全 文 ：现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.7
731

裂褶菌产内切 β-1,3-葡聚糖酶的特性研究

郑必胜 1,2，周萌 1
（1.华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）（2.广州现代产业技术研究院，广东广州 511458）
摘要：对裂褶菌所产内切 β-1,3-葡聚糖酶进行有效分离纯化并用电泳法对其纯度进行鉴定，进而研究其酶学特性。结果表明：经过
DEAE-Sephadex A-50 离子交换层析和 Sephadex G-75 凝胶过滤分离纯化得到电泳纯分子量约为 45 kD 的内切 β-1,3-葡聚糖酶，其最适 pH
为 5.0，最适温度为 45 ℃；Fe2+、Ba2+、Cu2+对该酶有激活作用，Zn2+、K+、Ag+、Hg2+、Ca2+对该酶有一定抑制作用；该酶的米式常数
Km为 0.8813 mg/mL。由圆二色谱分析发现该酶二级结构中的含量分别为 α-螺旋 4.6%、β-折叠 49.1%、β-转角 8.7%、无规则卷曲 37.5%，
表明其为典型的 β型结构。
关键词：内切 β-1,3-葡聚糖酶；纯化；鉴定；酶学性质
文章篇号：1673-9078(2011)7-731-733
Properties of endo-β-1,3-glucanase from Schizophyllum commune Fr.
ZHENG Bi-sheng1,2, ZHOU Meng1
(1.College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)
(2.Modern Industrial Technology Research Institute, Guangzhou 510640, China)
Abstract: The endo-β-1,3-glucanase from schizophyllum commune Fr. was separated and purified effectively, the purity was identified by
electrophoresis and then the enzymological properties were discussed. It showed that after purified by DEAE-Sephadex A-50 ion exchange
chromatography and Sephadex G-75 gel filtration, pure endo-β-1,3-glucanase with molecular weight of 45KD could be obtained, and its optimum
temperature and pH were 45 ℃ and 5.0 respectively; Zn2+,K+,Ag+,Hg2+ and Ca2+ had an inhibitory effect on the enzyme activity while Cu2+, Fe2+
and Ba2+ stimulated the activity; Michaelis constant(Km) of the enzyme was 0.8813 mg/mL. Its secondary structure analyzed by circular dichroism
showed that the percentage of α-helix, β-sheet, turn and random coil were 4.6%, 49.1%, 8.7% and 37.5% respectively, which represented the typical
structure of β-glucanase.
Key words: endo-β-1,3- glucanase ; purification; identify; enzymological properties

β-1,3-葡聚糖酶是一类能够水解以β-1,3-糖苷键连接
的葡聚糖的酶系[1]，属水解酶类，按其作用方式分为外
切、内切两种类型，其中内切酶能够以随机的方式切断
β-1,3-糖苷键主链并产生寡糖和葡萄糖，相对于水解只能
产生葡萄糖的外切酶具有更广泛的应用价值[2]。β-1,3-葡
聚糖酶来源十分广泛，真菌、细菌、放线菌、藻类、软
体动物和高等植物中都能产生，但真菌是主要的来源[3]。
β-1,3-葡聚糖酶可通过破坏病原菌细胞壁而对植物抗病
起到作用[4]，也可作为添加剂或生物活性多糖的改良剂
应用于饲料和啤酒工业中[5]，还可作为食品生物技术中
处理酵母的重要工具应用在原生质体制备、细胞融合、
基因导入和蛋白质提取等方面的研究[6~7]。
本研究基于裂褶菌在最优条件下产出 β-1,3-葡聚糖
酶及对内切 β-1,3-葡聚糖酶进行有效分离纯化，进而主
收稿日期：2011-04-20
基金项目：广东省教育部产学研合作项目（2008B090500190）
作者简介：郑必胜（1966-），男，博士，副教授，主要研究方向为天然多糖改
性及应用
要研究 pH 值、温度、金属离子对内切 β-1,3-葡聚糖酶活
性的影响，测定其酶动力学常数；并采用圆二色谱对该
酶的空间构象进行了初步研究。
1 材料及方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌种
裂褶菌菌株由广东省微生物研究所提供。
1.1.2 培养基
裂褶菌产酶发酵培养基：葡萄糖 2%，牛肉膏 0.3%，
NH4Cl 0.1%，KH2PO4 0.05%，MgSO4 0.05%，pH 自然，
121 ℃灭菌 15 min。
1.1.3 其它试剂
裂褶多糖由本实验室提供（以前制备纯化得到），
标准内切β-1,3-葡聚糖酶蛋白为Pharmacia公司的小分子
量标准蛋白，Sephadex-75 填料和 DEAE-Sephadex A-50
填料由 Pharmacia 公司提供，其它化学试剂均为分析纯
试剂。
DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2011.07.001
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.7
732
1.2 试验方法
1.2.1 裂褶菌产内切 β-1,3-葡聚糖酶的培养方法
将菌种接种于培养基中发酵培养，初始pH值为7.0，
摇瓶温度控制在 30 ℃，装液量 80 mL/250 mL，接种量
2.0 mL（孢子浓度为 106个/mL），培养时间 6 d。
1.2.2 内切 β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化及纯度鉴定
将发酵液在 4000 r/min 下离心 20 min，取上清液，
加入 40%饱和度的硫酸铵沉淀，4000 r/min 离心 20 min，
再取其上清液并加入 70%饱和度的硫酸铵沉淀，4000
r/min 离心 20 min，弃去上清液得到沉淀，将沉淀用 0.05
mol/L、pH 5.0 HAC-NaAC 缓冲液溶解，4 ℃低温透析过
夜并用聚乙二醇浓缩，所得的浓缩液即初纯酶液。用 0.05
mol/L、pH 5.0 磷酸盐缓冲液平衡，上述缓冲液加 0~0.5
mol/L NaCl 进行梯度洗脱，经 DEAE- Sephadex A-50 柱
进行层析，再用 0.05 mol/L、pH 5.0 磷酸缓冲液平衡并
洗脱，经 Sephadex G-75 柱进行层析后收集酶组分。
收集到的内切 β-1,3-葡聚糖酶用 SDS-PAGE 电泳对
其纯度进行鉴定。电泳条件为：分离胶浓度 12.5%、浓
缩胶 3%、样品浓度为 2 mg/mL、上样量为 20 μL。
1.2.3 内切 β-1,3-葡聚糖酶的酶活测定
标准曲线：本试验采用活性染料法[8]进行内切 β-1,3-
葡聚糖酶活力的测定。先将染料 Cibacron blue F3GA 配
制一系列浓度范围在 0~90 μg/mL 内的染料溶液，然后于
620 nm 比色，以吸光度为横坐标，染料浓度为纵坐标绘
制标准曲线。
染料-裂褶多糖底物制备：将染料 Cibacron Blue
F3GA 用去离子水配成 200 μg/mL 的溶液，取 100 mL 缓
慢加入到裂褶多糖中，搅拌 4 h 后用去离子水反复洗涤
至无明显蓝色溶出，40 ℃真空干燥后可获染料-裂褶菌
多糖底物。配成浓度为 0.5%染料-裂褶多糖底物溶液备
用。
酶活测定：取 1 mL NaAC-HAC 缓冲液（0.05 mol/L，
pH 5.0）、1 mL 酶液和 1 mL 0.5%染料-裂褶多糖（活性
染料法底物）组成反应体系于 50 ℃水浴振荡反应 30
min，取上清液于 620 nm 比色；经沸水浴 5 min 灭酶活，
以灭活酶作空白，对照标准曲线计算出其酶活。以 1 mL
酶水解上清液产生 100 μg 染料所需的酶量作为一个酶
活力单位，以 U 表示。
2 结果与讨论
2.1 内切 β-1,3-葡聚糖酶的鉴定
在对内切 β-1,3-葡聚糖酶有效分离提纯后，采用
SDS-PAGE 电泳对纯度鉴定，结果见图 1。
从图 1 可知，经过 DEAE-Sephadex A-50 离子交换

层析和 Sephadex G-75 凝胶过滤分离纯化得到的含酶组
分在 SDS-PAGE 图上呈一条带，说明经过分离纯化，得
到了电泳纯的内切 β-1,3-葡聚糖酶，经过软件 Quantity-
one 计算得到内切 β-1,3-葡聚糖酶的分子量约为 45 kD。

图1 内切β-1,3-葡聚糖酶的纯度鉴定图
Fig.1 Purify identification of endo-β-1,3-glucanase
注：1 泳道为标准分子量蛋白；2 泳道为纯化后的内切 β-1,3-
葡聚糖酶。
2.2 内切 β-1,3-葡聚糖酶的酶学性质
2.2.1 内切 β-1,3-葡聚糖酶最适 pH 值的确定

图2 内切β-1,3-葡聚糖酶最适pH值
Fig.2 Effect of pH on the relative activity of endo-β-1,3-glucanase
在 pH 3.0~8.0 的 HAC-NaAC 缓冲体系中，测定内
切 β-1,3-葡聚糖酶活力，结果见图 2。由图 2 可知，反应
体系的 pH 值对酶活力有一定的影响，内切 β-1,3-葡聚糖
酶在 pH 4.5~6.0 范围内酶活力较高，其最适反应 pH 为
5.0，pH 值小于 4.5 或大于 6.0，酶活力显著下降。
2.2.2 内切 β-1,3-葡聚糖酶最适反应温度的确定
在 30 ℃~80 ℃的不同温度范围内，测定内切 β-1,3-
葡聚糖酶活力。结果如图 3 所示。
由图 3 可知，反应体系的温度对酶活有明显影响，
内切 β-1,3-葡聚糖酶在 40 ℃~55 ℃范围内酶活力较高。
随着反应温度的升高，酶活性损失增大。因此，该酶的
最适反应温度为 45 ℃，反应温度过高或过低都不利于
酶解反应。
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.7
733

图 3 内切β-1,3-葡聚糖酶最适反应温度
Fig.3 Effect of relation temperature on the relative activity of
endo-β-1,3-glucanase
2.2.3 金属离子对内切 β-1,3-葡聚糖酶活力的影响
配制不同金属盐溶液的纯酶液，使溶液中金属离子
浓度为 0.05 mol/L，测定内切 β-1,3-葡聚糖酶活力，并用
蒸馏水作空白对照，计算相对酶活，结果见表 1。由数
据可知，Fe2+、Ba2+和 Cu2+对该酶有一定的激活作用，
Zn2+、K+、Ag+、Hg2+、Ca2+对该酶有一定的抑制作用，
其中 Hg2+和 Ag+的抑制作用最强。
表1 金属离子对内切β-1,3-葡聚糖酶活力的影响
Table 1 Effect of various metallic on endo-β-1,3-glucanase
金属离子 浓度/(mol/L) 相对酶活/%
NaCl 0.05 83.6
MgSO4 0.05 85.1
ZnSO4 0.05 29.5
KCl 0.05 20.4
FeSO4 0.05 220.1
CaCl2 0.05 32.8
BaCl2 0.05 200.5
HgCl2 0.05 2.1
CuSO4 0.05 183.2
AgNO3 0.05 2.7
H2O 0 100
2.2.4 内切 β-1,3-葡聚糖酶的动力学常数
米氏常数 Km 是酶的特征常数之一，与酶的浓度无
关。取用 pH 5.0 的 HAC-NaAC 缓冲液配制一系列不同
浓度的底物溶液 0.9 mL，加入 0.1 mL 的纯酶液，于 45 ℃
恒温水浴中反应，测定内切 β-1,3-葡聚糖酶的 Km和 Vm
值。内切 β-1,3-葡聚糖酶的底物浓度与反应速率的换算
数据见表 2。
根据米氏方程
sm
sm
CK
CVV +=
，以
V
1 对
sC
1 作图，如图
4 所示，直线方程为 y=2.9073x+2.5621，线性相关系数 r
为 0.9971，可求出 Vm=0.3903 mg/mL·min，Km=0.8813
mg/mL。
表2 内切β-1,3-葡聚糖酶的动力学数据
Table 2 Kinetics data of endo-β-1,3-glucanase
底物浓度 C /(mg/mL) 1/C 初速度 V/(mg/mL·min) 1/V
0.2 5.00 0.06 16.95
0.4 2.50 0.10 10.03
0.6 1.67 0.13 7.94
0.8 1.25 0.17 6.02
1.0 1.00 0.20 5.08

图4 内切β-1,3-葡聚糖酶的动力学曲线
Fig.4 Kinetics curve of endo-β-1,3-glucanase
2.2.5 内切 β-1,3-葡聚糖酶的圆二色性
利用圆二色谱分析可以初步观察内切 β-1,3-葡聚糖
酶在溶液中的不对称性，了解内切 β-1,3-葡聚糖酶在水
溶液中的二级结构。图 5 为纯化后的内切 β-1,3-葡聚糖
酶远紫外圆二色谱图。

图5 内切β-1,3-葡聚糖酶的圆二色谱图
Fig.5 The circular dichroism spectrum of endo-β-1,3-glucanase
由图 5 可知，在 209 nm 和 222 nm 左右显示出两个
双负峰，说明在内切 β-1,3-葡聚糖酶中含有一定量的 α-
螺旋结构；在 215 nm 处显示的比较典型的负峰说明内
切 β-1,3 葡聚糖酶中 β-折叠含量较高，经软件模拟分析
得到各二级结构的含量分别为：α-螺旋 4.6%、β-折叠
49.1%、β-转角 8.7%、无规则卷曲 37.5%。
（下转第801页）
现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.7
801
色值。所以在生产中应注意对酶解后的果汁吸附尽量降
低吸附温度在 50 ℃以下，可以提高吸附效果。
4 结论
在活性炭对果汁色值影响的研究中，结果表明，200
目活性炭提高果汁色值效果最差，其它目数之间吸附效
果没有差异。最佳的吸附目数和添加量组合是：80目，
添加量为0.015 g/mL。吸附温度对果汁色值的影响是温
度越高，果汁色值越低。
参考文献
[1] 葛毅强,蔡同一,胡小松.果汁中酚类物质的研究新思路.饮料
工业[J].2003,6(4):1-5
[2] 马霞,关凤梅,王瑞明.加工过程中添加剂对苹果汁非酶褐变的
影响.[J].食品科学2002.23(1):91-93
[3] Seil-A,Dietric-H, Will-F.Avoidance of quality loss during
manufaclure and storage of naturally cloudy aPPle juice
concentrates [J]. Ruessiges-obst, 2003, 69(3), 200-206
[4] 范延臻,王宝贞.活性炭表面化学[J].煤炭转化,2000,23(4):
26-28
[5] 杨晓东,顾安忠.活性炭吸附的理论研究进展[J].炭素,2000,4:
11-15
[6] Zandrie borneman,Vural Gokmen,Herry H.Nijhuis.Selective
removal of polyphenols and brown colour in apple juices using
PES/PVP membranes in a single ultrafiltration process[J].
Separation purification technology,2003:22-23,53-61
[7] 石碧,狄茕.植物多酚[M].北京:科学技术出版社,2000
[8] 邓先伦,蒋剑春,刘汉超,等.活性炭对柠檬酸及其盐溶液中色
素的吸附机理和应用研究[J].林产化学与工业,2001,22(1):55-
58
[9] 侯延民,李松田,尚桂花,等.活性炭对水中有机物吸附的选择
性[J].松疗学刊,2001,1:37-39
[10] 张雪,吕全建,王建玲.不溶性壳聚糖的再生对苹果汁色值及透
光度影响的研究[J].河南科学,2010,28(9):1101-1102
[11] 蔡菁华,蔡同一,倪元颖,等.酶解对苹果汁浑浊的影响[J].食品
科学,2003,24(9):69-71

（上接第733页）
3 结论
3.1 本文通过摇瓶培养裂褶菌获得胞外内切 β-1,3-葡聚
糖酶，对其进行纯化，并对其酶学性质、动力学参数及
空间构象进行了研究，结果如下：
3.2 经电泳纯度鉴定发现纯化后为一纯酶，其分子量为
45 kD；该酶的最适 pH 是 5.0，最适温度为 45 ℃；Fe2+、
Ba2+、Cu2+对该酶有一定的激活作用，Zn2+、K+、Ag+、
Hg2+、Ca2+对该酶有一定的抑制作用；通过双倒数法作
图计算得到该酶的米式常数 Km为 0.8813 mg/mL；经圆
二色谱对该酶构象进行分析，得出其二级结构含量分别
为：α-螺旋 4.6%、β-折叠 49.1%、β-转角 8.7%、无规则
卷曲 37.5%，具有典型的 β型结构。
参考文献
[1] 刘长江,金桥,等.产 β-1,3-葡聚糖酶海洋细菌的筛选及其酶学
性质研究[J].水产科学,2010,29(12):703-706
[2] Cohen-Kupiec R, Broglie K.E, Friesem D, et al. Molecular
characterization of anovel beta-1,3-exoglucanase related to
mycoparasitism of Trichoderma harzianum[J]. Gene. 1999,
266(2): 147-154
[3] Pitson A M, Seviour R J, et al. Noncellulolytic fungal
β-Glucanase: their physiology and regulation, Enzyme Microb.
Technol, 1993,15:178-192
[4] 王廷璞,马静静,等.β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在农作物病虫
害防治中的研究进展[J].安徽农业科技,2010,38(26):14417-
14419
[5] 陈茂彬,钟晓凌. β-葡聚糖对大麦加工的影响和 β-葡聚糖酶的
应用[J].食品研究与开发,1999,20(3):25-27
[6] Kazuo S, Junko I. Purification and characterization of a yeast
lytic β-1,3-glucanase from Oerskovia xanthin- eolyticaTK-1 [J].
J Ferment Bioeng, 1994, 78(6):407-412
[7] Antony B, Geoffrey B F, Bruce A S. Chemistry, bio-chemistry,
and biology of 1-3 beta glucans and related polysaccharides [M].
New York: Academic Press,2009:259-282
[8] 张龙翔.生化实验方法和技术[M].人民教育出版社,1982