全 文 ：生 物 工 程 Vol . 33 , No . 05 , 2012
2012年第5期
裂褶多糖（Schizophylluan，简称SPG）是由药用真
菌裂褶菌分泌的一种中性胞外多糖，且只含有β-D-
葡聚糖[1]。独特的化学结构使得它在调节免疫功能、
抗肿瘤、抗辐射等方面有着显著的疗效。但天然裂褶
多糖分子量大，在水中溶解度小、粘度大，若将未经
降解处理的裂褶多糖用于注射治疗肿瘤疾病，会引
发肌肉疼痛、血栓等问题[2]。日本学者提出在提取天
然裂褶多糖时必须获得有效的“活性多糖”，即在提
取过程就要对多糖进行降解或者改性[3]。研究表明，
裂褶菌可产生胞外内切β-1，3-葡聚糖酶 [3]，在内切
β-1，3-葡聚糖酶的作用下，多聚糖苷键断裂，葡聚糖
水解为寡糖或还原糖，即通过酶切来降低β-D-葡聚
糖的聚合度而不改变其天然结构，不影响或降低其
生物活性[4-5]。本文对裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶
的培养基组成进行优化，确定最佳的培养基组成，为
提高裂褶菌产的内切β-1，3-葡聚糖酶活力提供实验
依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
裂褶菌（Schizophyllum commune Fr.） 广东省微
生物研究所；斜面种子培养基 PDA培养基；蛋白胨、
酵母膏、牛肉膏 广东环凯生物科技公司，生化试剂；
葡萄糖 分析纯，上海博奥生物科技有限公司；冰醋
酸、NaAC、无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠、NaOH 分析
纯，天津化学试剂厂；MgSO4·7H2O、KH2PO4·2H2O、尿
素、NH4Cl、NH4NO3、NH4SO4、NH4H2PO4 分析纯，广
州市东红化工厂；苯酚、3，5-二硝基水杨酸 分析纯，
汕头市光华化学厂；裂褶多糖 本实验室制备。
pHS-3C型pH计 上海虹益仪器；HQ45B气浴恒
温摇床 中科院武汉科仪厂；HSP150生化培养箱 武
汉中科仪有限公司；UV-2102PC紫外可见光分光光
度计 上海UNICO公司。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基的配制 初始产酶培养基：葡萄糖2%，
蛋白胨0.3%，硝酸铵0.25%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢
钾0.05%，pH7.0，121℃灭菌15min。发酵培养基：配制
12° Brix麦芽汁1000mL，称取1.0g/L NH4Cl溶于其中，
121℃灭菌15min[6]。
畅晓洁，郑必胜*，赵 欣
（华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640）
摘 要：采用恒温摇床培养法培养裂褶菌，研究了裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶培养基组成中的碳源、氮源及各种
无机盐的单因素参数，并采用四因素三水平正交实验对主要影响因素进行分析，从而确定最佳的产酶培养基配方为：
葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO4 0.05%，MgSO4 0.05％。
关键词：裂褶菌，内切β-1，3-葡聚糖酶，培养基组成
Study on the optimization of medium composition of
endo-β-1，3-glucanase producing by Schizophyllum commune Fr.
CHANG Xiao-jie，ZHENG Bi-sheng*，ZHAO Xin
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）
Abstract：The constant shaking was used to culture Schizophyllum commune Fr.，and the different single-factor
parameters of carbon，nitrogen and various salt forming the medium of endo-β-1，3-glucanase producing by
Schizophyllum commune Fr. was studied. At the same time，the four factors and three level orthogonal
experimental was used to analyze the main factor. Finally，determining the optimum medium composition：
glucose 2%，beef extract 0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO4 0.05%，MgSO4 0.05％.
Key words：Schizophyllum commune Fr.；endo-β-1，3-glucanase；medium composition
中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2012）05-0167-04
收稿日期：2011－03－09 * 通讯联系人
作者简介：畅晓洁（1987-），女，硕士生，研究方向：糖类分离提纯新
方法新技术。
裂褶菌产内切β- 1，3-葡聚糖酶
培养基组成的优化研究
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
167
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.05.091
Science and Technology of Food Industry 生 物 工 程
2012年第5期
1.2.2 培养方法 从28℃下培养6d的斜面种子培养
基上用接种环小心刮下孢子，用10mL无菌水洗入预
先灭菌的装有30mL无菌水的带玻璃珠三角瓶中，置
于摇床上振荡30min，即得到单孢子悬液（孢子浓度
为106/mL）。
将单孢子悬液接种于100mL发酵培养基中，置
于30℃，160r/min摇床上控温发酵，发酵7d后测定酶
活力。
1.2.3 酶活力测定方法 以裂褶多糖为底物，采用
应用最广泛的还原糖法测定β-1，3-葡聚糖酶活力。
1.2.3.1 DNS试剂的配制[7] 称取10g 3，5-二硝基水
杨酸于水中，全部溶解后，加入20g NaOH、200g酒石
酸钾钠，加入蒸馏水，使总体积至500mL左右，加热
溶解后，加2g苯酚、0.5g无水亚硫酸钠，加热搅拌至全
部溶解，冷却，用水稀释至1000mL，储于棕色瓶中。
1.2.3.2 标准曲线的制作 准确称取葡萄糖100mg，
用适量蒸馏水溶解并定容于100mL容量瓶中。分别
吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL葡萄糖液，各加水
至1.0mL，加入DNS溶液1.5mL，沸水浴5min显色。冷
却后用蒸馏水定容至25mL，摇匀，在520nm条件下测
定吸光值，取1.5mL蒸馏水代替DNS溶液作为空白，
绘制标准曲线。
1.2.3.3 裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶活力的测
定 1mL NaAC-HAC缓冲液（0.05mol/L，pH5.0）、1mL
酶液、1mL 0.5%裂褶多糖组成反应体系，于50℃水浴
振荡反应30min，沸水浴5min灭酶活，取上清液1mL用
还原糖法测定酶水解液中的还原糖量（以葡萄糖计），
以灭活酶作空白。
酶活力单位：在上述反应条件下，1min水解β-1，3-
葡聚糖释放出1μmol葡萄糖所需的酶量，即为一个酶
活力单位，以U表示。
2 结果与分析
2.1 还原糖标准曲线
2.2 内切β-1，3-葡聚糖酶活力的测定
初步设计的裂褶菌摇瓶发酵初始产酶培养基，
测得其发酵液酶活U为3.52u/mL，在此基础上进行了
产酶培养基的优化研究。
2.2.1 葡萄糖添加量对产酶的影响 研究表明：裂
褶菌利用葡萄糖的能力高于二糖和三糖，在培养基
中添加少量葡萄糖能够大幅度地提高产酶量[4]。葡萄
糖的起始添加量对产酶影响很大，当添加量过低时，
裂褶菌提前发生自溶现象；但添加量过高，酶会受到
分解代谢阻遏。
分别以0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%不同添加量的葡
萄糖作为碳源，研究葡萄糖的添加量对产酶的影响。
从图2可知，在葡萄糖添加量较低时，发酵液酶
活U随着葡萄糖添加量的增大而增大，当葡萄糖的添
加量较高时，发酵液酶活U大幅度下降，说明酶受降
解物阻遏明显；最适葡萄糖添加量为1.5%。
2.2.2 不同有机氮源对产酶的影响 分别以蛋白
胨、酵母膏、牛肉膏、尿素作为有机氮源，在初始产酶
条件下进行发酵，研究等量的不同有机氮源对β-
1，3-葡聚糖酶产量的影响。
由图3可知，以牛肉膏为唯一有机氮源的培养基
所产的β-1，3-葡聚糖酶活力最高；其次是酵母膏。由
于酵母膏和牛肉膏成分复杂，可能含有微生物生长需
要的生长因子，从而促进了产酶。以尿素为唯一有机
氮源的培养基中裂褶菌生长不好，测不到酶活力。可
能是因为经过高温灭菌和发酵，尿素中的营养成分
早已损失殆尽，或是因为裂褶菌属于木腐菌，尿素加
入到培养基中不但在高温下会分解出游离氨，而且
在菌丝生长后也会被菌丝的代谢物降解出游离氨，
当培养基不能吸收氨态氮时，氨便以气态方式存在，
当培养基中氨过高时，菌丝便会停止生长至死亡[8]。
因此，最佳有机氮源为牛肉膏。
2.2.3 不同无机氮源对产酶的影响 确定葡萄糖的
添加量和最佳有机氮源后，对无机氮源进行单因素
实验。分别以NH4Cl、NH4NO3、NH4SO4、NH4H2PO4作为
无机氮源，添加量以氮元素摩尔数相等为依据，在初
始产酶条件下进行发酵。
由图4可知，不同无机氮源产酶活力大小顺序为：
NH4Cl＞NH4NO3＞NH4H2PO4＞（NH4）2SO4。使用（NH4）2SO4、
NH4H2PO4和NH4NO3作无机氮源时，裂褶菌生长不
好，酶活也不高。可能是由于NH4+被利用后剩余的
图1 还原糖法标准曲线
Fig.1 Standard curve of reduced sugars
吸光度
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
700
600
500
400
300
200
100
0
还
原
糖
浓
度
（
μm
ol
/L）
y=964.46x+2.3945
R2=0.9989
图2 葡萄糖添加量对产酶的影响
Fig.2 Effect of glucose additioin on enzyme activity
葡萄糖添加量（%）
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
12
10
8
6
4
2
0
发
酵
液
酶
活
U（
u/
m
L）
图3 不同有机氮源对产酶的影响
Fig.3 Effect of different organic nitrogenous on enzyme activity
有机氮源
蛋白胨
12
10
8
6
4
2
0
发
酵
液
酶
活
U（
u/
m
L）
酵母膏 牛肉膏 尿素
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NO3-、SO42-和H2PO4-使培养基呈酸性，菌丝虽能利用
但生长缓慢。用NH4Cl作无机氮源时，对生长和产酶
都有明显的促进作用。因此，NH4Cl是最佳无机氮源。
2.2.4 MgSO4对产酶的影响 Mg2+是金属离子中较
为重要的一种，它是许多酶活性中心不可缺少的一
部分[9]。分别以MgSO4添加量为0.02%、0.05%、0.1%和
0.15%在初始条件下进行发酵。
由图5可知，改变MgSO4的添加量对裂褶菌产内
切β-1，3-葡聚糖酶的影响并不显著，当MgSO4添加
量为0.05%时，内切β-1，3-葡聚糖酶活力略高，因
此，MgSO4最适添加量为0.05%。
2.2.5 KH2PO4对产酶的影响 磷酸盐不仅是核酸、
酶和能量代谢的组成部分，也是菌丝生长中必不可
少的元素。当缺乏磷源时，碳源和氮源也不能被很好
地利用[10]。因此，磷酸盐的浓度对裂褶菌的生长和内
切β-1，3-葡聚糖酶的产生有着较大的影响。
分别以KH2PO4添加量为0.02%、0.05%、0.1%和
0.15%在初始条件下进行发酵，结果见图6。
从图6可知，KH2PO4的浓度对内切β-1，3-葡聚
糖酶产酶水平的影响表现出最适浓度效应。低浓度
的KH2PO4有利于内切β-1，3-葡聚糖酶的产生，内切
β-1，3-葡聚糖酶的产酶水平随着KH2PO4浓度的增
加而升高；当KH2PO4浓度达一定值后继续升高时，内
切β-1，3-葡聚糖酶活性反而降低。因此，KH2PO4最
适添加量为0.05%。
2.3 正交实验
在确定了最佳碳源和最佳氮源（包括有机氮源和
无机氮源）基础上，对葡萄糖、牛肉膏和NH4Cl采用正
交法设计实验，选用四因素三水平正交实验表L9（34）
（见表2）以确定最佳培养基配方。
根据表2结果可知，三因素对产酶影响的主次顺
序为：葡萄糖＞牛肉膏＞NH4Cl。同时比较同一因素在
不同水平下所对应酶活的大小，从而得到的各个因
素的最优水平组合为A3B2C1，即这三个因素的添加量
为葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%。
采用实验所得的最佳培养基配方，即葡萄糖2%，
牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO4 0.05%，MgSO4 0.05％，
经过三次平行实验得到的酶活U分别为12.13、13.17、
11.48u/mL，说明该菌株在上述培养基组合下产酶较
稳定。由此确定以上优化的培养基配方为最佳产酶
培养基配方。
3 结论
3.1 不同有机氮源在一定程度上均能促进酶的合
成，以牛肉膏为最佳。
3.2 添加以相同摩尔数氮元素的不同无机氮源时，
NH4Cl是最佳无机氮源。
3.3 MgSO4和KH2PO4对产酶的影响都不是很大，MgSO4
和KH2PO4添加量均为0.05％时，产酶效果最好。
图4 不同无机氮源对产酶的影响
Fig.4 Effect of different inorganic nitrogenous on enzyme activity
无机氮源
7
6
5
4
3
2
1
0
发
酵
液
酶
活
U（
u/
m
L）
NH4Cl NH4NO3 （NH4）2SO4 NH4H2PO4
图5 MgSO4添加量对产酶的影响
Fig.5 Effect of MgSO4 on enzyme activity
MgSO4添加量（%）
3.7
3.5
3.3
3.1
2.9
2.7
2.5
发
酵
液
酶
活
U（
u/
m
L）
0 0.05 0.1 0.15 0.2
图6 KH2PO4添加量对产酶的影响
Fig.6 Effect of KH2PO4 on enzyme activity
KH2PO4添加量（%）
3.7
3.5
3.3
3.1
2.9
2.7
2.5
发
酵
液
酶
活
U（
u/
m
L）
0 0.05 0.1 0.15 0.2
表1 正交实验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
水平
因素
A葡萄糖（%） B牛肉膏（%） C NH4Cl（%）
1 1 0.2 0.1
2 1.5 0.3 0.15
3 2 0.4 0.2
表2 正交实验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment
实验号 A B C 空列 发酵液酶活（u/mL）
1 1 1 1 1 1.64
2 1 2 2 2 2.07
3 1 3 3 3 3.33
4 2 1 2 3 5.21
5 2 2 3 1 10.00
6 2 3 1 2 5.44
7 3 1 3 2 6.17
8 3 2 1 3 12.63
9 3 3 2 1 3.23
K1 7.04 13.02 19.71 14.87
K2 20.65 24.70 10.51 11.68
K3 22.03 12 19.5 21.17
k1 2.347 4.34 6.57 4.957
k2 6.883 8.233 3.503 3.893
k3 7.343 4 6.5 7.057
R 4.996 4.233 3.067 3.164
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3.4 正交实验中以葡萄糖、牛肉膏和NH4Cl作为优化
菌株产内切β-1，3-葡聚糖酶的实验因素，发现对产酶
的影响主次因素是：葡萄糖>牛肉膏>NH4Cl，从而得
到裂褶菌产内切β-1，3-葡聚糖酶的最佳培养基配方
为：葡萄糖2%，牛肉膏0.3%，NH4Cl 0.1%，KH2PO4 0.05%，
MgSO4 0.05％。
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图7 初始pH与培养温度的响应面图
Fig.7 Response surface stereogram versus pH and temperature
培养温度（℃）
29.6
48.5
46
絮
凝
率
（
%）
25.6
初始pH
6.9
5.1
接种量（%）=8 培养时间（h）=48
表明二次方程模型达到极显著水平，可以很好地反映
絮凝率与各因素之间的关系。回归方程的决定系数
R2为0.9550，表明回归模型和预测值之间有较好的拟
合度，因此该模型可用于预测絮凝率的实际情况。
根据回归方程，做出响应面图，结果见图5～图7。
由图5～图7的响应面图可知，响应值存在最大
值。在图5中，絮凝率随着初始pH的增加表现出先上
升后下降的趋势，影响絮凝率的主要影响因子是初
始pH；由图6可知，在一定初始pH范围内，絮凝率随
着温度的降低而逐渐升高，温度在26.4～28℃范围内
絮凝率出现最大值；在图7中，絮凝率随培养温度发
生的变化比较明显，曲线陡峭。但是絮凝率随着接种
量的变化不太明显，交互作用中培养温度对絮凝率
的影响较接种量显著。
2.2.2 最优培养条件的预测与检验 通过回归模型
的预测，得到絮凝活性菌株的最优培养条件为初始
pH5.81、接种量8.24%、培养温度26.71℃、培养时间
48.14h，预测响应值为48.72%。为验证响应面法的可
靠性，采用上述培养条件进行6次验证实验，考虑到
实际操作性，将培养条件修正为初始pH6.0、接种量
8%、培养温度27℃、培养时间48h。实际测得絮凝率为
48.65%，与理论值误差约0.1%。因此，响应面法得到
的最优培养条件数据准确可靠，具有实际操作价值。
3 结论
通过单因素实验和Box-Behnken实验设计以及
响应面分析对絮凝活性菌株的培养条件进行优化，
得到的最优培养条件为初始pH6.0、接种量8%、培养
温度27℃、培养时间48h。得到的回归方程模型极显
著，对实验拟合度较好。
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