全 文 ：［文章编号］ 1000-4718(2014)03-0509-05
［收稿日期］2013-10-27 ［修回日期］2014-01-10
* ［基金项目］科技部专项技术基金资助项目 (No． 2006AA02Z4D8)
△通讯作者 Tel:020-38688502;E-mail:yin-yun@ 126． com
雪胆素乙诱导刀豆蛋白 A刺激的小鼠淋巴细胞凋亡
及其机制的研究*
胡 波1， 施资坚1， 王 遥2， 刘坤鹏2， 潘 浩2， 尹良红1△
(暨南大学 1附属第一医院肾内科，2生命科学技术学院免疫生物学系，广东 广州 510632)
［摘 要］ 目的:分析雪胆素乙(CuIIb)对刀豆蛋白 A(Con A)刺激的小鼠淋巴细胞体外凋亡的影响，并探讨
其作用机制。方法:以 Annexin V染色结合流式细胞术分析小鼠淋巴细胞凋亡情况;利用 JC-1 染色分析淋巴细胞
线粒体膜电位变化;Western blotting检测凋亡相关蛋白变化。结果:CuIIb 处理后，早期和中期凋亡细胞比例明显
增加，淋巴细胞线粒体膜电位降低。同时，CuIIb 以剂量依赖方式激活 caspase-3 凋亡通路并明显降低抗凋亡蛋白
survivin的表达。结论:CuIIb诱导淋巴细胞凋亡，其机制可能与其降低线粒体膜电位、激活 caspase-3 凋亡通路
有关。
［关键词］ 雪胆素乙;淋巴细胞;刀豆蛋白 A
［中图分类号］ Ｒ363 ［文献标志码］ A doi:10． 3969 / j． issn． 1000-4718． 2014． 03． 021
Cucurbitacin IIb induces apoptosis of concanavalin A-activated mouse
lymphocytes
HU Bo1，SHI Zi-jian，WANG Yao2，LIU Kun-peng2，PAN Hao2，YIN Liang-hong1
(1Department of Nephrology，The First Affiliated Hospital，2Department of Immunobiology and Department of Cell Biology，
College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510630，China． E-mail:yin-yun@126． com)
［ABSTＲACT］ AIM:To explore the potential anti-inflammatory effect and the underlying mechanism of cucurbita-
cin II b (CuIIb)on concanavalin A (Con A)-activated mouse lymphocytes． METHODS:The cell apoptosis was analyzed
by flow cytometry with Annexin V staining． The change of mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 staining．
The levels of caspase-3，phosphorylated H2AX and survivin were detected by Western blotting． ＲESULTS:Compared
with Con A-activated lymphocytes，the significant increases in the proportion of the cells with reduced mitochondrial mem-
brane potential or with increased Annexin V staining were observed，reflecting increased apoptosis in CuIIb plus Con A-
treated cells． The increased levels of activated caspase-3 and phosphorylated H2AX (a marker of double-stranded DNA
breaks)were manifested in Con A-activated cells co-treated with CuIIb． Although only a slight difference of cleavage of po-
ly(ADP-ribose)polymerase was found in the cells with or without CuIIb treatment，the expression of survivin，an inhibitor
of apoptosis protein，was markedly reduced by CuIIb in Con A-activated cells． CONCLUSION:CuIIb promotes apoptosis
in mouse lymphocytes．
［KEY WOＲDS］ Cucurbitacin II b;Lymphocytes;Concanavalin A
雪胆素乙(cucurbitacin II b，CuIIb)是从葫芦科
雪胆属植物雪胆(Hemsleya amalils Diels)中提取的一
种四环三萜类化合物，是葫芦素家族的一个成员，化
学名为 23，24-双氢葫芦素 F［1］。自古以来，我国西南
各民族用雪胆治疗菌痢、肠炎、支气管炎、急性扁桃
体炎等炎症相关疾病。作为民族药，其具有清热解
毒、抗菌消炎的功效［2-3］。雪胆块根中提取物制备为
雪胆素片(含雪胆素甲和乙)已在临床用于治疗菌痢
和肠炎等疾病，但其抗炎作用的机制尚不清楚。前
文以刀豆蛋白 A(concanavalin A，Con A)激活的小鼠
淋巴细胞为模型［4］，发现 CuIIb能有效影响淋巴细胞
体外活化、增殖以及炎症因子的表达，但分子机制仍
·905·中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2014，30(3):509-513
有待进一步研究。本研究以体外活化的小鼠淋巴细
胞为模型，分析了 CuIIb对活化小鼠淋巴细胞凋亡的
影响，探讨其作用机制。
材 料 和 方 法
1 材料
清洁级 BALB /c 小鼠，雌性，6 ～ 8 周龄，体质量
(20 ± 2)g，购自南方医科大学实验动物中心。CuIIb
(纯度 98%)，购自上海顺勃生物技术公司。Con A
和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自 Sigma-
Aldrich。ＲPMI-1640、胎牛血清(fetal bovine serum，
FBS)、L-谷氨酰胺和 β-巯基乙醇购自 Gibco / Invitro-
gen。5，5，6，6-tetrachloro-1，1，3，3-tetraethyl-benz-
imidazolcarbocyanine iodide (JC-1)和 ＲNase A 购自
Carlsbad。Annexin V-PE 凋亡检测试剂盒购自 Bec-
ton Dickinson。CuⅡb 用 DMSO 配制成 0． 02 mol /L
的储存液，－ 20 ℃保存待用。半胱氨酸天冬氨酸蛋
白酶 3 (caspase-3)、DNA双键断裂标志物 H2AX(γ-
H2AX)、多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶［poly-(ADP-
ribose)polymerase，PAＲP］、Bcl-2、survivin 等抗体均
购自 Cell Signaling。
2 方法
2． 1 小鼠淋巴细胞分离培养 颈髓脱臼处死小鼠，
无菌分离小鼠颈部、腋下以及腹股沟淋巴结，置于盛
有预冷的 PBS的无菌平皿中，除去被膜，以 200 目尼
龙网滤过，收集的细胞用 PBS洗涤 2 遍(1 500 r /min
离心 5 min)，用 ＲPMI-1640 完全培养基(25 mmol /L
L-谷氨酰胺、1 × 105 U /L 青霉素、100 mg /L 链霉素、
50 μmol /L β-巯基乙醇和 10% FBS)调整细胞密度
为 2 × 109 /L，接种于 24 孔板中(每孔 500 μL)在 37
℃、5% CO2 条件下培养。
2． 2 Annexin V-PE染色 收集不同浓度 CuIIb 处理
24 h的淋巴细胞，用冷 PBS 洗 2 次，将细胞重悬于
100 μL 1 ×结合缓冲液，加入 5 μL Annexin V-PE 和
5 μL 7-AAD，25℃ 避光放置 15 min，再加入 300 μL
的结合缓冲液，立即上机分析。
2． 3 JC-1 染色检测线粒体膜电位 各实验组培养
24 和 48 h 后，离心收集细胞，弃上清，用 500 μL 培
养基重悬细胞，加入 500 μL JC-1 工作液，JC-1 终浓
度为 2． 5 mg /L，细胞培养箱中 37 ℃ 避光孵育 20
min，离心，弃上清，冷 PBS 洗涤 2 次，再加入冷 PBS
300 μL，重悬细胞，上流式细胞仪检测。
2． 4 免疫印迹 收集 CuIIb(5 和 10 μmol /L)处理
24 h的小鼠淋巴细胞，用 ＲIPA 裂解细胞获得总蛋
白［5］，随后取适量样品应用 BCA 试剂盒测量蛋白浓
度。配制 SDS-PAGE 胶，每个样品上样 40 μg 蛋白，
电泳后转移蛋白至 PVDF 膜。将膜转置 5%脱脂牛
奶室温封闭 1 ～ 2 h，TBS + Tween 洗膜 3 × 5 min。加
入以 5% BSA 稀释的 I抗，置 4 ℃摇床过夜。洗膜后
再分别与相应的 II抗(5% 脱脂牛奶稀释)室温孵育
1 h，洗膜 3 次。最后用 BeyoECL Plus 化学发光试剂
盒(碧云天)显色，X 光片感光显影，FluorChem 800
(Alpha Innotech)成像仪记录结果并以 Alpha EASE
FC软件分析结果。
3 统计学处理
数据以均数 ±标准差(mean ± SD)，用 GraphPad
Prism 4． 0 软件进行单因素方差分析，组间比较采用
Newman-Keuls检验，以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意
义。
结 果
1 CuIIb引起活化的淋巴细胞凋亡
流式细胞术分析结果见图 1，Con A 刺激组凋亡
细胞比例为 39． 92%，明显低于对照组;而 2． 5、5 和
10 μmol /L CuIIb 均能明显增加凋亡细胞比例，与
Con A组相比差异明显，并具有剂量依赖性。
2 CuIIb对小鼠淋巴细胞线粒体膜电位的影响
线粒体膜电位结果见图 2，CoA组线粒体膜电位
明显低于对照组 (P ＜ 0． 01);而与 Con A 组
(37. 96%)相比，Con A + 10 μmol /L CuIIb 组线粒体
膜电位(45． 29%)显著上升 (P ＜ 0． 05)，而 CuIIb 浓
度度为 2． 5 和 5 μmol /L 时线粒体膜电位与 CoA 组
差异不显著。
3 CuIIb促进小鼠淋巴细胞 caspase-3 的活化
免疫印迹结果表明(图 3)，药物作用 24 h 后，10
μmol /L CuIIb 能够明显促进 caspase-3 活化(即产生
cleaved caspase-3)和 γ-H2AX水平升高，表明在激活
的淋巴细胞内，雪胆素乙诱导了 DNA 损伤。另外，
PAＲP上升幅度不高，抗凋亡蛋白 Bcl-2 未受雪胆素
乙处理的影响，而细胞周期调控的凋亡抑制蛋白 sur-
vivin水平显著下调。这些结果表明，雪胆素乙通过
诱导 DNA损伤、抑制 survivin表达来促进细胞凋亡。
·015·
Figure 1． CuIIb induced apoptosis of Con A-stimulated mouse lymphocytes． Mean ± SD． n = 3． ##P ＜ 0. 01 vs control group;＊＊P ＜
0. 01 vs Con A group．
图 1 CuIIb引起活化的小鼠淋巴细胞凋亡
Figure 2． CuIIb induced cell apoptosis with reduced mitochondral membrane potential in Con A-stimulated mouse lymphocytes． Mean ±
SD． n = 3． ##P ＜ 0． 01 vs control group;* P ＜ 0． 05 vs Con A group．
图 2 CuIIb对小鼠淋巴细胞线粒体膜电位的影响
·115·
Figure 3． Effects of CuIIb on the levels of cleaved caspase-3，PAＲP，phosphorylated H2AX (γ-H2AX)，Bcl-2 and survivin in Con
A-stimulated lymphocytes． Mean ± SD． n = 3． ##P ＜ 0． 01 vs control group;* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01 vs Con A group．
图 3 CuIIb对小鼠淋巴细胞凋亡相关蛋白及 survivin表达的影响
讨 论
淋巴细胞在适应性免疫应答中发挥核心作用，
淋巴细胞的活化、增殖及促炎因子的释放等细胞行
为是免疫应答的基础和关键事件，在免疫防御、免疫
调节、炎症发生及自身免疫疾病中都发挥重要作用。
本研究表明 CuIIb能够诱导 T淋巴细胞凋亡，并可能
与 CuIIb以剂量依赖方式影响凋亡相关蛋白的表达
有关，提示 CuIIb抗炎可能与其诱导淋巴细胞凋亡有
关。
Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，能直接
抑制 caspase-3 和 caspase-7 的活性，阻断细胞的凋亡
过程。目前研究认为可能是通过以下途径实现的:
survivin能与激活的 caspase-3 和 caspase-7 结合，阻
止由 caspase 激活剂或凋亡诱导剂诱导的细胞
DEVD-cleaving自杀酶的积累，抑制了 caspase 的级
联反应，从而阻止肿瘤细胞凋亡［6］;survivin 也可通
过 p21 间接抑制 caspase，其机制可能为 survivin 与
细胞周期调控因子 CDK4 形成 survivin-CDK4 复合
体，使得 p21 从 CDK4 的复合体中释放出来，p21 进
一步与线粒体 caspase-3 结合，抑制其活性，阻止细
胞凋亡［7］。我们的结果显示在 Con A 刺激活化的 T
淋巴细胞中，雪胆素乙处理后，淋巴细胞抗凋亡蛋白
survivin的下调，促使 caspase-3 从复合体中释放，从
而进一步提高其活化水平，促进了细胞的凋亡。
线粒体在诱导细胞凋亡中的作用已经被证
实［8-10］。在特定凋亡诱导环境中，线粒体膜电位水平
下调，导致膜通透性增加，启动凋亡相关的细胞色素
C释放［11］，线粒体膜电位水平下调与线粒体依赖性
的早期凋亡相关。另外，当 DNA损伤发生，H2AX被
快速磷酸化，并招募其它修复因子聚集在损伤部位，
因此被作为 DNA双链断裂的标志 ［12-13］。本文结果
显示雪胆素乙处理细胞后会提高 DNA 双键断裂标
志物 γ-H2AX的水平，表明在淋巴细胞中，雪胆素乙
诱导细胞凋亡是通过刺激 DNA 双键断裂来实现的。
同时，体外培养的淋巴细胞会发生自发性凋亡，因此
·215·
未经 Con A刺激的淋巴细胞也表达较高水平的活化
caspase-3 和 PAＲP。Con A刺激可使淋巴细胞增殖，
因此 ConA的刺激降低了淋巴细胞的自发凋亡。
综上所述，CuIIb 能够明显促进体外培养 Con A
活化的小鼠淋巴细胞凋亡，并通过 CuIIb剂量依赖方
式激活 caspase-3 凋亡通路并下调抗凋亡蛋白 sur-
vivin表达。
［参 考 文 献］
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