全 文 ：研究简报
复苏的不同条件对条斑紫菜细胞活性的影响
沈颂东　戴继勋
(青岛海洋大学海洋生命学院 ,青岛 , 266003)
摘　要　对冷藏的条斑紫菜叶状体在不同光照和温度条件下进行复苏实验。复苏的紫菜经海螺酶解
离成为单细胞 ,通过染色检查其细胞活性并且将单细胞培养于适宜的条件下 ,观察其生长和发育状
况 ,以了解不同复苏条件对冷藏叶状体细胞生理状态的恢复程度。 结果表明: ( 1) 光照不是复苏的必
要条件 ; ( 2)温度对复苏很重要 , 25℃是条斑紫菜的致死复苏温度 , 10°～ 20℃是适宜的复苏温度。 ( 3)
复苏时间随温度升高而减少。在 10℃的消毒海水中 ,至少需经历 2d,才能达到完全复苏 ; 15℃需 1. 5d;
20℃需 1d; 23℃复苏时间可减少到 12h。复苏主要是细胞吸水膨胀的过程 ,海水中已经存在足够的营
养元素 ,紫菜细胞在一定的温度下复苏一段时间后 ,细胞活性恢复 ,酶解后细胞死亡率低 ,酶解后存
活的单细胞在适当培养条件下 ,几乎可以全部发育成苗。生产上可以选择在较高温度下 ,短时间复苏
即可大量出苗 ,实现生产上早出苗的目的。
关键词　条斑紫菜 ;复苏 ;细胞活性 ;发育
中图法分类号　 Q178. 53; Q343　　　文章编号　 1001-1862( 2000) 02-292-05
条斑紫菜是我国北方海域主要的养殖品种 ,传统的育苗方式是以丝状体培养产生孢子囊
枝 ,放散壳孢子下海养殖成商品紫菜。 但因丝状体培养周期长 ,易染病 ,需要大量的人力物
力 [1 ]。海螺酶的提取和使用 ,使从紫菜叶状体中大量获得单细胞和原生质体成为可能 [2 ]。而且
通过大量研究 ,发现坛紫菜和条斑紫菜的单个营养细胞可以再生成苗 [ 3, 4] ,并且对培养条件进
行了大量的探索 ,形成了一整套较完备的技术路线。 方宗熙、戴继勋等 ( 1986) [5 ] ,戴继勋
( 1988) [6 ] ,王素娟 ( 1987) [7 ]等人率先提出紫菜的酶法育苗这一全新的育苗方式。其原理是利用
植物细胞的全能性 ,对紫菜叶状体酶解产生单细胞 ,使其附着于网绳上在海里养殖 ,不经过丝
状体培养这个阶段 ,极大地缩短了育苗周期 ,简化了育苗工艺。而且利用单细胞克隆育苗所产
生的后代为纯系 ,有利于优良性状的保持。
冻藏后的紫菜为恢复其活性 ,要在一定温度的海水中复苏一段时间。赵焕登等 ( 1984) [4 ]提
出在室温下复苏 24h,严兴洪等 ( 1990) [8 ]提出在海水中复苏 7d。为了使冻藏紫菜恢复到最佳状
态 ,我们对不同光照和温度等条件下进行了研究 ,以便为紫菜酶法育苗的生产应用提供依据。
1　材料与方法
1. 1材料　　条斑紫菜 (Porphyra yezoensis ) 1998年 2月 10日采自山东省日照市岚山的养殖
第 30卷　第 2期　　
2000年 4月　　 　
青岛 海洋 大 学学 报
JOU RN AL OF OCEAN UNIVERSI TY OF Q INGDAO　
　 30( 2): 292～ 296
　　 April , 2000　
教育部博士学科点专项科研基金课题 ( 98042303)和“九五攻关”项目 ( 96-C01-05-01)资助
收稿日期: 1999-08-20;修订日期: 1999-11-30
沈颂东 ,男 , 1968年 7月出生 ,博士生。
网帘上。挑选新鲜的条斑紫菜幼嫩叶状体 ,阴干后冷藏于 - 20℃冰箱中。于 1999年 4月进行
实验。
1. 2方法　　取冻藏后的叶状体少许 ,分别置于装有 500mL经 10℃预冷的消毒海水的三角瓶
中 ,分别置于不同的温度和光照条件下复苏 ,具体处理见表 1
　　　　表 1. 冻存条斑紫菜的复苏处理
　　 Table 1. Recover treatm ent s w ith f ro zen nori.
序号 温度 (℃ ) 复苏时间 ( h) 光照
Num ber Temperatu re Recover tim e Light
1 - 20 0 - - -
2 10 3～ 96 Dark
3 10 3～ 96 Light
4 15 3～ 96 Dark
5 15 3～ 96 Light
6 20 3～ 96 12D: 12L
7 21 3～ 96 12D: 12L
8 23 3～ 96 12D: 12L
9 25 3～ 96 12D: 12L
　
　　经不同复苏处理后 ,挑选一片健康完整
的叶状体 ,剪成大小为 1mm2的小块 ,于添加
2mol /L葡萄糖的 1%海螺酶中酶解 1h ,此时
镜检发现叶片边缘 5～ 8列细胞松动。用消毒
海水冲洗去酶液 ,单细胞经 400目筛绢过滤
下来 ,置培养皿中统计具有完整细胞形态的
细胞个数 ,记为初始细胞数。单细胞培养于
20℃恒温光照培养箱中 ,光照强度 2000Lux ,
光周期 12D: 12L。次日统计 10个视野中的细
胞个数 ,记为初始培养密度。每日观察形成多
细胞团的数目、大小与直接成苗的数目、大
小 ,计算出苗率。 另外 ,还观察苗及多细胞团
的细胞数目。培养 10d后 ,再统计 10个视野
中已发育成苗或多细胞团的个体数 ,记为存活细胞数 ,计算细胞存活率。
细胞存活率= 存活细胞数× 100 /初始细胞数。
出苗率= 直接成苗数× 100 /存活细胞数
2　结果
2. 1未复苏紫菜的细胞存活率　　 1#处理 ,选择- 20℃冷藏的条斑紫菜少许 ,不经复苏处理 ,
直接酶解收集单细胞 ,制成悬液于显微镜下观察 ,发现全部细胞颜色绿 ,细胞内色素弥散 ,见不
到任何细胞器形态。用 1%中性红染色 ,细胞均不着色 ,而用 0. 5%伊文斯兰染色 ,则全部染兰 ,
说明所有的细胞均是死细胞。单细胞在适当的培养条件下培养 ,第 2日即有半数细胞解体 ,第
4日全部细胞解体 ,因而细胞的存活率为零。
2. 2光照对细胞存活率的影响　　本文选择 15℃和 20℃分别设置了连续光照和连续黑暗条
件下条斑紫菜的复苏对照。 结果见图 1。
　　由图 1可以发现 ,在同一温度下 ,光照和黑暗中复苏后细胞存活率曲线交织在一起 ,表明
相同的复苏时间下无论有无光照 ,细胞存活率基本上一致 ,说明光照对复苏过程不是必要的。
2. 3温度对酶解后细胞存活率的影响　　选择 10℃、 15℃、 20℃、 21℃、 23℃、 25℃这 6个温度
梯度进行复苏处理 ,结果见图 2。
　　由图 2可见 ,温度对紫菜细胞的影响最大 ,随着温度的升高 ,紫菜的复苏时间越短。10℃要
经过 2d以上才能达到最大存活率 , 15℃要经过 1. 5d以上 , 20℃只需 1d即可 , 23℃仅要半天 ,
25℃条件下复苏 6h ,即可形成存活率的峰值。但在 25℃下 ,最大存活率也只及 20℃最大存活
率的一半 ,说明 25℃是条斑紫菜的致死温度。
2932期 沈颂东 ,等:复苏的不同条件对条斑紫菜细胞活性的影响
　图 1　光照对复苏的影响
　 Fig. 1　 Ef fects o f light to
　　　　　 no ri recovery
　　　　图 2　温度对复苏的影响
　　　 Fig. 2　 Effects of tempe ratur e
　　　　　　　　 to no ri recover y
3　讨论
复苏是指冷藏藻体在一定温度下 ,用适宜的海水浸泡 ,使其温度从 - 20℃的低温逐渐升高
的同时使海水渗入 ,恢复细胞内各细胞器的正常生理状态 ,维持生命的动态平衡。 由于种藻保
存之前须经阴干处理 ,致使体内含水量仅剩下 30% ～ 40% ,水份严重不足是抑制生命活动的
重要因素 ,同时低温又大大降低了代谢速率 ,因而冷藏紫菜可以保存几年而保持其生理活性。
本文认为复苏首先是一个恢复细胞的正常渗透压过程。温度对代谢的快慢有一定的影响 ,当种
藻体内水份达到 80%以上 ,温度又适合时 ,其生化反应才得以恢复 ,导致细胞色素恢复 ,色素
体清晰 ,只有这时光合作用才得以进行下去。而在完全复苏之前 ,光照的有无对于细胞活性并
不产生影响。本文的实验结果显示 72h之前 ,在 10℃和 20℃下 光照和黑暗条件下复苏没有明
显的差异 ;但在 72h之后 ,经光照的细胞存活率有一定的上升 ,而且开始分裂的时间至少提前
一天以上。
关于复苏紫菜前人做了大量的研究 ,但确定温度的仅见王素娟等 ( 1987) [ 7]一篇文献 ,采用
的是 20℃下 ,用消毒海水复苏 4天后酶解。其余均报道用室温 ,但南北方室温差别较大 ,由于
研究者四季皆开展工作 ,室温可从 0～ 30℃变化很大 ,即使酶法育苗只在秋季进行 ,室温也可
从 15～ 25℃的变化 ,因而本文确定最佳复苏温度为 10°～ 20℃也有较大的意义。 对于复苏溶
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液 ,前人除王志勇等 ( 1996) [9 ]用的是添加 N、 P的过滤海水 (但未说明使用 N、 P的浓度 )其余
均采用消毒海水 ,由于海水中已具有多种营养元素 ,对恢复冷藏紫菜的正常生理活性已经足
够 ,因而不必再添加营养盐。
关于复苏时间 ,赵焕登等 ( 1984) [4 ]采用 1d复苏 ,王素娟等 ( 1986) [10 ]用 2d,王志勇等
( 1996) [9 ]用 2～ 3d,何培民等 ( 1991) [11 ]用 3d,王素娟等 ( 1987) [7 ] 4d,严兴洪等 ( 1990) [8 ] 7d,时间
相差很大。 本文提出在不同温度下达到完全复苏的时间不同 ,在 10℃下 2d可以完全复苏 ,
20℃下 1d即可 ,超过 20℃复苏时间应更短。由于秋初海水温度仍高于 20℃ ,在复苏冷藏的种
藻时应该充分考虑复苏时的温度 ,找出适当的复苏时间。在实验室中可以采用降温的方式使复
苏温度控制在 20℃左右 ;在生产中可以采用 23℃下复苏 12～ 18h,既可保证绝大多数细胞复
苏 ,又可缩短育苗时间 ,争取早下海 ,早出苗。
参考文献
1　黄海水产研究所紫菜组编 . 坛紫菜与条斑紫菜养殖 . [M ]北京:农业出版社 , 1979
2　唐延林 . 紫菜营养细胞和原生质体的分离与培养 . [ J]山东海洋学院学报 , 1982, 12( 4): 37～ 50
3　赵焕登 ,张学成 . 条斑紫菜营养细胞的分离与培养 . [ J]山东海洋学院学报 , 1981, 11( 1): 61～ 65
4　赵焕登 ,张学成 . 条斑紫菜营养细胞的分离培养和实验 . [ J]水产学报 , 1984, 8: 197～ 202
5　方宗熙 ,戴继勋 ,唐延林 ,等 . 紫菜细胞的酶法分离和在水产养殖中的应用 . [ J ]海洋科学 , 1986, 10( 3) : 46～ 47
6　戴继勋 ,包振民 ,唐延林 ,等 . 紫菜叶状体细胞的酶法分离及其养殖研究 . [ J ]生物工程学报 , 1988, 4( 2): 133～ 137
7　王素娟 ,孙云龙 ,路安明 ,等 . 坛紫菜营养细胞和原生质体培养的研究Ⅱ .直接育苗下海养殖的研究 . [ J]海洋科学 ,
1987, 11( 1): 1～ 7
8　严兴洪 ,王素娟 . 秋水仙素对坛紫菜体细胞苗生长发育的影响 . [ J ]海洋科学 1990, 14( 6): 28～ 32
9　王志勇 ,黄世玉 ,陈　为 ,等 . 坛紫菜叶状体营养细胞的固体培养 . [ J ]厦门水产学院学报 , 1996, 18( 1): 1～ 8
10　王素娟 ,张小平 ,徐志东 ,等 . 坛紫菜营养细胞和原生质体培养的研究Ⅰ . [ J]海洋与湖沼 , 1986, 17( 3): 217～ 221
11　何培民、王素娟 . 外界条件对条斑紫菜体细胞分化发育的影响 . [ J ]海洋科学 , 1991, 16( 4): 61～ 65
2952期 沈颂东 ,等:复苏的不同条件对条斑紫菜细胞活性的影响
The Study of Cell Viability of Porphyra yezoensis
with Various Recover Treatments
Shen Songdong　 Dai Jixun
(College of Marine Lif e Sciences , Ocean University of Qingdao ,Qingdao, 266003)
Abstract　 The preserv ed frozen thal li of Porphyra yezoensis were recovered in dif ferent
light and temperature conditions. The recovered thalli w ere iso lated into single cells by
sea snail enzyme. Cell viability was measured wi th the method o f Evans Blue and
Neutral Red dye. The cel ls w ere cultured under the same condi tion. The grow th and
development of cells w ere checked everyday , in o rder to investigate the recovery lev els
under di fferent recovery condi tions. It w as indica ted that: ( 1 ) light w as not the
necessary requirement of the recovery; ( 2) temperature w as very important, 25℃ was
the lethal temperature o f recovery , 10- 20℃ was sui table; ( 3) recovery time w as
decreased w ith rising temperature. It took a t least 2 days a t 10℃ in the recovery
medium to a ttain enti re recovery; 15℃ , 1. 5 days; 20℃ , 1 day. When the recovery
temperature w as 23℃ , the time can be reduced to 12 hours. The main facto r tha t
affected recovery w as the w ater abso rption of cel ls. In the no rmal seawa ter, there has
been enough nutrients. When the Porphyra cells w ere recovered at a certain temperature
fo r a certain time, the cell w as recovered and the death rate o f the iso lated cells w as
low . Almost all of the isola ted living sing le cells can develop into seedling s under the
sui table cult rue condi tions. In aquacul ture, we can choose recovery at a high
temperature and in a sho rt time to produce la rge quanti ties o f seedling s, thus ea rly
seedling g row th can be realized.
Key words　 Porphyra yezoensis; recovery; cell v iabili ty; development
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