全 文 ：Vol. 36 No. 10
Oct. 2016
第 36卷 第 10期
2016年 10月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
收稿日期：2016-01-19
基金项目：西南林业大学科技创新基金（15092）；国家自然科学基金项目（31500536）；西南林业大学科研启动基金项目（01102-111436）
作者简介：邓丽丽，硕士研究生 通讯作者：许玉兰，副教授，博士；E-mail：xvyulan@163.com
引文格式：邓丽丽，李德龙，蔡年辉，等 . 基于高通量测序的思茅松微卫星位点的特征分析 [J].中南林业科技大学学报，2016, 36(10):
72-77, 93.
Doi:10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.10.013 http: //qks.csuft.edu.cn
思茅松 Pinus kesiya var. langbianensis (A. Chev.)
Gaussen是卡西亚松 P.kesiya Koyle ex Gordon的一
个地理变种 [1]，在我国分布于云南省亚热带、准
热带地区，是主要用材树种 [2]。自 20世纪 80年
代以来对思茅松的遗传改良做了许多工作，取得
了阶段性的成果和成熟的经验 [3]。目前，有关思
茅松苗木培育 [4]、森林资源管理 [5]、遗传变异 [6]
等方面开展多方位的研究，而从分子水平开展研
究不多，集中在实验方法的建立 [7-9]，利 用分子标
记对种质资源的评价研究更为鲜见，仅有少数利
用同工酶及 RAPD开展天然种群及种子园遗传多
样性的研究 [10-11]，迄今为止对思茅松的遗传多样
性和遗传结构的了解仍十分欠缺，缺乏系统的遗
传学、群体遗传学等基础研究工作，仅局限于部
基于高通量测序的思茅松微卫星位点的特征分析
邓丽丽 1，李德龙 1，蔡年辉 1，周 军 1，孙 琪 1，唐红燕 2，王大玮 1，许玉兰 1
（1. 西南林业大学 云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明 650224；
2. 普洱市林业科学研究所，云南 普洱 665099）
摘 要：以思茅松针叶为材料，采用 Illumina Hiseq2000平台测序，得到 121 882条无冗余的序列，对这些序列
进行 SSR位点搜索，共获得 3534个 SSR位点，出现频率为 2.9%，分布平均距离 25kb。所搜索的 SSR以单核
苷酸重复类型最多，其次为三核苷酸和二核苷酸，而四、五、六核苷酸重复类型较少（＜ 1%）。单核苷酸重复
类型中以 A/T基元较丰富（43.58%）；二核苷酸中出现频率最高的是 AT/TA基元（14.04%），AG/CT次之，
AC/GT和 CG/CG较低；三核苷酸重复类型中 AAG/CTT最多，AGC/CTG和 AGG/CCT次之，以 CCG/CGG、
ACG/CGT和 ACT/AGT较少（＜ 1%）；四、五、六核苷酸类型中各重复基元相差不大，均较少。SSR数量随
对应的重复类型重复次数的增加而降低，也随重复区段碱基长度的增加而降低。
关键词：思茅松；高通量测序；微卫星
中图分类号：S791.259 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2016)10-0072-06
Characteristic analysis of microsatellite in Pinus kesiya var. langbianensis
by using high-throughput sequencing
DENG Li-li1, LI De-long1, CAI Nian-hui1, ZHOU Jun1, SUN Qi1, TANG Hong-yan2, WANG Da-wei1, XU Yu-lan1
(1. Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province, Southwest Forestry
University, Kunming 650224, Yunnan, China；2. Puer City Institute of Forestry Sciences, Puer 665099, Yunnan, China)
Abstract: Needle sample of Pinus kesiya var. langbianensis was sequenced with high-throughput sequencing technology (Illumina
Hiseq 2000). In total 121 882 transcripts of Pinus kesiya var. langbianensis. were screened using MISA software. 3534 SSRs were
identifi ed, and the frequency of SSR was 2.9% and mean distribution density was 25 kb. The mono-nucleotide repeats were the highest,
followed by tri-nucleotide and di-nucleotide repeat types. The tetra-nucleotide, petra-nucleotide and hexa-nucleotide were all less than 1%.
Among the mononucleotide repeats, the A/T repeats motifs were the highest frequency (43.58%). AT/AT was the most frequent repeat
motifs in di-nucleotide repeats (14.04%), followed by AG/CT. AC/GT and CG/CG were minimum. AAG/CTT repeats motifs was the
highest in tri-nucleotide followed by AGC/CTG and AGG/CCT, while CCG/CGG, ACG/CGT and ACT/AGT were lowest (＜ 1%). The
repeat motifs were very few in tetra-nucleotide, petra-nucleotide and hexa-nucleotide and had no obvious differences. The SSR number
of decreased with the increased number of repeats and length of repeats.
Key words: Pinus kesiya var. langbianensis; high-throughput sequencing; microsatellite
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分地区的有限群体或种子园，而且所选用的检测
手段以表型或显性标记为主，信息含量较少。因此，
从 DNA水平上深入研究思茅松群体遗传结构与分
化就显得更为重要，可为该种质资源的保护与利
用提供科学指导。
微卫星是一种共显性的分子标记，因其多
态性丰富、重复性高、覆盖面广、易于检测、
稳定性好等优点，广泛应用于遗传多样性分析、
亲缘关系分析、品种鉴定和辅助选择育种等方
面 [12-19]。尽管微卫星在许多在很多领域中得到
广泛应用，但存在微卫星的分离问题 [20]。传统
的方法是先构建文库，再采用探针对所建立的
文库进行筛选 [21]，该方法耗时、耗力，且效率
低，后来研究者相继提出一些改进的方法，如
选择性杂交、磁珠富集等，这些方法很快就取
代传统的耗时耗力的建库扫描的方法 [20]。近
年来随着高通量测序技术的发展，EST 序列开
发 SSR 分子标记也越来越多，是一个比较有
效的途径 [22-24]，与基因组 SSR 相比，EST-SSR
具有通用性好、开发简便等特点，且来源于基因
编码序列，获得基因表达信息，可开展功能基因
的直接鉴定 [25]，这方面的研究也越来越受到人
们的关注。但是，目前关于思茅松基于 EST 序
列的 SSR 研究未见报道。鉴于此，本研究基于
Illumina Hiseq 2000平台对思茅松转录组测序，
搜索并分析 SSR 位点信息与分布特征，为思茅
松微卫星分子标记的开发提供信息，以丰富思茅
松分子标记信息，为分子水平上深入研究思茅松
遗传变异奠定基础，同时也可为近缘种特种 SSR
标记开发及其遗传分析提供便利。
1 材料与方法
1.1 研究材料
采集思茅松植株当年生幼嫩针叶，干冰保存，
核酸提取、测序（Illumina Hiseq2000）与组装（Trinity
软件）由北京华诺时代科技有限公司完成。
1.2 SSR位点的搜索与统计
使 用 Micro Satellite（MISA,http://pgrc.ipk-
gatersleben. de/misa/）搜索转录组序列中潜在的
1～ 6 bp的 SSR，搜索标准为：单核苷酸至少重
复 10次、二至四核苷酸至少重复 5次、五核苷酸
和六核苷酸至少重复 4次。采用 Excel软件统计
SSR的数量、出现频率、分布距离与密度、重复
类型、基元组成、重复区段长度变化等，分析思
茅松转录组 SSR的分布特征。
2 结果与分析
2.1 思茅松转录组微卫星序列的分布丰度与距离
组装获得的思茅松转录组共 121 882条无冗余
的转录本序列，按标准搜索 1～ 6 bp的 SSR，共
搜索到 3 534个 SSR位点，其中复合型 SSR的数
量为 96个，分布于 3205条序列上，发生频率（含
SSR序列数 /总序列数）为 2.63%，其中 2 924条
序列含有单个 SSR，281条序列含有 2个或 2个以
上的 SSR，总的 SSR序列出现频率（检出的 SSR
个数 /总序列数）为 2.90%，平均距离为 25.12 kb，
即每 25.12 kb出现 1个 SSR位点（表 1）。
表 1 思茅松转录组SSR位点的分布
Table 1 The distribution of SSR repeat types in Piuns kesiya var. langbianensis transcriptome
重复类型 SSR数量 占总 SSR比例 /% 出现频率 /% SSR分布的平均距离 /kb 分布 密度 /(个·Mb-1) 平均长度 /bp
单核苷酸 1 581 44.74 1.30 56.15 17.81 11.75
二核苷酸 841 23.80 0.69 105.56 9.47 14.53
三核苷酸 1 049 29.68 0.86 84.63 11.82 16.35
四核苷酸 34 0.96 0.03 2 611.16 0.38 22.24
五核苷酸 15 0.42 0.01 5 918.62 0.17 26.67
六核苷酸 14 0.40 0.01 6 341.38 0.16 37.29
小计 3 534 100.00 2.90 25.12 39.81 14.04
在所搜索到的 SSR中单核苷酸重复类型所
占比例较高（44.74%），三核苷酸重复类型占
总数的 29.68%，二核苷酸重复类型占总数的
23.80%，而四、五、六核苷酸重复单元所占比例
均较低，分别为 0.03%、0.01%和 0.01%；若不
考虑单核苷酸的情况下，二、三核苷酸占总数的
96.77%。相应地各重复单元类型的出现频率、分
布密度与 SSR含量的变化规律相同，表现为：
单核苷酸＞三核苷酸＞二核苷酸＞四核苷酸＞五
核苷酸＞六核苷酸；不同重复类型核苷酸的平均
邓丽丽，等：基于高通量测序的思茅松微卫星位点的特征分析74 第 10期
距离各不相同，其顺序依次为：单核苷酸＜三核
苷酸＜二核苷酸＜四核苷酸＜五核苷酸＜六核苷
酸，其中单核苷酸与六核苷酸重复类型的分布距
离差异达 113倍，即该转录组序列中每出现 113
个单核苷酸重复类型才出现一个六核苷酸重复类
型的 SSR。由表也可以看出，不同重复类型 SSR
位点的出现频率或数量越高，其平均距离越小，
分布密度越大。
2.2 思茅松转录组微卫星序列的重复基元类型和
比例
思茅松转录组微卫星序列各重复基元统计如
表 2所示。
不同核苷酸重复类型的重复基元所占的比例
差异较大，单核苷酸重复类型中以A/T基元居多，
占 43.58%，而 C/G较少，仅占总数的 1.16%；二
核苷酸重复类型中各基元所占比例依次为：AT/AT
（14.04%）＞AG/CT（8.09%）＞AC/GT（1.61%）
＞ CG/CG（0.06%）；三核苷酸重复类型中 AAG/
CTT较多（6.28%），其次是 AGC/CTG（5.69%）
和 AGG/CCT（4.73%），而以 ACT/AGT、ACG/
CGT和 CCG/CGG较低（＜ 1%）；四核苷酸重复
类型中共搜索到 20种重复基元，各重复基元的比
例较低，最高的仅为 0.14%；五、六核苷酸中出现
的基元种类少、比例低。四、五、六核苷酸中各
重复基元出现的频率均比较低，因此表 2中未列
出具体的基元类型。
2.3 思茅松转录组微卫星序列重复次数
重复基元的重复次数变异引起重复片段序列
长度的变异，思茅松转录组微卫星序列各重复类
型的 SSR重复次数如图 1所示。
由图1可知，各重复类型的重复次数差异较大，
波动于 5～ 24次，总体表现为重复次数随重复单
MNRs、DNRs、TNRs、TTNRs、PTNRs、HXNRs和 Total分别为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸以及总体。
图 1 思茅松转录组各微卫星重复类型重复次数分布频率
Fig.1 Frequency of SSR repeat types for the various number of repeats in Piuns kesiya var. langbianensis transcriptome
表 2 思茅松转录组SSR各重复基元及其比例
Table 2 The relative percentage of SSR repeat motif in
Piuns kesiya var. langbianensis transcriptome
SSR重复类型 SSR基元 数量 占总 SSR比例 %
占各自重复类
型 SSR比例 %
单核苷酸
A/T 1 540 43.58 97.41
C/G 41 1.16 2.59
小计 1 581 44.74 100.00
二核苷酸
AT/AT 496 14.04 58.98
AG/CT 286 8.09 34.0 1
AC/GT 57 1.61 6.78
CG/CG 2 0.06 0.24
小计 841 23.80 100.00
三核苷酸
AAG/CTT 222 6.28 21.16
AGC/CTG 201 5.69 19.16
AGG/CCT 167 4.73 15.92
ATC/ATG 136 3.85 12.96
AAT/ATT 114 3.23 10.87
ACC/GGT 77 2 .18 7.34
AAC/GTT 57 1.61 5.43
CCG/CGG 33 0.93 3.15
ACG/CGT 31 0.88 2.96
ACT/AGT 11 0.31 1.05
小计 1 049 29.68 100.00
75第 36卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
元中核苷酸数量的增加而减少，其中单核苷酸重
复 10 ～ 23次，二核苷酸重复 6～ 13次、其余核
苷酸重复 5～ 9次，不同核苷酸重复类型主导的
重复次数也不相同。由图也可以看出，SSR出现
的频率随重复次数的增加而降低；与此同时，随
着 SSR重复类型碱基数的增加，重复次数减少。
总体来看（见图 2），SSR的重复次数以 5～ 10
次占多数，占 77.31%，11～ 15次的占 18.08%，
而重复次数在 15次以上的不足 5%，表现为随着
重复次数的增加，SSR数量呈降低的趋势。
2.4 思茅松转录组微卫星序列长度分布
思茅松转录组 SSR重复片段的长度波动于
10～ 76 bp，其中以 10～ 24 bp居多（见图 3）。
由图 3和表 1可知，单核苷酸重复类型的长度和
二核苷酸重复类型的长度均变化于 10～ 24 bp，
平均长度分别为 11.75 bp 和 14.53 bp；三核苷
酸重复类型变化于 15 ～ 27 bp，平均长度为
16.35 bp；四核苷酸重复类型长度 20～ 24 bp，
另有一个重复较高的，重复 19次（76 bp），平
均长度为 22.24 bp；五核苷酸重复类型长度 25～
40 bp，平均 26.67 bp；六核苷酸 30～ 66 bp，平
均 37.29 bp。综合来看，各重复区段碱基片段长度
变化表现为随着重复类型碱基数的增加，片段的
平均长度也随之增加，即从单核苷酸至六核核苷
酸，片段的平均长度呈递增的趋势（表 1）。从图
3也可以看出，除六核苷酸外，其余核苷酸的重复
类型表现为 SSR出现的频率随重复区段碱基片段
长度的增加而降低，微卫星重复区段片段长度与
其对应的 SSR数量或比例成相反的变化趋势，即
重复区段碱基片段短的，其 SSR数目较多。从全
部核苷酸来看，90%以上的重复区段片段长度为
10～ 20 bp，而大于 30 bp的 SSR不足 1%。
图 2 思茅松转录组微卫星重复次数分布频率
Fig.2 Frequency of repeat number of SSR in Piuns kesiya
var. langbianensis transcriptome
MNRs、DNRs、TNRs、TTNRs、PTNRs、HXNRs和 Total分别为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸以及总体。
图 3 思茅松转录组各 SSR重复类型片段长度分布频率
Fig.3 Frequency of SSR repeat types for the various sequence length in Piuns kesiya var. langbianensis transcriptome
3 结论与讨论
思茅松转录组中 SSR的发生频率为 2.63%，
平均分布距离为 25.12 kb，39 个 SSR/Mb，与
云 南 松 Pinus yunnanensis 转 录 组 中 SSR 的 分
布及发生频率较为接近 [26]，而与杨树 Populus
（14.83%）、桉树 Eucalyptus（14.99%）的发生
频率相比较低 [27-28]，这种差异大小可能与 SSR搜
索标准、数据库大小以及物种有关 [29]，也可能与
含有微卫星的基因的表达丰度有关 [27]。思茅松
转录组序列所检测的 SSR 中，单核苷酸重复类
型所占比例接近一半，另一半主要是由三核苷
酸重复类型和二核苷酸重复类型组成，这在红
松 Pinus koraiensis 转录组的研究中也提到，单
核苷酸重复类型占总的 46.90%[30]，杨树转录组
检测到的核苷酸也表现出相同的规律，即单核苷
邓丽丽，等：基于高通量测序的思茅松微卫星位点的特征分析76 第 10期
酸＞三核苷酸＞二核苷酸 [31]，但在云南松转录
组中以三核苷酸较多 [26]，这种占优势的重复类型
在不同植物中有所差异，许玉兰等 [32]对多物种的
统计可知以二、三核苷酸较为集中。若不考虑单
核苷酸的情况下，在 2～ 6 bp的 SSR中，思茅松
也以 2～ 3 bp重复类型为主，这在地中海松 Pinus
halepensis、马尾松 Pinus massoniana 和火炬松
Pinus taeda等研究中也有类似的报道 [22,33-35]。不同
重复类型的 SSR多态水平存在一定的差异 [36]，在
研究报道中，扩增出多态性位点的引物重复单元
以二、三核苷酸重复为主 [30,37-38]，李淑娴等 [27]在
桉树研究中也发现微卫星长度的变异速率与其长
度之间存在一定的关系，表现为低级基元 SSR理
论多态性较高 [39]。因此，思茅松转录组含有较多
低级基元单、二、三核苷酸，多态性 SSR分子标
记的开发具有很大的潜力。
不同重复类型中各重复基元所在比例存在差
异，在单核苷酸重复类型中，以 A/T占绝多数，
二核苷酸重复类型中，AT/TA占多数，表现出 AT
优势。这种现象在云南松 [26]、红松 [30]、火炬松和
马尾松 [33]中均有研究报道。AT含量较多可能与其
能量有关，因为A-T间为两氢键，C-G间为三氢键，
打破 AT所需的能量低于 CG[40]。但是，在三核苷
酸重复类型中以 AAG/CTT、AGC/CTG和 AGG/
CCT较多，分别为 6.28%、5.69%和 4.73%，与
其它的松树报道的比较相似，如红松中以 AGC/
CTG、AGG/CCT和 AAG/CTT三种较多，分别占
总数的 7.63%、6.66%和 6.55%[30]；云南松中也以
AGC/CTG、AAG/CTT和 AGG/CCT[26]。在前期对
多树种的统计中也可看出以 AAG、AGC和 AGG
较多，而在如柽柳 Tamarix spp.、橡胶树 Hevea
brasiliensis、白桦 Betula platyphylla等中还出现少量
其它优势基元，如 AAT、AGA、TCA等 [32]，表明
不同植物 SSR基元组成存在一定的差异，但一些优
势基元如AAG、AGC和AGG在多种植物中均存在。
因此，推测这些重复基元可能在 EST序列中的存在
较为普遍，可能是优势的蛋白和 DNA家族 [36]。CG
重复单元可能与某些特定的功能相关 [41]，在思茅松
转录组中发现一定数量的 CG，如二核苷酸 CG，
三核苷酸 ACG、AGC等，这些重复类型是否能加
其它的生命活动需要进一步的研究。但是 CG的含
量很少，有研究认为 CG重复类型少是因为基因组
DNA中的 CpG甲基化，极易发生突变，较少的
GC是维持热力学稳定必须的因素 [42]，这些将为思
茅松 SSR引物的开发提供启示。
微卫星位点多态性主要原因是基元重复数和
碱基数不同而形成的序列长度多态性 [43]，微卫星
核心序列重复次数与该位点等位基因数存在较强
的正相关，一般重复次数多，其变异性越大，该
位点的等位基因数越多 [41]，思茅松转录组 SSR丰
度随各对应重复类型碱基数的增加而减少，这在
其它的研究中也有类似的报道，如唐古特红景天
Rhodiola algida中核苷酸类型表现为长度变化与其
对应的重复类型的碱基长度成反比，同种重复类
型中，微卫星的长度与对应的 SSR数成反比 [41]。
云南松中也出现随着重复次数的增加、重复片段
的增长，SSR出现的数量降低 [26]。由此表明，这
种重复类型特征不是思茅松所特有。一般来说，
重复区段碱基片段长度随着重复次数的不同而发
生变化，而 SSR长度变异是产生 SSR多态性的主
要原因 [39]，不同长度微卫星的分布及变化的分析
有利于多态性高的 SSR标记的获得 [41]。从思茅松
转录组 SSR分析来看，重复次数为 5～ 24次，其
中单核苷酸因容易发生错配排除外 [43]，其余的核苷
酸重复类型重复次数也有 5～ 13次，甚至有高达
19次的。从片段长度来看，90%的长度≤ 20 bp，
按照 Temnykh等 [39] 的提出 SSR长度≤ 20 bp时
多态性高，当＞ 20 bp时，仍以低级基元类型为主
（72.94%），这部分 SSR可能也具有较多的多态
性潜能。由此推测，思茅松转录组挖掘的 3 534个
SSR位点大部分具有多态性潜能，可用于分子标
记的开发。当然，本研究仅针对 SSR位点分布特
征进行分析，对于引物的开发以及功能标记的研
究还需入进一步深入。
4 小 结
思茅松转录组 SSR出现频率较高，类型丰富，
且分布密度也较大。在搜索到的 3 534个 SSR位点
中，以单核苷酸占多数，其次为三、二核苷酸重复
类型，而四、五、六核苷酸重复类型的 SSR数量
较少。单核苷酸和二核苷酸重复类型中，以 A/T、
AT/TA基元出现的比例较高，CG含量相对较低。
SSR位点出现的频率越高，其平均距离越小；各重
复单元片段长度变随着重复单元碱基数的增加而增
加；SSR出现的频率随对应重复类型重复区段碱基
片段长度的增加而降低；同样地，随着重复次数的
增加，SSR数量呈降低的趋势。结合其它研究，评
价思茅松转录组所挖掘的 3 534个 SSR位点具有较
高多态性潜能，可用于分子标记的开发。
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93第 36卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
旋翼、小体积方向发展趋势，相信在不久的将来，
采集行道树信息的技术手段会更加灵活便捷。由
于时间和实验条件限制，文章仍然有很多不足和
改进的地方，如采用的测图鹰 X100固定翼无人机
对起飞降落场地与飞行高度等方面有一定要求，
可在多旋翼无人机上搭载多目相机采集行道树信
息方面进一步研究与探索。
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