全 文 ：药 物 生 物 技 术
外
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i h扣城罗 么刃3 , 10 ( 1 ) : 17 一 2 1
裂褶菌胞外多糖发酵条件的研究
冀颐之 ,迟文鹤 , 杜连祥
(天津科技大学食品科学和生物工程学院制药系 ,天津 汉刃乞纷
摘 要 通过单因子试验和正交试验确定了裂褶菌产糖的最优培养基配方为葡萄糖 45 砂L ,酵母膏 3泌 ,
班无脸 0 . 5 砂L , M姿O’ · 7玩 0 0 . 5 砂;L 最适发酵条件为接种龄肠 h ,接种量 10 % ,培养温度 27 ℃ ,装液里为% ,初
始 声 6。 得到摇瓶条件下菌体最大得率劲 . 75 砂L ,胞外粗多糖最大得率 2 . 70 巧 砂L ,其中纯糖含最为卯% 。
关健词 裂褶菌 ;多糖 ;发醉
中圈分类号 f功史 文献标识码 : A 文章编号 : 1X() 5 一 89 1s( 2X() 3 ) 01 一 0 17 一 仍
裂摺菌 (阮h访甲 hy l mU
~
rF )属担子菌纲
蘑菇目裂摺菌科裂褶菌属 , 是一种珍贵的药用真
菌 l1t 。 裂摺菌胞外多糖 (阮油印h y止功 )是一种水溶
性的卜-D 葡聚糖 , 因其具有好的水溶性和 卜( 1一6)
分支的 卜l( 一3 ) 一 D 葡聚糖的独特的活性结构 ,在调
节免疫功能 、抗肿瘤 、抗辐射等方面有着显著的疗
效 z[J 。 据文献报道其抗肿瘤活性要明显高于同类
真菌多糖 ,是一种非常好的生物应答效应物 3[J 。
深层培养裂褶菌具有周期短 、 成本低 、 产量大
等优点 ,且易于大规模工业生产 。 德国 、 日本 、西班
牙等 国家对 其进行 了深 入的研究 , 其 中德 国
枷` 叩 , A 和 Udo B巨u 等人通过菌种选育和发酵罐
条件控制 ,在培养 120 h 之后获得了 10 一 12 砂L 的
裂褶菌胞外多糖 z[, ,] 。 然而在我国尚未见到研究裂
褶菌的深层发酵以提高其多糖产量的报道 。 本文
通过摇瓶试验确定了裂摺菌发酵产糖的最优培养
基配方和最适发酵条件 , 初步摸索了裂摺菌菌体生
长和多糖形成的规律 。
3 留L ,班毛.OP 1梦L ,崛呱 ·巩 0 .0 5 留L , 自来水 1
L
,除酵母浸俐渺阵除沟为分析纯 ,声 自然 。
1
.
2
.
3 发酵基础培养基 同种子培养基 。
培养方法
斜面种子 27 ℃ ,培养 7 d 。 然后将一块覆有菌
丝的斜面培养基接人装液量为 l的心5加 d 的种
子瓶中 , 27 ℃ , 1印 lr 而 n ,培养 Z d 。 再以 10 % 接种
量转到发酵基础培养基中 , 培养条件同上 ,培养 5
d
,所得发酵液备用 。
材料和方法
1
.
1 菌株
裂褶菌 (阮h晌hgy l mU
~
rF )
, 由南开大
学生命科学院提供 。
1
.
2 培养基
1
.
2
.
1 抖面种于培养基 PDA 酵母培养基 (酵母
浸膏粉含量 5 gl L ) [, ] 。
1
.
.2 2 种子液体培养基 葡萄糖 35 留L ,酵母浸膏粉
1
.
4 检测方法
1
.
4
.
1 生长蚤的测定 取发酵液 coI d ,离心 ,菌丝
体经蒸馏水洗涤 2 次 ,在 1仍℃烘干至恒重 ,称童。
1
.
4
.
2 粗多糖的浏定 取发酵液 10 血 ,离心 , 上
清液用 2 倍体积 95 % 乙醇沉淀过夜 , 粗多糖经无
水乙醇洗涤 2 次 , 在 40 ℃烘干至恒重 , 称量 ,得粗
多糖 。
1
.
4
.
3 纯多糖的测定 粗多糖经 反 v嗯 法去蛋白
后 , 乙醇沉淀 ,冷冻干燥 ,称量 ,得纯多糖囚 。
1
.
.4 4 声 的测定 声 计测定 。
1
.
4
.
5 还原糖的测定 SB A 生物传感分析仪测
定 。
2 结果与讨论
2
.
1 培养基的优化
2
.
1
.
1 不同破源对裂褶菌生长及胞外多糖产童的
收稿日期口以左一 m 一以
作者简介 :冀颐之 , 19 77年生 , 女 , 山西省晋中市人 , 在读硕士研究生 . 主要研究方向为天然药物活性成分的研究 , 联系电话 仪乙户
28 1刃及扣 , D . 画1 j i如肖 @ 苗皿 , ~
。
药 物 生 物 技 术 第1 0卷第1 期
影响 按1 . 3培养方法进行试验 ,其中碳源分别被
3
.
5 % 的葡萄糖 ,果糖 ,山梨醇 ,乳糖 ,蔗糖和麦芽糖
所代替 ,试验结果如图 1所示 。 由图 1可知葡萄糖
作碳源时多糖及菌丝产量高于其他碳源 ,故选择葡
萄糖作为最佳碳源 。
2
.
1
.
3 培养墓正交试脸 据上述试验结果 ,对葡
萄糖 ,酵母膏 , K H盏, 飞 , M爵q · 7玩 0 4 个因子以裂
摺菌胞外多糖为指标进行 卜6 (护 )正交试验 , 以得
出最优培养基配方 。 试验设计见表 1。
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.
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由正交试验结果及其方差分析可知 ,影响裂褶
菌产糖的各因素主次顺序为 : 葡萄糖 , K玩代、 ,
M螃q ,酵母膏。 其中葡萄搪为主要因素 , 具有显
著性影响 。 比较 4 个因素不同水平下各 自的均值 ,
得出最佳发酵培养基配方为 人几 q 几 , 即葡萄糖
45 以L ,酵母青 3 留L ,职2 .OP 0 . 05 以L , M爹.O · 7玫 0
0
.
05 以L 。
有文献报道硫胺索 、 L 谷氨酸不仅是裂褶菌生
长不可缺少的因子 , 也是多糖合成的促进因子 , 适
量添加可刺激裂褶菌多糖的生成 6[] 。 而新型的植
物生长调节剂三十烷醇由于它可改善细胞通透性 ,
提高酶活 , 因此在一定范围内也可提高裂褶菌菌丝
球的产量 [,] 。 在其它食用菌深层发酵研究中还有
通过添加 CcM 或玉米浆增加培养基粘度来提高其
生物量的报道 s[] 。 关于这些微量元素和激活因子
对裂摺菌产糖的影响还有待于进一步研究 。
2
.
2 摇瓶发酵条件的优化
2
.
2
.
1 不同种龄对裂摺菌生长及胞外多枪产黄的
影响 按 1 . 3 培养方法 ,在优化了的发酵培养基
中 ,接人培养 48 h , 54 h ,印 h ,肠 h , 72 h 不同菌龄的
种子 。 由图 3 可知 , 48 一 印 h 种龄的多糖得率较
低 。 这是由于处于调整期的种子适应能力差 ,浓度
偏低的缘故 。 72 h菌种已进人高峰期 ,有抑制多糖
形成的代谢产物分泌 , 故此种龄的多糖得率也较
低 。 肠 h 的种子正处增殖期 , 生命力旺盛 , 因此选
择 肠 h 为最佳种龄 。
2
.
2
.
2 不同接种贡对裂摺菌生长及胞外多糖产1
的影响 在发酵培养基中 , 分别接人 4% , 6% ,
8%
,
10 %
,
12 %
,
14 % 培养肠 h 的种子 。 所得结果
如图 4 ,多糖和菌丝产量随接种量的变化呈正态变
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2 不同氮源对裂栩菌生长及胞外多糖产黄的
影响 在发酵基础培养基中 , 氮源分别被 0 . 3% 的
醉母浸膏粉 (进口 ) , 酵母膏 (国产 ) ,蛋白脉 , 尿素 ,
(N托 ) Z Sq , N玩 N仇 6 种物质所代替 ,试验结果如
图 2 所示 。 从图 2 可看出以有机氮作为氮源的多
糖及菌丝产量明显优于无机氮源 ,其中以进口酵母
浸膏粉为氮源的多糖及菌丝产量最高 , 国产酵母膏
次之 。 从降低成本考虑 ,选择国产酵母膏作为最优
氮源 。
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冀颐之等 :裂褶菌胞外多糖发酵条件的研究
化 ,在接种量为 10 % 时多糖及菌丝产量达到最大 ,
故选择接种量 10 % 为最佳接种量 。
多糖及菌丝产率最高 ,其值分别为 0 . 2公“ 以1加d
和 1 . 5价 砂l o d 。 过大 、过小的溶氧水平均对菌体
生长和多糖分泌不利 。
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3 温度对裂褶菌生长及胞外多糖产量的影响
选择 24 ℃ , 27 ℃ , 30 ℃ , 3 ℃ , 36 ℃等不同温度进
行试验 。 从 图 5 可看出 , 27 ℃ 时多糖产量最大 。
24 ℃时 , 由于温度低 ,菌体生长缓慢 ,菌体及多糖产
率少 。 30 ℃ , 3 ℃随着温度的增高 ,菌体迅速生长 ,
菌丝细而密 ,菌体产量高 。 然而高温不利于多糖形
成 , 3 ℃和 36 ℃时多糖产率很低 。 所以确定 27 ℃
为裂褶菌的培养温度 。
2
.
2
.
4 装液量时裂褶菌生长及胞外多糖产量的影
响 在一定转速下 , 摇瓶装液量不同 , 其溶氧水平
不同。 本试验在 50 而 摇瓶中 , 装人 75 耐 、 10
以 、 125 时、 150 以 发酵液在 1印 lr 而 n 转速进行试
验 。 结果如图 6 , 装液量在 10 功刀5( X) 而 时裂摺菌
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.
2
.
5 初始 p H对裂摺菌生长及胞外多糖产黄的
影响 将发酵培养基的初始 PH 分别调为 5、 6 、 7、
8
。 由图 7 可知 : p H值在 5 , 6 , 7 时菌丝产量基本相
同 ,而 声 为 6 , 即自然 声 值时多糖产率最大是
2
.
754 留L ,说明 声 自然有利于多糖的形成 。 声 为
8 时 ,菌体在其中生长较差 , 故多糖及菌丝产量均
有所下降 。 因此选择 6 为最佳初始 p H。
2
.
2
.
6 裂褶菌发酵过程中菌体生长和多糖的形成
从图 8 可知 ,裂褶菌深层培养的生长曲线大致分
为 4 个阶段 : 调整期 : O 一 16 h ,菌体形态为星状 , 菌
丝较长呈放射状 , 但分支较少 , 生长不显著 。 增殖
期 : 16 一 120 h , 菌丝迅速分散为大量的萌发点 , 并
药 物 生 物 技 术 第 1 0卷第 1期
由较小的星状开始向外伸长 , 后期菌丝变粗 , 卷曲
形成球状 ,并在表面形成大量放射状突刺 ,发酵稠
度逐渐增加。 此时菌体干重与时间呈正比例关系。
高峰期 : 120 一 152 h ,生物量达到最大值 ,菌体干重
变化不大 。 菌丝球表面趋于光滑 ,菌球密集 ,发酵
液粘稠 ,可形成拉丝 。 在 152 h 时菌体有最大干重
20
.
75 砂L。 衰老期 : I 52 h 之后 , 菌丝球表面变光
滑 ,菌丝松散 ,有自溶现象 ,菌丝干重逐渐减少 , 呈
下降趋势。
胞外多糖在 16 h , 即菌体增殖期初期开始分
泌 。 16 一 1印 h 多糖分泌迅速增加 , 1印 h 时达到最
大值 2 . 70 巧 砂L。 多糖分泌与菌体生长基本同步 。
由于菌体快速的生长和产物形成 ,还原糖在
前 、 中期迅速被利用 。 在 1印 h , 即胞外多糖达到最
大值时 ,还原糖降至最低值 2 . 5 以L ,之后还原糖略
有升高趋势 ,这可能是胞外多糖被降解成还原糖的
缘故 。
声值波动不大 , 总体为下降趋势 。 这是由于
菌体进人增殖期时 , 向胞外分泌代谢产物造成的。
这与文献报道裂褶菌可产苹果酸等有机酸是一致
的 [9 ] 。
通过以上分析可知 :当还原糖降至 0 . 25 % ,禅
值降至 5 . 0 以下 ,菌丝球表面呈光滑 ,菌丝团松散 ,
有自溶现象时 ,可终止发醉 ,发酵终点为 1印 h 。 初
步得到菌体干重最大值为 20 . 75 以L , 胞外粗多糖
得率最大值为 2 . 70 15 砂L ,其中纯糖含量为卯% 。
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今 考 文 献
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. 信 息 ·
加旧 . A . 8 人结缔组织生长因子及其制备方法 一种人结缔组织生长因子 ( H C] 陷 F)及其制备方法 :从初产妇的胎盘脐
静脉得到可维持培养的人脐静脉内皮细胞 ;再从经 H不 F 刺激的人脐静脉内皮细胞中提取 mR N A经过逆转录 P CR 扩增得到
口陀凡现认 片段 ;经基因修饰 、连接并扩增得到 口陷F 编码区基因片段 ;然后对所得的各 C凡F亚克隆片段进行修饰 、连接
制得 。
洲耳日. A . 9 重组人白细胞介紊一保护荆 以右旋糖配为保护剂加人增溶剂与重组人白介素一混合均匀 ,用缓冲液稀释
至配方所需浓度 ,经滤膜过滤除菌 ,冻干制成粉针制剂 。 与现有重组人白细胞介素一 的保护制剂相比具有以下积极效果 :
避免了血液传染疾病的交叉感染 ,保证了药品的安全性 ,具有良好的外观 ,水分低 ,热源也最低 ,并可维持效价的 Ico % ~
120 %
,降低 so %的生产成本 ,延长了药品的有效期 ,保证了临床的应用治疗。
加仍 . -A 10 皿组人干扰紊 。 凝胶剂及生产方法 公开一种重组人干扰素 a 凝胶剂及生产方法 ,提供了干扰素的一种
新剂型 。 首先按比例将溶剂水 、 增稠剂 、保湿剂 、 防腐剂混合搅拌均匀制成凝胶状基质 ,在 。 , 璐 一 1 . S M禅 压力 、 10 一 126 ℃
条件下 , 高压灭菌 巧 一义知` n , 自然冷却 56 ℃以下时 ,加人人血白蛋白和干扰素制成凝胶剂。 该剂型便于皮肤表面涂抹 ,使
受病毒感染的细胞直接受到药物作用 ,抑制病毒繁殖 ,达到治疗目的 ,避免了注射剂对患者引起的不良反应和用药方式的
不方便 ,可用于治疗病毒引起的尖锐湿优 、单纯疤疹 、带状疤疹 、 水痘 、扁平庆、疙疹性口炎等皮肤病 。
加仍 . -A n 把向导入人肝细胞的商效甚因工程药物的生产方法 靶向人人肝细胞的高效基因主程药物的生产方法 ,
其将目的基因插人克隆的人乙肝病毒基因组的多聚酶基因开放读码框架 t e d犯 r 区 ,构成重组 乙肝的病毒基因单体 ,再通过
生物学常规技术 ,使该重组基因单体两端为限制性内切酶识别位点 ;单体头尾串联后 ,克隆到病毒基因表达载体质粒中 ,并
转染到人肝癌细胞系 He杯犯细胞后 ,从上清液中收获含有目的基因的完整的重组人乙肝病毒颗粒 。 利用本发明生产的靶
向导人人肝细胞的高效基因工程药物 ,具有对人肝细胞的嗜性和在人肝细胞内复制的能力 ,低剂量就可以进行靶向基因治
疗肝脏疾病 ,安全高效。
刀灿斗A . U 用基因工程方法生产红细胞刺激因子徽细胞集落刺激因子触合蛋白 用基因工程方法生产红细胞生长
因子 l粒细胞集落刺激因子融合蛋白。 通过对红细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子的亚克隆和末端改造以及用聚合醉
链反应方法 ,把两个基因通过一段多肤连接起来 ,使之形成表达质粒 ,将其转化进人哺乳动物细胞并得到了商效表达 。 该
融合蛋白具有红细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子的双重活性 ,与相同剂量的 且气) 和 -G此F单体相比 ,融合蛋白具有较
高的生物活性 。 E p o 的生物活性为 1 x l护ul 叱 ,其 。 。 F的生物活性为 1 x l诊ul 吨 。