全 文 ：药　物　生　物　技　术
Pharmaceutical Biotechnology　2003 ,10(5):308 ～ 311
裂褶菌素的结构研究
冀颐之 ,迟文鹤 ,杜连祥
(天津科技大学食品科学和生物工程学院制药系 ,天津 300222)
摘　要　对深层培养裂褶菌(Schizophyllum commune Fr)所获得的裂褶菌素进行了结构研究。经凝胶柱层析 ,
聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,高效液相色谱分析裂褶菌素为均一组分 ,分子质量 4×104 u。通过完全水解 , 纸层析 , 气相
色谱分析单糖组分 ,红外光谱 , 酶解反应 ,高碘酸氧化和固体核磁共振分析结构 ,证明了裂褶菌素是以葡萄糖为
单一组分的 β-(1-3)-D葡聚糖 ,其中每 3 个葡萄糖分子上连有一个 β-(1-6)的分支。
关键词　裂褶菌;裂褶菌素;结构
中图分类号:Q939　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-8915(2003)05-0308-04
　　裂褶菌素是由裂褶菌分泌的胞外多糖 ,具有 β-
(1-6)分支的 β-(1-3)-D葡聚糖的独特的活性结构
和良好的水溶性 ,在调节免疫功能 、抗肿瘤 、抗辐射
等方面有着显著的疗效[ 1] 。Tabata 发现裂褶菌素
能明显的抑制肿瘤生长[ 2] ;小松信彦发现裂褶菌素
对动物急慢性感染有防御作用 ,能防御葡萄球菌 、
大肠杆菌 、绿脓杆菌等多种细菌引起的感染[ 3] ;能
显著增加脾脏产生抗羊红细胞抗体的细胞数[ 4] ,并
可增强迟发型皮肤过敏反应 , 提高细胞免疫功
能[ 5] 。多糖的生物活性与其结构有着密切的关系 ,
王淼[ 6]在文献中报道因裂褶菌素具有独特的结构 ,
其生物活性高于其他真菌多糖 。本文利用多种分
析方法 ,对深层培养裂褶菌所获得裂褶菌素进行了结
构研究 ,为进一步开发和利用裂褶菌素奠定了基础。
1　材料与方法
1.1　材料
裂褶菌素　深层培养裂褶菌 ,经乙醇提取 ,脱
色 ,脱蛋白后得到。
1.2　纯度分析
1.2.1　SephadexG-200凝胶柱层析　SephadexG-200
装填于 2.5 cm ×60 cm 的玻璃柱中 ,以 0.05 mol L
NaCl平衡 ,0.5%裂褶菌素溶液上样 2 ml ,以 0.06
mol L NaCl洗脱 ,流速恒定在 8 ml h ,收集流出液 ,
苯酚-硫酸法显色 ,490 nm 测其 OD 值。
1.2.2 　聚丙烯酰胺凝胶电泳 　分离胶浓度为
7.5%,pH 8.9 ,浓缩胶浓度为 3.75%,pH 6.7 ,Tris-
甘氨酸电极缓冲液 , pH 8.3。上样量 5 mg ,点样体
积 20μl。开始将电流调为 10 A ,待样品进入分离
胶时 ,将电流调为 30A。溴酚蓝做指示剂 ,电泳4 h ,
Schiff试剂染色 。
1.2.3　高效液相色谱　Waters 244型高效液相色
谱仪 ,糖柱 ,Waters 410视差检测器 ,流动相为水 ,流
速 0.9ml min ,柱温 50℃。
1.2.4　紫外吸收光谱　裂褶菌素溶液从 200 nm
～ 600 nm进行全波长扫描 ,分析其末端吸收。
1.3　分子质量测定
采用高效液相色谱法 ,条件同 1.2.3。
1.4　结构鉴定
1.4.1　单糖组分分析　(1)完全水解　取裂褶菌
素10mg加 2 mol L H2SO4 5 ml ,封管 , 100℃,水解
8 h , BaCO3 中和 ,离心 ,取上清液浓缩备用。
(2)纸层析　葡萄糖 、甘露糖 、木糖 、半乳糖 、阿
拉伯糖做对照 ,展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶
5 ,显色剂为苯胺-邻苯二甲酸 ,室温上行 7 h。
(3)气相色谱分析　将裂褶菌素单糖水解液与
标准单糖:葡萄糖 、甘露糖 、半乳糖 、木糖制备单糖
衍生物[ 7] 。GC-7890II 气相色谱仪 , 选用 15 m ×
0.25mmSE-54毛细管柱 ,FID检测器 ,温度 240℃,
进样量 1μl。
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收稿日期:2002-12-10　修回日期:2003-02-25
　 作者简介:冀颐之 , 1977年生 , 女 ,山西省晋中市人 ,在读硕士研究生 , 主要研究方向为天然药物活性成分的研究 , 联系电话 022-
28193580 , E-mai l jiyizhi@sina.com。
1.4.2　红外光谱分析　取裂褶菌素冻干粉用 KBr
压片 ,在红外光谱仪上扫描红外光谱。
1.4.3　酶解反应　淀粉酶 0.1ml溶于 30ml蒸馏
水中。蜗牛酶以 pH 7.4磷酸缓冲液配制 ,终浓度
为3%。两者中均加入裂褶菌素 30 mg , 40℃,反应
3 d。用斐林法测定水解产物。
1.4.4　高碘酸氧化　200 mg 裂褶菌素溶于 100 ml
0.25mol L NaIO4 中于暗处 , 12℃,间隔时间取样 ,
稀释 ,在 223 nm 测定高碘酸消耗量 ,将溶液中加入
乙二醇放置 10 min ,以终止反应 ,还原剩余的高碘
酸 ,用溴甲酚紫为指示剂 ,用 0.01mol L NaOH滴定
甲酸释放量。
1.4.5　CP MAS13C NMR分析　观测频率:100.63MHz;
H通道频率:400.13Hz;脉冲程序:cp;检测温度:
300k;累加次数:1220次。
2　结　果
2.1　纯度鉴定
裂褶菌素 SephadexG-200凝胶柱层析结果如图
1所示为单一峰 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一条
带 ,高效液相色谱结果如图 2所示为单一峰 ,说明
裂褶菌素为均一组分 。裂褶菌素紫外扫描结果如
图3所示 ,未发现核酸吸收峰(260 ～ 290 nm)及蛋
白质吸收峰(250 ～ 300 nm),证明裂褶菌素溶液中
无核酸及蛋白。
2.2　分子质量测定
经Waters 244型高效液相色谱测定 ,Waters 410
视差检测器检测 ,其出峰时间与分子质量为 4×104
u的标准蓝色葡聚糖一致 ,故确定定裂褶菌分子质
量为 4×104 u 。
2.3　裂褶菌素结构鉴定
2.3.1　单糖组分分析　纸层析结果为裂褶菌素水
解液为单一斑点 ,其 Rf值与葡萄糖一致 ,证明裂褶
菌素是由葡萄糖组成的 。标准单糖与裂褶菌素单
糖组分的气相色谱如图 4 、5所示 。图 4有 5个峰 ,
分别为木糖 、内标物 、甘露糖 、葡萄糖 、半乳糖 。其
中葡萄糖的绝对保留时间为 19.482 ,相对保留时
间为 1.084。而图 5有 2个峰 ,其一为内标峰 ,另一
为裂褶菌素的单糖组分峰 。单糖组分峰的绝对保
留时间为 19.382 ,相对保留时间为 1.069 ,与标准
单糖图谱中的葡萄糖一致 。故进步证明裂褶菌素
是由单一组分葡萄糖所聚合而成的 。
Fig 1 　Sephadex G-200 column chromatography spectrum of
schizophyllan
Fig 2　HPLC spectrum of schizophyllan
Fig 3　UV spectrum of schizophyllan
Fig 4　GC spectrum of standard sugars
309冀颐之等:裂褶菌素的结构研究
Fig 5　GC spectrum of schizophy llan
2.3.2　红外光谱　红外光谱如图 6所示 ,红外光
谱中裂褶菌素在 3200 ～ 3600cm-1的宽峰是 O-H伸
缩振动。2800 ～ 3000 cm-1的峰为糖类 C-H 伸缩振
动 ,在这个区域的吸收峰是糖类的特征吸收峰 。
1200 ～ 1400 cm-1的不太尖的吸收峰是 C-H 的变角
振动。1000 ～ 1200 cm-1的比较大的吸收峰是由两
种C-O伸缩振动所引起的 。888.87 cm-1处的吸收
峰为吡喃糖 β型C-H的变角振动的特征吸收峰 ,呋
喃糖是不会有这种吸收峰的 ,故可知糖苷键为 β
型 ,糖环形态为吡喃糖环 。
Fig 6　IR spectrum of schizophyllan
2.3.3　酶解反应　经斐林法测定 ,淀粉酶(α-淀粉
酶和糖化型淀粉酶)酶解产物中未检测出还原糖。
证明裂褶菌素不含有α(1※4)糖苷键。而裂褶菌素
溶液可被蜗牛酶酶解 ,表明含有 β(1※3)糖苷键。
2.3.4　高碘酸氧化 　裂褶菌素经高碘酸钠氧化
14 d ,平均每摩尔已糖消耗高碘酸盐 0.58 mol ,产生
甲酸 0.28mol。高碘酸的消耗是甲酸生成的 2倍 ,
多糖中以 1※6位键合的糖基或非还原末端基经高
碘酸氧化 ,消耗 2分子高碘酸同时释放 1分子甲
酸 ,由此可知 ,裂褶菌素含有 β(1※6)糖苷键 。
2.3.5　CP MAS13C NMR分析[ 8]
多糖 CP MAS13CNMR图谱结构分析中 ,糖环上
不同位置的碳原子发生取代后 ,不管是二糖 、寡糖
及多糖 ,只要取代基的结构相同 ,其向低磁场化学
位移也基本相似 ,另一个有用的原则是 ,糖环上发
生取代的碳原子的化学位移有较大的变化 ,未发生
取代的 C-2 、C-3 、C-4 的化学位移通常在 70 ～ 77
ppm ,如在 78 ppm以上有共振信号 ,则可以肯定 C-
2 、C-3 、C-4中的某一碳原子上有取代。未发生取代
的 C-6的化学位移通常在60 ～ 64 ppm ,发生取代后
则位移到 67 ～ 70 ppm 。根据以上规律 ,参考葡萄糖
残基组成的葡聚糖的13C-NMR化学位移表来确定
裂褶菌素的结构。
Fig 7　CP MAS13C NMR spectrum of schizophyllan
Tab 1　Assignment of peeks of CP MAS13C NMR to schizophyllan
Carbon atom Chemical shift
Theoretical
chemical shift
Substitution
C-1 104.598 102 ～ 105 substituted
C-2 75.215 74 ～ 75 unsubstituted
C-2 83 substituted
C-3 75.215 75 ～ 77 unsubstituted
C-3 87.114 88 substituted
C-4 69.630 70 unsubstituted
C-4 80 substituted
C-5 77.401 75 ～ 78 unsubstituted
C-6 63.074 61 ～ 63 unsubstituted
C-6 69.630 70 substituted
参照图 7 ,考查相应范围的信号 ,确定了取代
的发生 ,结果见表 1。图谱中 87.114 ppm(第 2 个
峰)处有信号出现 ,说明 C-3位置发生取代;63.074
310 药 物 生 物 技 术 第 10 卷第 5期
ppm(第 6个峰)处的峰说明裂褶菌素中存在未发
生取代的 C-6 ,69.630 ppm(第 5个峰)处有信号 ,说
明C-6位置发生取代 ,它是未发生取代的 C-4和发
生取代 C-6的峰的叠加。C-3和C-6位置的取代通
常是与C-1发生的 ,而C-1位置发生取代之后化学
位移移至 104 ppm(第 1个峰)左右。因此可以确定
C-1位置也发生了取代 。而 75.215 ppm(第 4个峰)
处的信号为未发生取代的 C-2 、C-3峰的叠加。
因为峰高与碳原子数呈一定正相关 ,所以由裂
褶菌素 CP MAS13C NMR图谱中各峰的相对高度比
可知:第 2峰与第 6峰 ,第 1峰与第 3 峰的峰高均
接近 ,说明发生取代的C-3与未发生取代的 C-6原
子数目相同 ,发生取代的 C-1 与未发生取代的 C-5
原子数目相同。从各个主峰中可以看出还有若干
个子峰 ,第 6个峰包括 3个峰 ,为未发生取代的 C-
6 ,第 5个峰至少包含 2个子峰为未发生取代的C-4
和发生取代的 C-6。第 4个峰至少包含2个峰为未
发生取代的C-2和 C-3。第 3峰为未发生取代的C-
5。第 2峰包含 3个子峰 ,均为发生取代的C-3。第
1峰为发生取代的 C-1 。由上分析推知:在裂褶菌
素的重复单元中 ,所有 C-1均发生了取代 ,3个 C-3
发生取代 ,1个 C-3未发生取代 ,3个 C-6未发生取
代 ,1个C-6取代 ,C-2 、C-4 、C-5均未取代 。因此组
成裂褶菌素的重复单元应该含有3个主链糖基和一
个单糖分支 ,主链的取代发生在 C-1和C-3之间 ,即
为1※3糖苷键 ,分支发生在 C-1和C-6之间 ,即为 1
※6糖苷键 ,其中分支点在主链糖基的 C-6上。
2.4　性状
裂褶菌素醇析物为白色纤维状 ,冷冻干燥海绵
状 ,无臭 ,无味。溶于水 ,水溶液粘稠 。不溶于乙
醇 、乙醚 、异丙醇 、丙酮 、氯仿等有机溶剂 。pH 中
性。苯酚-硫酸试剂反应呈红色 。
综上分析 ,裂褶菌素是由单一组分葡萄糖组
成 ,糖苷键为 β型 ,糖环形态为吡喃型 ,一级结构为
β-(1-3)-D葡聚糖 ,其中每 3个主链糖基上有 1 个
β-(1-6)的分支 ,分子质量 4×104 u。这与文献报道
的裂褶菌素结构一致。
参考文献
[ 1] 　Udo Rau.Profuction of schizophyllum[ J] .Methods in Biotechnology ,
1999 , 10(Carbohydrate Biotechnology Protocols):43.
[ 2] 　Tabata K.Ultrasonic degradation of Schizophyllan , an antitumor po-
lysaccharide produced by Schizophyllum commune fries[ J] .Carbo-
hydr Res , 1981 , 189:121.
[ 3] 　小松信彦.スェヒロタゲ多糖 Schizophyl lanの实验的细菌感染
症に对する感染防御效果[ J] .Jap J Antibiotics , 1973 ,26:277.
[ 4] 　铃木宗司 ,小松信彦.低粘度 S chizophyllanの免疫ゲロブリン
产生系に及ぼす影响[ J] .日本细菌学杂志 , 1976 ,31:557.
[ 5] 　铃木宗司 ,小松信彦.低粘度 Schizophyllanのマゥス迟延型皮
肤反应にうぉどほす影响[ J] .Jap J Antibiotics , 1977 , 30:355.
[ 6] 　王淼 ,丁霄霖.葡聚糖生物活性与结构的关系[ J] .无锡轻工
大学学报 , 1997, 16(2):90.
[ 7] 　张惟杰.糖复合物生化研究技术[ M] .浙江:浙江大学出版社 ,
1999.
[ 8] 　雷德柱 ,于淑娟 ,曹珍年.灰树花胞外多糖的结构分析[ J] .菌
物系统 , 2002, 21(2):280.
Structural Study of Schizophyllan
JI Yi-zhi ,CHI Wen-he ,DU Lian-xiang
(Food Science and Bioengineering college , Tianjin University of Science and Technology , Tianjin
300222 , China)
Abstract　The structure of schizophyllan from schizophyllum commune by submerged cultivation was studied.The pu-
rified schizophyllan was proved to be homogeneous with molecular weight 4×104 u by sephadex G-200 column chroma-
tography , PAGE and HPLC.Its monomer was determined by hydrolysis , PC , GC and its structure was analyzed by
IR , enzymolysis , periodate oxidation , CP MAS13C NMR.The results showed that schizophyllan was only composed of
glucose and it consisted of a backbone chain of 1 ,3-β-D-glucopyranose units linked with single 1 ,6-β-D-glucopyrano-
ses at about every third glucose molecule in the basic chain.
Key words　Schizophyllum commune , Schizophyllan , Structure
311冀颐之等:裂褶菌素的结构研究