全 文 ：书［收稿日期］ 20100910(004)
［基金项目］ 黑龙江省卫生厅科研项目(2005-315);牡丹江医学院科研项目(2005-09)
［第一作者］ 张晓莉，硕士，教授，研究生导师，主要从事内分泌免疫、中药免疫调节方面的研究，Tel:0453-6586656，E-mail:zhangxiaoli59@
126. com
［通讯作者］ * 王亚贤，教授，博士生导师，主要从事中医药现代化多学科免疫学研究，Tel:0451-82193649，E-mail:wangyxmail@ yahoo. com.
cn
刺五加叶总黄酮和电针对大鼠脑缺血后 Bcl-2 蛋白表达的影响
张晓莉1，石学魁1，蔡文辉2，王亚贤2*
(1. 牡丹江医学院病原生物学教研室，黑龙江 牡丹江 157011;
2. 黑龙江中医药大学 微生物与免疫学教研室，哈尔滨 150040)
［摘要］ 目的:研究脑缺血与 B 细胞淋巴瘤 /白血病-2(B cell lymphoma / leukemia-2，Bcl-2)蛋白的关系及刺五加总黄酮和
针刺联合治疗作用。方法:雄性 Wistar 大鼠线栓大脑中动脉建立脑缺血动物模型，观察大鼠脑缺血后神经功能缺损评分;应用
免疫组化法测定模型组(A 组)、电针组(B 组)、总黄酮组(C 组)、针药结合组(D 组)、假手术组(E 组)、正常对照组(F 组)Bcl-
2 的表达。结果:电针和刺五加总黄酮及其联合治疗组大鼠脑缺血后神经功能缺损评分显著低于单纯缺血组(P < 0. 01 及 P <
0. 05)。与 E，F 组比较，A，B，C，D 组 Bcl-2 明显增加(P < 0. 01);与 B，C 组比较，D 组表达明显增多(P < 0. 01 及 P < 0. 05)。结
论:刺五加总黄酮和电针能提高 Bcl-2 蛋白表达，减少脑缺血区细胞凋亡的发生，尤其针药结合治疗有良好的疗效。
［关键词］ 急性脑梗死;刺五加叶总黄酮;电针;B 细胞淋巴病 /白血病-2
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2011)05-0177-04
Influence of Total Flavones of Acanthopanacis Senticosi and
Electroacupuncture on Expression of Protein Bcl-2 of Brain
after Cerebral Ischemia in Rats
ZHANG Xiao-li1，SHI Xue-kui1，CAI Wen-hui2，WANG Ya-xian2*
(1. Teaching and Research Section of Pathogenic Biology，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157011，China;
2 . Department of Microbiology and Immunology，Heilongjiang University of
Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China)
［Abstract］ Objective:To study the relation between cerebral ischemia and Bcl-2(B cell lymphoma / leuke-
mia-2，Bcl-2)and the effect of electroacupuncture and total flavones of Acanthopanacis Senticosi Folium for treat-
ment. Method:Male Wistar rat model of cerebral ischemia was established with the method of thread middle cerebral
artery occlusion. The rats were randomly divided into 6 groups:model control group(group A)，acupuncture treat-
ment group(group B)，total flavones group(group C)，acupuncture and Chinese medicine group(group D)，sham
operation group(group E)and normal control group(group F). The neurological deficit score was evaluated and im-
munohistochemistry was used to observe the expressions of Bcl-2. Result:Compared with those of the model group，
the neurological deficit scores were significantly decreased in the treatment group(P < 0. 01，P < 0. 05). The expres-
sion of Bcl-2 increased markedly in the A，B，C and D groups(P < 0. 01). Compared treatment of acupuncture with
Chinese medicine，group D was more obvious(P < 0. 01，P < 0. 05). Conclusion:Electroacupuncture and total fla-
vones of Acanthopanacis Senticosi Folium both can increase the expression of Bcl-2 and diminish apoptosis induced
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第 17 卷第 5 期
2011 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 17，No. 5
Mar.，2011
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2011.05.074
by ischemic cerebra，and electroacupuncture combined with Chinese medicine has significant effect.
［Key words］ ischemic cerebral disease;total flavones of Acanthpanacis Senticosi Folium;electroacupunc-
ture;Bcl-2
实验研究发现用电针刺激穴位可抑制脑缺血
后脑内神经细胞的凋亡，也能增强局灶性脑缺血
大鼠脑组织脑源性神经营养因子的表达［1］。而
刺五加(Acanthopanax senticosus，AS)广泛应用于
临床治疗缺血性脑血管疾病，疗效较好。前期实
验研究亦证实，刺五加总黄酮和电针及其联合应
用可上调突触素(synaptophysin，P38，SYN)、生长
相关蛋白(growth-associated protein-43，GAP-43)
的表达，提高缺血脑组织转化生长因子 β1(trans-
forming growth factor-beta 1，TGF-β1)蛋白表达，减
少脑缺血区细胞凋亡的发生［2-3］。为了进一步探
讨针药结合法对缺血性脑损伤的保护作用及其
机制，本实验采用大鼠大脑中动脉栓塞性脑缺血
模型，通过免疫组化法，检测刺五加总黄酮和电
针以及二者联合对大鼠脑缺血后 B 细胞淋巴瘤 /
白血病-2(B cell lymphoma / leukemia-2，Bcl-2)蛋
白表达的影响，为临床治疗缺血性脑血管疾病奠
定理论基础。
1 材料
1. 1 动物 清洁级健康雄性 Wistar 大鼠，体重(250
± 50)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动
物合格证号黑动字 P00102004。
1. 2 药物 刺五加总黄酮:参照文献［4］方法自
提，由野生刺五加 Acanthopanax senticosus Harms 叶
经乙 醇 提 取 精 制 而 成，纯 度 为 71. 23%，得 率
4. 86%(批号 050428)。先用 60% 乙醇溶解为 20
g·L － 1，再用双蒸水配制成 2 g·L － 1的受试溶液。以
微孔滤膜过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。免疫组化
SABC 试剂盒、DAB 显色试剂盒、Bcl-2 蛋白免疫组
化 SABC 试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司产
品(200501)。
2 方法
2. 1 模型制备 参照文献［5］制备大鼠右侧大脑中
动脉栓塞模型，不抽出尼龙线栓，为永久性脑缺血。
假手术组除不插入线栓外，其余步骤同模型组。术
中动物体温用烤灯维持在 37 ℃ ～ 37. 5 ℃。
2. 2 神经功能评分 动物清醒后观察各组的活动
度并参考 Longa［6］等的 5 分制评分标准进行神经功
能评分。
0 分:无明显神经功能缺损表现，肢体活动正
常;1 分:神经功能轻度损伤，不能完全伸展左侧前
爪;2 分:神经功能中度损伤，行走时向左侧转圈;
3 分:神经功能重度损伤，行走时向左侧倾倒，提尾
时向左侧旋转，自动转圈;4 分:神经功能极重度
损伤，不能自主行走，意识丧失。1 ～ 3 分的大鼠为
造模成功，不符合条件的大鼠剔除。对于实验中剔
除及死亡的大鼠均按严格的实验条件统一补充、分
组。无症状及死亡大鼠均剔除。
2. 3 动物分组 大鼠随机分为模型对照组(A 组);
电针治疗组(B 组);总黄酮治疗组(C 组);针药治
疗组(D 组，电针 + 刺五加总黄酮)，假手术组(E
组)，每组 10 只。同时，相同条件饲养 10 只正常大
鼠作为正常对照组(F 组)。
2. 4 给药方法 药物治疗组(C 组)和针药治疗组
(D 组)大鼠在手术后 6 h 经 ip 给予刺五加总黄酮
(4 mg·kg － 1)治疗，模型组(A 组)、假手术组(E
组)、正常对照组(F 组)大鼠在相应时间经 ip 给
予相应剂量的生理盐水，每日 1 次。连续给药 14
d。
2. 5 电针方法 B 组、D 组选取大椎和百会穴，动
物清醒后立即以 1 寸毫针，沿皮斜刺“大椎”、“百
会”2 穴，然后将针柄分别连接至 G6805 型电针仪
上，频率 5 ～ 10 次 / s，采用疏密波，强度以肌肉轻微
抖为度，一般 3 ～ 5 V，时间持续 30 min。每日 1
次。其他组大鼠固定不针刺。连续电针 14 d。
2. 6 标本采集与处理 治疗 14 d 后，以过量水合
氯醛麻醉处死动物，迅速开胸，暴露心脏，经主动脉
迅速灌注 100 mL 生理盐水;然后用 4% 多聚甲醛
(pH 7. 4，PB 配制，4 ℃)缓慢灌注固定，断头取脑固
定于上述固定液中。取前囟前 2 mm 至前囟后 3 mm
脑组织，常规乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包
埋。连续冠状切片，片厚 5 μm。
2. 7 HE 染色观察病理形态 石蜡切片常规脱蜡，
HE 染色，普通光镜观察。
2. 8 免疫组化染色 采用 SABC 免疫组化染色法，
操作步骤严格按试剂盒说明书进行。阴性对照用
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第 17 卷第 5 期
2011 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 17，No. 5
Mar.，2011
PBS 代替一抗。应用 HIMAS-2000 多媒体彩色病理
图文分析系统定量检测 Bcl-2 免疫反应阳性单位。
每只大鼠选 2 张切片，每张切片随机观察 5 个测试
区的阳性单位，取其均值。
2. 9 统计学处理 采用 SPSS 10. 0 软件进行方差
分析，结果以 珋x ± s 表示，各组间比较采用单因素方
差分析，两两比较以 LSD 检验。P < 0. 05 为有统计
学意义。
3 结果
3. 1 各组大鼠神经功能评分 假手术组无神经功
能缺陷，与正常组活动无明显区别。与假手术组和
正常组比较，模型组有明显神经功能缺失，神经功能
评分明显增加;经刺五加总黄酮、电针及其联合治疗
后，神经功能缺失程度较模型组显著减轻，神经功能
评分降低 (P < 0. 05 或 P < 0. 01)，但仍显著高于假
手术组和正常组(P < 0. 01);而刺五加总黄酮、电针
及其联合治疗组之间比较差异无统计学意义(见
表 1)。
3. 2 各组脑组织病理学改变情况比较 HE 染色
结果显示，假手术组未见明显病理改变，与正常
组未见明显区别。大脑组织结构完整，神经细
胞、胶质细胞及毛细血管形态正常，细胞膜、核膜
清晰，核仁明显。模型组大鼠缺血区神经元数量
明显减少，排列紊乱，脑组织水肿明显，神经细胞
间隙扩大;部分细胞坏死，可见濒死神经元核周
染色质浓缩成环状、斑块状。经刺五加总黄酮、
电针及其联合治疗后，缺血半暗区神经细胞数明
显增多，神经细胞大多数形态较正常，结构较为
完整，细胞核固缩少，组织水肿轻微，胶质细胞增
生明显。
3. 3 Bcl-2 蛋白免疫组化检测 Bcl-2 为胞浆被染
成棕黄色，也有部分胞膜被着色，高倍镜下 Bcl-2
蛋白表达显色深的细胞形态较正常，细胞核较完
整。免疫组化结果显示，Bcl-2 蛋白在假手术组和
正常对照组的脑神经细胞中呈弱阳性表达。在模
型组，缺血周围区 Bcl-2 蛋白的表达比正常对照组
和假手术组明显增高，差异有显著意义(P <
0. 01);应用刺五加总黄酮和电针疗法及二者联合
应用，Bcl-2 蛋白的表达明显增强，与模型组比较差
异有显著意义(P < 0. 01)。其中，针药联合组比
单纯电针组或单纯总黄酮组表达更明显(P <
0. 05 或 P < 0. 01)(表 1，图 1)。
表 1 各组神经功能评分、Bcl-2表达情况比较(珋x ± s，n = 10)
组别
剂量
/mg·kg － 1
神经功能评分
/分
Bcl-2
/阳性单位
模型(A) － 2. 40 ± 0. 52 10. 47 ± 1. 10
电针(B) － 1. 70 ± 0. 671) 25. 59 ± 2. 391)
刺五加总黄酮(C) 4 1. 60 ± 0. 521) 27. 48 ± 2. 751，2)
电针 +刺五加总黄酮(D) 4 1. 30 ± 0. 481) 30. 99 ± 2. 761，3，4)
假手术(E) － 0 1) 5. 43 ± 1. 031)
正常(F) － 0 1) 5. 41 ± 0. 821)
注:与 A 组比较1)P < 0. 01;与 B 组比较2)P < 0. 05，3)P < 0. 01;
与 C 组比较4)P < 0. 01。
图 1 各组大鼠脑组织 Bcl-2蛋白表达的比较(免疫组化，×400)
A.模型组;B.电针组;C.刺五加总黄酮 4 mg·kg － 1组;D.刺五加总黄
酮 4 mg·kg － 1和电针二者联合应用组;E.假手术组;F.正常组
4 讨论
Bcl-2 基因是细胞凋亡的重要调控基因，其过度
表达所致细胞凋亡受抑制，即 Bcl-2 表达产物是细胞
凋亡的强力抑制剂，亦即为凋亡信号传递系统的阻
断因子。其在各种正常细胞的激活和发育过程中表
达，而在成熟的或走向凋亡的细胞中不表达或低表
达，因而它对神经细胞的生长、发育、分化起重要的
作用。Bcl-2 抑制缺血性神经细胞损伤的可能机制:
·971·
张晓莉，等:刺五加叶总黄酮和电针对大鼠脑缺血后 Bcl-2 蛋白表达的影响
减少细胞内钙;阻断 Caspase 依赖的内在凋亡启动通
路;干扰 Bax 和 Bak 等其他 Bcl-2 家族成员的调控凋
亡功能;阻断 AIF(apoptosis-inducing factor，一种不依
赖于 Caspase 的凋亡蛋白，称凋亡诱导因子)依赖的
神经细胞凋亡通路;抗氧化应激作用［7］。
文献报道，电针可影响脑缺血后 Bcl-2 蛋白的表
达，参与抗细胞凋亡，可能通过以下机制发挥作用:
①电针可减少兴奋性氨基酸(谷氨酸和门冬氨酸)
的释放，增加对其重摄取，防止神经元内 Ca2 +超载，
从而稳定神经元的结构和功能，抑制凋亡的发生;②
在缺血性脑损伤中参与组织修复的细胞因子转化生
长因子(TGF-β1)来源于小胶质细胞和吞噬细胞，能
刺激 Bcl-2 的产生，阻止细胞凋亡［8］。
已经证实，刺五加总黄酮能减轻缺血缺氧对尼
氏体的损害，促进尼氏体的恢复，具有神经保护作
用;可上调突触素 P38、生长相关蛋白 GAP-43 的表
达，具有促进突触再建和增强、完善再建突触效能的
作用;并且刺五加总黄酮和针刺均能提高 TGF-β1 蛋
白表达，减少脑缺血区细胞凋亡的发生，尤其二者联
合应用效果更佳［2-3，9］。
本研究显示，假手术组和正常组 Bcl-2 表达较
少，模型组 Bcl-2 表达增高;经刺五加总黄酮和电针
治疗后，各组 Bcl-2 表达显著增高，与模型组比较差
异有显著性，其中电针联合中药组数值变化最为明
显。由此可见，刺五加总黄酮和电针均可能是通过
促进 Bcl-2 蛋白的表达而抑制细胞凋亡的发生，从而
发挥抗缺血性损伤的脑保护作用;同时，也说明二者
联合应用较之单独应用中药或电针更有效。
针刺与药物配伍具有协同治疗作用，可进一步
提高疗效。其机制可能是通过针刺对中药有效成分
起引导推进作用，使其多量、迅速、准确到达靶器官;
另一方面可能是通过针刺刺激靶器官大量及时表达
相应受体与药物结合。即针药相引，直达病所，对脑
缺血脑组织具有更强的保护作用［10-11］。
神经功能评分结果显示，刺五加总黄酮和电针
及其联合应用，神经功能缺失程度较模型组显著减
轻，也说明刺五加总黄酮和电针具有抗缺血性脑损
伤作用。但联合治疗组与单纯药物组和单纯电针组
比较差异无统计学意义，原因未明，尚待进一步
观察。
综上所述，刺五加总黄酮和电针均可能通过上
调 Bcl-2 蛋白的表达对脑缺血损伤起到一定的保护
作用，尤其二者相结合可提高疗效，为临床治疗脑缺
血性疾病提供了实验依据。
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［责任编辑 聂淑琴］
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第 17 卷第 5 期
2011 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 17，No. 5
Mar.，2011