全 文 ：doi10. 16473 / j. cnki. xblykx1972. 2016. 04. 024
思茅松优良无性系的聚类分析及
精英无性系特异标记
*
朱云凤1，陈少瑜1，2，郝佳波1，2，吴涛1，2
(1. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201;2. 云南省森林植物培育与开发利用重点实验室;
国家林业局开放性重点实验室云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室，云南 昆明 650201)
摘要:以 85 个思茅松优良无性系为研究对象，通过 ＲAPD分子标记方法对 85 个无性系的遗传距离进行分析，构
建 UPGMA聚类树状图，探讨 85 个无性系之间的遗传关系，为杂交亲本的选配和育种群体的多样性评价提供科
学依据;此外，针对 85 个无性系中的 33 个精英无性系进行分析，探寻其特异标记，旨在为精英无性系的分子鉴
别提供依据。研究结果表明，85 个无性系可以划分为遗传差异较明显的 3 大类群，同时发现 2 个能够区分部分
精英无性系的特异标记。
关键词:思茅松;精英无性系;遗传多样性;特异标记;ＲAPD分子标记法;UPGMA聚类树状图
中图分类号:S 791. 259 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2016)04 － 0141 － 06
Genetic Analysis of Superior Clones and Specific Marker of
Elite Clones of Pinus kesiya var. langbianensis
ZHU Yun-feng1，CHEN Shao-yun1，2，HAO Jia-bo1，2，WU Tao1，2
(1. Yunnan Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China;
2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants;Yunnan Laboratory for Conservation of Ｒare，
Endangered ＆ Endemic Forest Plants，Public Key Laboratory of the State Forestry Administration，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China)
Abstract:By collecting 85 Pinus kesiya var. langbianensis clones as materials，and using ＲAPD markers as meth-
od，the genetic distance was analyzed，and UPGMA were clustered in order to discover their genetic relationship
and provide theoretical basis for diversity evaluation of hybrids and the breeding populations;The specific markers
of 33 elite clones were also revealed for providing basis for molecular identification of elite clones． The results
showed the 85 clones could be divided into 3 groups and 2 specific markers could be used to differentiate some of
the elite clones．
Key words:Pinus kesiya var. langbianensis;superior clones;genetic diversity;specific marker;ＲAPD;UPGMA
思茅松 (Pinus kesiya var. langbianensis) ，常绿
乔木，树冠广圆形;树皮较薄，褐色，裂成龟甲状
薄块片脱落;枝条每年生长 2 至数轮;属喜温热型
气候的南亚热带松类［1］，是云南省四大用材树种
之一［2］。该树种主要分布于我国云南麻栗坡、思
茅、景东、宁洱、潞西，越南中、北部以及老挝等
地。Gaussen等认为可用于纸浆材、坑木、枕木和
采脂［3 ～ 4］，具有速生、优质、高产脂和生态适应性
第 45 卷 第 4 期
2016 年 8 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 45 No. 4
Aug. 2016
* 收稿日期:2015 － 09 － 25
基金项目:国家发改委生物育种高技术产业化专项“思茅松用材林良种高技术产业化示范与研究”项目资助的重点实验室开放项目
“思茅松用材林优良无性系分子遗传分析”。
第一作者简介:朱云凤 (1982 －) ，女，助理工程师，硕士，主要从事植物学和遗传育种方面的研究。E － mail:kji － 888@ 163. com
通讯作者简介:陈少瑜 (1968 －) ，女，研究员，博士，主要从事树木生理、林木遗传研究。E － mail:sherry9872@ 163. com
强等特点［5］。其分布面积占云南省林地面积的
11%，拥有 1 × 108m3 的蓄积量［6 ～ 7］，在区域林业
发展中占有举足轻重的地位。
本课题组进行过思茅松 DNA提取、引物筛选、
ＲAPD-PCＲ体系建立、85 个无性系的遗传多样性、
7 个居群的遗传关系分析等研究［8］。本文在此基础
上进一步分析 85 个优良无性系的遗传关系，建立
各无性系的指纹图谱。通过遗传多样性、遗传距离
以及 UPGMA聚类等的计算和分析，阐明各无性系
在分子水平上的遗传多样性和遗传变异情况，探讨
各无性系遗传关系，为进一步的杂交提供依据。并
通过对精英无性系指纹图谱特异标记的分析，探讨
区分精英无性系的特异标记，以期从分子水平上对
各精英无性系进行鉴别及早期选择，为今后的良种
选育提供分子学依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
试验材料采自云南省西双版纳自治州普文林场
内的思茅松优树汇集区［8］。85 个思茅松无性系中
包含有 33 个精英无性系，它们是通过半同胞子代
测定，根据国家标准 GB10013 88 评选出的精英家
系的母株［9］。这 85 个优良无性系分别来自 7 个天
然居群，它们分别是景东者后、墨江通关永马、思
茅蔓歇坝和思茅木乃河、景谷碧安、普洱一工段、
普洱二工段。居群编号、各居群对应无性系号、居
群所在地以及无性系数量见表 1。
1. 2 方法
DNA提取、ＲAPD-PCＲ 扩增、引物筛选以及
扩增结果电泳等采用的方法可详见论文［8］，具体
为采用 Solarbio 试剂盒提取思茅松基因组 DNA 后，
通过初筛和复筛，从 120 条引物中筛选出稳定性
强、多态性高的引物用于所有样品的 ＲAPD-PCＲ
扩增，用筛选出的引物在最佳反应体系和热反应程
序下对所有无性系样本进行 ＲAPD-PCＲ 扩增，通
过琼脂糖凝胶电泳检测，照相，记录结果。
本文 在 前 文 的 基 础 上 用 POPGENE32 和
MEGA2 对 85 个无性系的遗传关系进行聚类，并采
用相关分析的方法探寻 33 个精英无性系的特异标
记。通过对精英无性系指纹图谱的比较，寻找能够
将部分精英无性系和其它无性系区分开的的特异标
记，引物及其特异标记位点的分析为优良无性系的
分子标记鉴别提供依据。
表 1 85 个优良无性系及来源
Tab. 1 Pinus kesiya var. langbianensis superior
clones from different provenances
居群
编号
无性系号 居群所在地
无性
系数
1 1-1，1-2……1-18，1-19 思茅曼歇坝 19
2 2-1，2-2……2-12，1-13 景东者后 13
3 3-1，3-2 普洱二工段 2
4 4-1，5-2……4-12，4-13 景谷碧安 13
5 5-1，5-2……5-15，5-16 墨江通关永马 16
6 6-1，6-2……6-8，6-9 思茅木乃河 9
7 7-1，7-2……7-12，7-13 普洱一工段 13
相关分析的具体方法为:将 85 个无性系中的
精英无性系记为 “1”，其它无性系记为 “0”，然
后用软件将该“0、1”数列与 85 个无性系每一个
引物下的每一个位点的 “0、1”数列分别进行相
关分析，探寻与精英无性系相关的标记。
1. 3 数据统计与分析
试验数据的计算分析及作图采用 Excel 2003，
相关数据的相关性分析采用 SPSS 19. 0 进行。
2 结果与分析
2. 1 85 个思茅松无性系的遗传关系
用 POPGENE32 软件对由 85 个无性系样本的
所有条带的 “0、1”矩阵进行分析，得到样本间
的遗传距离 I和 Nei’s 遗传一致度 D。结果显示这
85 个无性系之间的遗传距离范围是 0. 051 3 ～
0. 679 9。其中遗传距离最近的是景谷碧安居群的
第 6 号和第 7 号无性系，遗传距离最远的是思茅曼
歇坝居群的第 16 号无性系和思茅木乃河居群的第
9 号无性系。
基于遗传距离 I绘制聚类图 (见图 1)。从图 1
中可以看出各无性系之间的遗传关系。结果显示，
在遗传距离约 0. 59 以上，85 个无性系大致可分为
3 个类群，其中类群Ⅰ主要由来自居群 4、居群 5
和居群 6 的无性系组成;类群Ⅱ主要由来自居群 7
的无性系组成;类群Ⅲ在遗传距离约 0. 56 以上，
又可分为 3 个亚类群，其中亚类群Ⅲ － A主要由来
自居群 2 和居群 4 的无性系组成，Ⅲ － B 主要由来
自居群 1 和居群 2 的无性系组成，Ⅲ － C 主要由来
自居群 1、居群 2、居群 4、居群 5 和居群 7 的无性
系组成。
241 西 部 林 业 科 学 2016 年
图 1 85 个无性系的 ＲAPD标记的聚类分析树状图
Fig. 1 Dendrogram of ＲAPD markers of 85 clones
341第 4 期 朱云凤等:思茅松优良无性系的聚类分析及精英无性系特异标记
2. 2 关于精英无性系的特异标记
2. 2. 1 相关分析
用 SPSS软件进行相关分析后共发现 21 个相关
显著性水平小于 0. 05 的位点 (见表 2)。表 2 表明
仅 21 个位点与是否为精英无性系存在相关关系，
但是这 21 个位点对应的相关系数的最大绝对值仅
0. 387，众所周知，相关系数的绝对值在 0. 3 ～ 0. 5
之间仅属于低度相关，因此本次试验所得的标记都
难以有效区分全部精英无性系。
表 2 基于 0. 05 显著性水平的相关分析
Tab. 2 Analysis of relationship of significance
level based on 0. 05
引物 位点 /bp 相关系数 显著性水平
F09 850 0. 234 0. 031
F09 750 － 0. 279 0. 010
F09 450 － 0. 355 0. 001
C15 450 0. 322 0. 003
C15 300 0. 387 0. 000
A07 1 300 － 0. 224 0. 040
A17 1 200 － 0. 307 0. 004
A17 650 0. 312 0. 004
A17 300 0. 288 0. 008
B11 1 300 0. 288 0. 007
B11 1 100 － 0. 232 0. 032
B12 650 － 0. 232 0. 033
B12 400 － 0. 279 0. 010
B20 600 － 0. 335 0. 002
B20 500 － 0. 298 0. 006
C06 1 100 － 0. 214 0. 049
C11 2 000 － 0. 228 0. 036
C11 200 0. 322 0. 003
C13 600 － 0. 234 0. 031
C13 350 0. 241 0. 026
D15 350 0. 232 0. 033
2. 2. 2 部分区分的特异标记
在对所有的思茅松无性系指纹图谱仔细地对比
研究后发现 2 个反向标记，即有条带为其它无性
系，无条带为某些精英无性系。它们分别是在复性
温度 37℃ 和实验所选的最佳反应体系条件下
(20μL 体系:20 ～ 60ngDNA 模板 1. 0uL，10μM 引
物 1. 0μL，2 × Taq PCＲ MasterMix 10μL，无菌 dd
H2O 8. 0μL) ，利用引物 B12 (CCTTGACGCA)能
够将精英无性系 1-5、1-6、1-8 和 1-9 与其它无性
系区分开;而利用引物 F09 (CCAAGCTTCC)能够
将精英无性系 5-9、6-2、6-3 和 6-4 与其它无性系
区分开。具体的特异标记见表 3 和图 2 和图 3
(“1”表示有条带，“0”表示无条带)。
表 3 精英无性系的特异标记
Tab. 3 Specific marker of elite clones
引
物
特异标记
位点 /bp
可区分精
英无性系
精英无
性系
其它无
性系
B12 400 1-5、1-6、1-8、1-9 0 1
F09 750 5-9、6-2、6-3、6-4 0 1
图 2 基于引物 B12 的特异标记
Fig. 2 Specific markers on primer B12
图 3 基于引物 F09 的特异标记
Fig. 3 Specific markers on primer F09
3 结论与讨论
3. 1 遗传关系可为进一步的杂交提供依据
由图 1 可知，大多数来自相同居群的无性系聚
在了一起，这是因为同一居群内的思茅松由于空间
距离较近，因此其基因交流也较为频繁，所以这些
无性系具有较小的遗传差异，亲缘关系较近。
441 西 部 林 业 科 学 2016 年
但是也有少部分来自不同居群的无性系聚在了
一起，这表明不同居群的无性系也存在亲缘关系较
近的情况，这可能与各无性系所在的天然居群之间
存在一定程度的基因交流有关。通过地图查询可
知，本次研究的 7 个居群均位于普洱市，且两个相
邻居群间的直线距离最多不超过 100km，考虑到思
茅松的繁育系统特点，如风媒传粉距离较远，种子
的可食用性，其散布可依赖动物或人类的活动，因
此相隔一定距离的不同居群间存在一定程度的基因
交流。其中，居群 1 和 7 中的无性系较多地聚在了
一起，因此可以推测，居群 1 和 7 之间基因交流相
对较频繁，而从空间距离来看，这两个居群所在行
政区的空间直线距离也不超过 20km。另外虽然居
群 3 和空间 7，居群 1 和 6 均地处同一行政区，但
是它们远不如居群 1 和 7 聚在一起的无性系多。这
可能是由居群间的空间障碍造成的，如山川河流公
路等在一定程度上阻碍了两个居群间的基因交流。
由图 1 可以看出各无性系之间的遗传关系，并
将 85 个无性系分为 3 个类群。依据此关系可以为
育种时杂交亲本的选配提供参考。例如，当根据需
要选择无性系 6-9 作为杂交的父本材料时，根据远
交优势的原理［10］，在选择与之杂交的母本时，就
应该选择与无性系 6-9 遗传距离尽可能远的无性
系，即类群Ⅲ内的各无性系，这样杂交之后得到优
秀子代的可能性将会更大。
3. 2 精英无性系特异标记研究将为其分子鉴别提
供依据
常规的选育技术在林业研究和生产中周期较
长、成本较高，因此由于能够缩短选育周期、降低
选育成本、提高选育效率，分子标记辅助选择的应
用越来越广泛［11］。ＲAPD 标记技术因其操作简便、
反应迅速、成本低和 DNA 用量少等优点在动植物
和微生物的遗传多样性检测、品种鉴定、基因定
位、构建基因指纹图谱、亲缘关系分析和系统进化
等方面被广泛应用［12 ～ 13］。应用时主要是利用多个
不同引物的 ＲAPD-PCＲ 反应来寻找鉴别良种的特
异性条带，即特异标记或特异片段。例如张海霞等
2006 年发现了与黄瓜抗枯萎病相关的 ＲAPD 特异
片段为 S49 －300，其 引 物 碱 基 序 列 为 CTCTG-
GAGAC，重组率为 12. 5%［14］，此外其它文献也都
发现了可以进行良种鉴别的特异片段［15 ～ 20］。
本研究未发现较为理想的能够区分精英无性系
的特异标记。但是用引物 B12 (CCTTGACGCA)
对样本进行 ＲAPD-PCＲ 反应，若结果在 400bp 处
有条带则表明样本为普通无性系，若无条带，则表
明样本为精英无性系 1-5、1-6、1-8 或 1-9 中的 1
个;用引物 F09 (CCAAGCTTCC)对样本进行
ＲAPD-PCＲ反应，若结果在 750bp处有条带则表明
样本为普通无性系，若无条带，则表明样本为精英
无性系 5-9、6-2、6-3 或 6-4 中的 1 个。这可以为
精英无性系的鉴定和早期选择提供一些分子水平的
借鉴。而理想的特异标记还有待进一步通过更多的
ＲAPD引物筛选，其它分子标记手段或基因测序等
方法来进行专门的研究。
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