnp酶活 ,分析
原因可能是白腐菌的初生生长受到抑制 ,生长基本停止而触发了次生代谢 , 进行木质素降解酶的合
成 [ 12] ;另一方面 , H3 BO 4可能与草酸一样 ,激活 Mnp系统 ,与 Mn(Ⅲ)螯合形成稳定的高氧化还原电位的
螯合物 ,致使发酵液中存在高 Mnp酶活.
2. 6　丁二酸二甲酯缓冲体系(pH 3 ～ 11)
采用丁二酸二甲酯 (20mmo l /L)缓冲体系 ,培养基 pH 11(灭菌后 pH 6. 6)时 Mnp酶活最高 ,为
150. 8U /L,与对照酶活接近.此缓冲体系对裂褶菌 F17产 Mnp的影响不大.
此体系的缓冲能力较差 ,除 pH3、4的培养基 pH值较稳定外 ,其他各 pH值的培养基在菌体代谢 3d
后 pH值都降到 5. 5以下.
2. 7　2 -氨基 -2 -甲基 -1 , 3 -丙二醇缓冲体系 (pH 7 ～ 11)
2 -氨基 -2 -甲基 -1, 3 -丙二醇缓冲体系对裂褶菌 F17产 Mnp的影响不大. M np最高酶活在 pH
11(灭菌后 pH 8. 0)条件下出现 ,为 226. 2U /L,与对照酶活接近.
此体系在裂褶菌 F17产 Mnp过程中 ,起到一定的缓冲作用.灭菌后培养基 pH值达到 7. 3 ～ 8. 0,且
可维持到菌体代谢的第 4d.
3　结　语
(1)甘氨酸 +N aC l缓冲体系对裂褶菌 F17产 Mnp不适宜;Na2HPO 4 -柠檬酸和 NH4C l -氨水缓冲
体系 、丁二酸二甲酯缓冲体系 、2 -氨基 -2 -甲基 - 1, 3 -丙二醇缓冲体系则对产酶影响不大. 而 H3 BO 4 +
KC l-Na2CO3缓冲体系 、H3 BO 4 +乙酸 +H3 PO 4广泛缓冲体系虽然抑制菌体生长 ,但对其产酶却较适宜.
(2)在酸性条件下 ,多数缓冲培养基的 pH值变化都不大;在碱性条件下 ,各缓冲体系缓冲调节 pH
值的能力则有限 ,但 NH4C l -氨水缓冲体系和 2 -氨基 - 2 -甲基 - 1, 3 -丙二醇缓冲体系比其他缓冲
体系的缓冲能力要好.
(3)裂褶菌 F17在限氮培养基 pH 11(灭菌后 pH 7. 2 ～ 9. 5)的条件下产 Mnp较高.
81第 5期 李旭东 ,等:不同缓冲体系下 pH值对裂褶菌 F17产锰过氧化物酶的影响
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The effects of pH values on the production ofM n - dependent
peroxidase bySch izophy llum sp. F17 in d ifferent buffer system s
LIXu-dong1 , JIA Rong1 , LU Sa-y in2 , TANGW en-zhong1
(1. Schoo l o f L ife Sc ience, Anhu i Un ive rsity, H e fe i 230039, China;
2. Center o fM oden Expe rim en t Techno logy, H efe i　230039, Ch ina)
Abstract:The effects of pH va lues on the production o f M n - dependent peroxidase (Mnp) by
S ch izophy llum sp. F17 in six sets of buffer sy stems w ere investigated, and the buffer system s’ ab ilities to
cushion and adjust the changes of pH values in the process of producing M np w ere compared. The results
show ed that:diffe rent buffer system s had differen t effects on the production of theM np. W hen in acidic condi-
tions, pH values o f buffermediums didnt change acute ly;in basic conditions, the NH4C l -Ammonia buffer
sy stem and the 2 -Am ino - 2 -M ethy l- 1, 3 - Propaned io l buffer system we re mo re effective than othe rs to
cushion and adjust the changes of pH va lues. The buffermedium s w ith pH values o f 7. 2 - 9. 5 after au toc la-
ving w ere propitious forS ch izophy llum sp. F17 to produceM np.
Key words:buffe r system;pH value;S ch izophy llum sp. F17;Mnp.
责任编校:李镜平
82 安徽大学学报(自然科学版) 第 30卷