全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2007年第4期
收稿日期:2007-02-12
基金项目:上海市科委重大攻关项目(054319936);上海市科委浦江人才计划项目(05PJ14086);上海市教委优势(重点)学科资助项目
(Y1101)
作者简介:顾佳雯(1983-),女,硕士,研究方向:海洋生物技术,E-mial:jwgu@shfu.edu.cn,Tel:021-65711601
通讯作者:郭婷婷(1978-),硕士,讲师,研究方向海洋活性物质的提纯与功能,E-mial:tguo@shfu.edu.cn
何培民(1959-),男,博士,教授,研究方向:藻类学;Tel:021-65710364,pmhe@shfu.edu.cn
紫菜是一种营养丰富的大型海洋藻类,作为人类食品及药用原料已有悠久历史[1]。人们对条斑紫菜的
提取成分及其保健价值进行了广泛的研究,发现紫菜多糖是其主要的有效成分,每 100g条斑紫菜干品含
糖 31g[2]。现有研究发现紫菜含有多种生物学活性[3]。
目前经过研究所发现的具有抗疲劳活性的多糖主要有:香菇多糖[4]、大枣多糖[5]、枸杞多糖[6]、姬松茸菌
丝体多糖[7]等。虽然这些多糖的抗疲劳机制尚不明确,但他们的作用和功能是明显的,都能增强运动机体的
运动耐力,延缓疲劳的产生和/或人体的疲劳。
虽然在我国传统中医药理论和实践指导下,对抗疲劳活性多糖的研究较为活跃,但与海洋多糖的药用
研究相比,海洋多糖在抗疲劳活性方面的研究尚属空白。虽然海洋多糖的种类繁多,但在生物活性方面与
其他类多糖仍然有较多的共性。目前研究表明,条班紫菜多糖具有清除机体内自由基[8~9]、抗凝血[10]、调节机
条斑紫菜多糖抗疲劳生物活性研究
顾佳雯 张陆曦 郭婷婷 何培民
(上海水产大学生命学院中心实验室,上海 200090)
摘 要: 主要应用活体动物实验技术,研究了纯化产物紫菜多糖的抗疲劳作用及量效关系。通过紫菜多糖PY-G1不
同剂量对小鼠游泳时间、乳酸脱氢酶活性、肌糖原和肝糖原含量等指标的检测,分析了紫菜多糖提高小鼠抗疲劳生物活性功
能及其量效关系。实验结果表明,紫菜多糖可显著延长小鼠游泳时间,最高可以提高37%;并且可以使小鼠在游泳前后乳酸
脱氢酶含量分别增加35%和37.5%(P<0.05);增加小鼠肌糖原储备量和肝糖原储备量,其肌糖原储备量和肝糖原储备量最高
可以分别增加85.6%和86%。实验结果表明,条斑紫菜多糖具有明显提高小鼠抗疲劳生物学活性。
关键词: 条斑紫菜 多糖 抗疲劳 糖原 乳酸脱氢酶
StudyonAnti-fatigueBioactivityofPolysaccharidefrom
Porphyrayezoensis
GuJiawen ZhangLuxiGuoTingting HePeimin
(DepartmentofAqua-lifeScienceandTechnology,Shanghai200090)
Abstract: Inthispaper,anti-fatigueefectsofPorphyrayezoensispolysaccharideandtheirdose-efectrelationship
wasstudiedwithlive-animalexperiment.BymeasureingtheefectofdiferentdosageofPorphyrapolysacccharideonmice
swimmingtime,lactatedehydrogenase(LDH)activityofmicebeforeandafterswimming,andthecontentofmuscle
glycogenandhepaticglycogenofmice,foridentifyingPorphyrapolysaccharidecouldincreaseanti-fatiguebioactivityof
mices.TheexperimentresultsshowedthatPYpolysaccharidecouldprolongmiceswimmingtimesignifcantly,increasingas
high as37%,anditcouldenhancethereservesamountofmuscleand hepaticglycogen,by185.6% and 186%
respectively;andthepolysaccharidealsocouldincreaseLDH activityby135% and137.5% beforeandafterswimming
respectively.ItindicatedthatpolysaccharidefromPorphyrayezoensishadtheantifatiguebioactivity.
Keywords: Porphyrayezoensis Polysaccharide Antifatigue Hepatin Lactatedehydrogenase(LDH)
DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2007.04.044
2007年第4期
体免疫力[11]的作用,这些功能可能有助于缓解和消除机体的运动疲劳。
实验通过小鼠动物体外实验及一系列生化指标的检验对条斑紫菜多糖的抗疲劳的生物学活性进行初
步的研究,为紫菜多糖产品开发奠定基础。
1 材料
1.1 实验材料
条斑紫菜(Porphyrayezoensis)采自江苏吕四,通风凉至富有弹性,密封后放入-20℃冷柜保存备用。某
种海洋动物多糖,由第二军医大学基础部生化教研室糖实验室提供。
1.2 实验动物
昆明种雌性小鼠,体重为 19±1g,由第二军医大学动物房提供。
1.3 主要试剂
0.9%生理盐水,30%KOH,0.1mg/ml标准葡萄糖,1mg/ml蒽酮显色液 (100mg蒽酮溶于 100ml98%浓硫
酸,当日配置和使用),无水乙醇。均为 AR级。三氯甲烷、无水乙醇、正丁醇为上海凌峰化学试剂有限公司
产品,AR级。
1.4 主要仪器
721分光光度计,全自动生化分析仪,DE-52离子交换层析柱为 whatman产品(2.6cm×25cm),HPLC为
Agilent公司 HP1100型
2 方法
2.1 条斑紫菜多糖的提取纯化
将条斑紫菜烘干、剪碎,经酒精回流 3h后自然阴干。烘干样品加水(Vol:1:50),加热 3h后收集提液。
抽提液经浓缩后,离心弃沉渣。Sevag法脱蛋白[12]。上清液加入 95%乙醇离心取沉淀,冷冻干燥得粗多糖。去
离子水平衡 DEAE-52离子交换层析柱 24h,粗多糖配制成 20mg·ml-1溶液后上样(流速为 0.5ml·min-1),用
蒸馏水及 3mol/LNaCl洗脱液分别洗脱。苯酚硫酸法检测[13],分离得到 PY-G1和 PY-G2二个多糖组分,用
0.02mol/LNaCl平衡 SephadexG-20048h。将 25mg样品 PY-D2溶在 2ml蒸馏水中后上样,用 0.02mol/LNaCl
洗脱,流速 0.1ml·min-1,苯酚硫酸法检测、收集,冷冻干燥,得絮状多糖,4℃保存。
2.2 条斑紫菜多糖 PY-G1的纯度鉴定
多糖样品 PY-G1以蒸馏水配成 2mg·ml-1溶液,经 HPLC检验,根据峰形判断纯度。
2.3 实验动物分组
抗疲劳游泳实验使用 18~20g规格昆明种雌性小鼠 72只,随机分为 5个多糖 PY-G1剂量组(0、0.125、
0.25、2.5、25mg/kg)和 1个某海洋多糖阳性对照组(0.7mg/ml),每组 12只小鼠。
糖原含量及乳酸脱氢酶活力测定使用 18~20g规格昆明种雌性小鼠 30只,随机分为 5个多糖剂量(0、
0.125、0.25、2.5、25mg/kg),每组 6只小鼠。
2.4 抗疲劳游泳实验[14]
第 1~9d,每组小鼠每天腹腔注射 0.1ml由生理盐水配制各种浓度多糖溶液。最后 1d给药后 1h,置小
鼠在水桶中游泳,如小鼠沉底不再浮出水面则可判定其死亡。设定水温为 25℃、水深 25cm。记录小鼠自游
泳开始至衰竭死亡的时间。
2.5 小鼠肌糖原的测定
肌糖原的测定采用蒽酮比色法[15]
第 1~12d,每天腹腔注射 0.1ml。腹腔注射第 12d,小白鼠腹腔注射 30min后,处死小鼠,取其腿部肌肉,
用0.9%NaCL溶液冲洗后,再用滤纸吸干。准确称取 1.00g肌肉,用 0.9%NaCl溶液冲洗后,再用滤纸吸干。
放入盛有 3ml30%KOH的试管中,置沸水浴 30min,取出在室温下冷却后,加入 1.5倍体积的无水乙醇,充
顾佳雯等:条斑紫菜多糖抗疲劳生物活性研究 121
生物技术通报Biotechnology Buletin 2007年第4期
分混匀,4000r/min离心 15min。去上清液,用 5ml蒸馏水溶解糖原。
向样品管中加入 0.5ml糖原提取液和 1.5去离子水,空白管中加入 2.0ml去离子水,标准管中加入
0.4ml标准葡萄糖液和 1.6ml去离子水,再向各试管中加入 4.0ml蒽酮显色液(当日配制),摇匀,置沸水浴
中 10min,然后冰浴冷却到室温后,用分光光度计在 620nm波长处测吸光值(A),空白管调零。按以下公式
计算糖原含量。
肌糖原含量计算公式:
每 100g肌肉组织中糖原的毫克数=DU
DS
×0.04×
稀释倍数
肌肉组织克数 ×100×0.9
注:DU:样品管吸光度
DS:标准管吸光度
0.04:为 0.4ml葡萄糖标准液中的葡萄糖含量。
0.9:为将葡萄糖换算成糖原的系数。
2.6 小鼠肝糖原测定
小鼠肝糖原测定:蒽酮比色法[15]
第 1~12d,每天腹腔注射 0.1ml。腹腔注射第 12d,小白鼠腹腔注射 30min后,处死小鼠,取其肝脏,用
0.9%NaCL溶液冲洗后,再用滤纸吸干,准确称取 0.25g肝脏。以下处理同肌糖原测定。
肝糖原含量计算公式:
每 100g肌肉组织中糖原的毫克数=DU
DS
×0.04×
稀释倍数
肝组织克数 ×100×0.9
注:DU:样品管吸光度
DS:标准管吸光度
0.04:为 0.4ml葡萄糖标准液中的葡萄糖含量。
0.9:为将葡萄糖换算成糖原的系数。
2.7 血液乳酸脱氢酶总活力测定
使用 18~20g规格昆明种雌性小鼠 30只,随机分为 5个多糖浓度组(0、0.025、0.05、0.5、5mg/ml),每组
6只小鼠,每天腹腔注射 0.1ml。腹腔注射第 12d,小鼠腹腔注射后在水浴中游泳 30min。泳前安静时、游泳
后、及休息 50min各取眼血 0.1ml。4000r/min、20℃离心 5min。取 50μl血清,4℃保存待用。全自动生化分析
仪检测乳酸脱氢酶酶活力(在上海电力医院完成酶活测定工作)。
3 结果
3.1 条斑紫菜多糖 PY-G1的纯度鉴定
经 HPLC检测多糖 PY-G1基本为单一对称尖峰,表明其基本为均一组分。
3.2 多糖对小鼠抗疲劳游泳时间的影响
计算 5组小鼠疲劳至死的平均时间,实验结果如图 2所示。
图 1 条斑紫菜多糖 HPLC纯度检测曲线 Valuesaremeans±SD.(*diferencebetweencontrolandsamples,
P<0.05;**significancebetweencontrolandsamples,P<0.01)
图 2 条斑紫菜多糖对小鼠游泳时间的影响
122
2007年第4期
由图 2结果可见:紫菜多糖各剂量组的游泳时间明显高于对照组,说明紫菜多糖能够提高小鼠抗疲劳
能力(P<0.01),同时显示其作用效果与多糖的剂量相关,2.5mg/kg组的效果最显著(P<0.01),比空白对照
组提高了 137%。25mg/kg剂量组及 0.25mg/kg剂量组效果其次(P<0.05)。各剂量组比较差异不明显。条斑
紫菜多糖各剂量组的游泳时间明显高于实验中另一种海洋动物多糖,说明紫菜多糖的抗疲劳活性较好(P<
0.05)。
3.3 条斑紫菜多糖对小鼠体内糖原含量影响
3.3.1 肌糖原测定 如图 3所示,各紫菜多糖剂量组
的肌糖原含量明显高于对照组,说明条斑紫菜多糖
有提高小鼠肌糖原储备的作用(P<0.05)。游泳前其
作用效果与多糖剂量相关,2.5mg/kg组的作用效果
最佳 (P<0.05),与对照组相比其肌糖原水平上升
267.5%。与对照组相比 0.125,0.25,2.5mg/kg/d剂量
组的肌糖原含量分别上升了 6.2%,41.6%,139.8%
(P<0.05)。而游泳后,25mg/kg/d剂量组的肌糖原水
平有所下降,而与对照组相比 0.125,0.25,2.5mg/kg/
d剂量组的肌糖原含量分别上升了 52.5%,80%,
86%。
3.3.2 肝糖原测定 如图 4所示,各紫菜多糖剂量组
的肝糖原含量明显高于对照组,说明紫菜多糖有提
高小鼠肝糖原储备的作用,游泳前,其作用效果呈现
一定的剂量效应,25mg/kg组的作用效果最佳 (P<
0.05),与对照组相比上升了 250%,0.125,0.25,2.5
mg/kg/d剂量组的肝糖原含量分别上升了 38.9%,
44.2%,135.3%(P<0.05)。游泳后,0至 2.5mg/kg/d剂
量组的肝糖原含量随着紫菜多糖的剂量上升而上
升。而 25mg/kg/d剂量组的肝糖原含量有下降的趋
势。
3.4 多糖对小鼠乳酸脱氢酶活性的影响
如图 5所示,紫菜多糖对乳酸脱氢酶的生成有促
进作用。游泳前,各多糖剂量组的乳酸脱氢酶活性都
有不同程度的上升,其中 0.125mg/kg、2.5mg/kg组的
促进作用明显,乳酸脱氢酶活性分别增加了 53.5%、
44%(P<0.05)。游泳 30min后,各多糖剂量组的乳酸
脱氢酶活性都有不同程度的下降,此时 2.5mg/kg组
的下降程度最低,活性比空白对照组高 28.6%(P<
0.05)。游泳后 50min,各多糖剂量组的乳酸脱氢酶活
性有所上升,其中 0.125、0.25、25mg/kg组分别上升
了 59.3%、32%、40%。与空白对照组相比,0.125、
0.25、2.5、25mg/kg组的乳酸脱氢酶活性分别高出
25.8%、42.5%、37.5%、42%。
图 3 条斑紫菜多糖对小鼠肌糖原含量的影响
Valuesaremeans±SD.(*diferencebetweencontrolandsamples,
P<0.05;**significancebetweencontrolandsamples,P<0.01)
Valuesaremeans±SD.(*diferencebetweencontrolandsamples,
P<0.05;**significancediferencebetweencontrolandsamples
P<0.01)
图 4 条斑紫菜多糖对小鼠肌糖原含量的影响
图 5 条斑紫菜多糖对小鼠 LDH的影响
Valuesaremeans±SD.(*diferencebetweencontrolandsamples,
P<0.05)
顾佳雯等:条斑紫菜多糖抗疲劳生物活性研究 123
生物技术通报Biotechnology Buletin 2007年第4期
4 讨论
肌肉活动主要靠糖原在无氧酵解生成乳酸的过程中释放能量,以及在有氧情况下线粒体内糖、脂肪酸
及氨基酸氧化分解时产生能量合成的 ATP来提供能量。在大强度耐力性运动中,肝脏可释放丰富的葡萄
糖来维持血糖,以提供强大的能量支持,使运动时间得以延长[16]。乳酸积累是导致疲劳的重要原因之一[17],
运动过程中产生的乳酸主要是在肝脏中转变为丙酮酸进行代谢的,肝脏可利用 57%~60%的乳酸以合成葡
萄糖或进入三羧酸循环氧化。LDH的作用是催化乳酸与丙酮酸的相互转变,其活性增强有利于乳酸的清除
和缺氧条件下能量的供应,对于延缓疲劳发生和高强度运动的持续进行有重要的意义[18]。因此,LDH活性
是评价受试物抗疲劳功能的重要生化指标之一。
目前研究发现,多糖抗衰老的主要机制可能有以下几种:第一,多糖中含有大量的单糖,可以为糖元合
成及糖异生提供充足底物,明显提高肝糖元水平,运动时肝脏可释放丰富的葡萄糖维持血糖,保证机体在
大强度耐力性运动中有强大的能源支持,运动时间得以延长[19]。第二,大量实验表明[5],多糖的特殊保肝作
用使肝脏维持正常功能,并有效清除过多的乳酸,加速肝糖元恢复,维持血糖水平,同时维持机体酸碱平
衡。第三,多糖对于免疫系统具有调节作用,激活细胞免疫和体液免疫系统,通过免疫系统——内环境调
节——能量释放,提高运动能力[20]。
在本次实验中,给小鼠腹腔注射紫菜多糖 12d后,肌糖原、肝糖原的含量比对照组明显升高。说明条斑
紫菜多糖可迅速为机体提供糖原作为能量需要,从而具有提高体能、抗疲劳作用。而游泳前实验组的 LDH
活性都高于空白对照组。小鼠游泳 50min后,4个实验组的血清 LDH活性与空白对照相比明显较高 (P<
0.05),最高达到 43%,表明条斑紫菜多糖能够加强乳酸脱氢酶的活性,有效地清除剧烈运动时机体的代谢
产物,延缓疲劳的发生。有研究也显示紫菜多糖是有效的免疫调节剂[11],具有很好的抗氧化作用[8,9],对紫菜
多糖的抗疲劳作用可能有一定的促进作用[21~23]。
此外,疲劳产生的一个重要原因是内环境的紊乱,如 pH降低、肌肉组织脱水,导致渗透压及电解质浓
度的变化而引起疲劳。有文献报道[4]较高浓度的香菇多糖能加快肌肉疲劳的产生,离体实验中多糖改变例
培养液的渗透压,使骨骼肌组织脱水,细胞外液中各种离子浓度发生变化,打破了肌细胞内环境的稳态。这
或许可以解释本实验中 25mg/kg剂量组的抗疲劳效果降低的实验结果。因此,条斑紫菜多糖抗疲劳的生物
学活性可能是不同作用机制共同作用的结果,其分子生物学机制还有待于进一步的研究。
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(上接第124页)
吸光度均值为 1.46,空白对照均值为 0.06。提示槲皮素作用组肝癌
HepG2细胞端粒酶活性明显降低,其差别具有显著性意义 (P<
0.05)。
3 讨论
原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,近 20年来其死亡率
增加了 41.17%,已成为我国第二位肿瘤病因。近年来研究表明肝癌
的发生、发展、预后与端粒酶异常表达密切相关。端粒酶全酶由端粒
酶 RNA(hTR)、端粒酶相关蛋白(TP1)和端粒酶催化亚基(hTERT)三
部分组成。其中 hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素,与肿瘤的关系更为密切,80%以上的肿瘤组织
呈阳性。资料显示 hTERT基因在肝癌的表达阳性率约为 89.5%,与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。由
于 hTERT在正常肝组织中不表达,而特异性地表达在肝癌细胞中,且在肝癌的发生、发展中起重要作用,
因此,hTERT有望成为新的肝癌治疗靶点。
槲皮素及其衍生物是膳食成分中最常见的类黄酮物质之一,也是一些中草药的有效成分,具有清除自
由基、抑制炎症反应、抗癌防癌等多种生物活性,日益成为国内外研究的热点。近年来证实槲皮素有较广的
抗瘤谱,对多种肿瘤细胞株及移植瘤有较高的抑制率:对乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、皮肤癌、
胰腺癌等均具有抑制作用[1,4~6],但其抑癌机制众说纷纭。由于 hTERT基因与肿瘤增殖及凋亡密切相关,我
们研究了槲皮素对肝癌HepG2细胞生长及 hTERT表达的影响,探讨其抗肿瘤的机制,结果显示槲皮素可
下调肝癌细胞 hTERT基因表达,抑制端粒酶活性,破坏端粒稳定性而促进肝癌细胞凋亡,且细胞凋亡与槲
皮素呈一定的剂量效应关系。20μmol/L的槲皮素作用 48h的肝癌细胞凋亡率明显高于 10μmol/L作用组
(P<0.05)。电镜下经 20μmol/L槲皮素处理细胞 48h后,细胞表现凋亡细胞的特征性形态变化,细胞体积缩
小、细胞表面纤毛丧失、细胞质固缩,核碎裂,可见凋亡小体形成。同时,实验结果提示槲皮素可改变肝癌细
胞的周期分布,使 S期及 G2/M期细胞所占比例减少,阻断了 G0/G1期细胞向 S期及 G2/M期移行过渡,使
静息细胞和凋亡细胞增多,从而抑制肝癌细胞的生长。
研究提示槲皮素可下调 hTERT基因的表达,抑制端粒酶活性,破坏端粒稳定性而促进肝癌细胞凋亡。
抗端粒酶治疗可能成为从分子水平上治疗肝癌的一种新手段,端粒酶抑制剂可能达到治疗肝癌的目的。
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宋建宁等:槲皮素下调hTERT表达对肝癌HepG2细胞生长影响研究 131