全 文 ：【收稿日期】2009-03-27
【作者简介】李丽秋(1951-),女 ,教授 ,从事医学微生物学和医学微生
态学研究;马淑霞 ,通讯作者 , Email:marry1964@sohu.com
文章编号:1005-376X(2009)06-0522-02 【论　　著】
实验性大鼠溃疡性结肠炎菌群失调的诊断及复方树舌的治疗观察
李丽秋 1, 2 ,王春敏 1 ,杨春佳 1 ,崔刚 1 ,吕方舟 2 ,马淑霞 1
(1.佳木斯大学基础医学院 微生物教研室 ,黑龙江 佳木斯　154007;2.佳木斯大学 儿童神经康复实验室 ,黑龙
江 佳木斯　154003)
　　【摘要】　目的　探讨对溃疡性结肠炎厌氧菌菌群失调简便检查方法 , 寻找有效治疗溃疡性结肠炎的中药合
剂。方法　用冰乙酸诱发大鼠结肠炎模型 , 用复方树舌中药治疗 , 在治疗期间分别检测每组大鼠厌氧菌代谢产物 、
挥发性脂肪酸的含量 、了解肠厌氧菌群改变 , 一般切片行 HE染色 , 观察病理变化。结果　(1)模型组大鼠挥发性
脂肪酸明显低于正常组(P<0.05);pH从第 2天起升高明显高于正常对照组(P<0.05), 各治疗组与自然恢复组
比较差异有显著性(P<0.05)。 (2)自然恢复组与各用药组间的炎症评分比较 P<0.01, 各治疗组间比较 , 树舌加
丽珠肠乐组组织损伤评分小(P<0.05)。结论　(1)测定厌氧菌的代谢产物挥发性脂肪酸含量 , 即可对肠内厌氧
菌菌群失调做出判断。 (2)实验证明 ,复方树舌中药可作为益生元调节肠道菌群失调及黏膜的修复 , 对溃疡性结肠
炎疗效显著。
【关键词】　结肠炎;复方树舌;挥发性脂肪酸;大鼠
【中图分类号】R573.1　　　　【文献标识码】A
Diagnosisofdysbacteriainratswithulcerativecolitisandobservationoftreatment
withcompoundShuShe(Ganodermalipsiense)
LILi-qiu1, 2 , WANGChun-min1 , YANGChun-jia1 , CUIGang1 , LVFang-zhou2 , MAShu-xia1
(1.DepartmentofMicrobiology, JiamusiUniversity, Jiamusi154007, China;2.LaboratoryofChildrensRehabilitation, Jiamu-
siUniversity, Jiamusi154003, China)
【Abstract】　Objective　Toexploreanaerobicdysbacteriaassociatedwithulcerativecolitisandthemethodofdetec-
tion, lookforefectiveChinesemedicinetotreatulcerativecolitis.Method　 Theulcerativecolitisratsmodelwasinduced
byglacialaceticacidandtreatedwithChinesemedicineFuFangShuShe(CompoundGanodermalipsiense).Theanaerobic
bacteriaandthecontentofvolatilefatyacidsweredetectedineachgroupduringtreatment.CommonsectionandHEstai-
ningwereusedtoobservepathologicalchanges.Result　(1)Thecontentofvolatilefattyacidsinthemodelgroupwasob-
viouslylowerthanthatofnormalgroup(P<0.05).ThepHincreasedfromtheseconddayandwasobviouslyhigherthan
thatofnormalcontrolgroup.Thediferencesbetweenthespontaneousrecoverygroupandeachtreatmentgroupweresignifi-
cant(P<0.05).(2)Therewerediferenceinthescoreofinflammationbetweenspontaneousrecoverygroupandeach
treatmentgroup(P<0.01).ThecomparisonbetweeneachtreatmentgroupshowedtheChinesemedicineplusBifidobio-
gen-Livzongrouphadthelowestscoreoftissuedamage(P<0.05).Conclusion　(1)Detectionofthecontentofvolatile
fatyacidscanbeusedindiagnosisofanaerobicdysbacteria.(2)CompoundShuShecanactasaprebiotictoadjustintesti-
naldysbacteriaandrepairmucosa, andisobviouslyefectiveonulcerativecolitis.
【Keywords】　Ulcerativecolitis;CompoundShuShe(Ganodermalipsiense);Volatilefattyacid(metabolites);Rat
　　溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis, UC)是消化系统
临床常见病之一 ,是一种迄今病因仍不明确的炎症肠
病(IBD)。已有证据显示 UC的发生与遗传 、免疫 、
环境和感染菌群失调等因素有关 ,在 UC的治疗过程
中 ,其机制为杀死溃疡区的所有微生物 、促进溃疡面
在自身修复机制的作用下达到治愈目的 ,但也存在着
药效丧失后 ,致病微生物易于再次定植及一些致病微
生物会逐渐产生耐药性的缺陷 。同时也忽略了内环
境中正常菌群的作用因素 ,故常规药物治疗法不能达
到根除的目的。在大量的中药实验研究中 ,我们发现
部分补益类中药具有扶植正常菌群生长作用 ,可调整
菌群失调 、提高定植抗力 ,起到益生元效果 ,是理想的
微生态调节剂 。本实验根据挥发性脂肪酸 、非挥发性
脂肪酸 、醇是厌氧菌重要代谢产物 ,采取测定大鼠肠
内容物挥发性脂肪酸及 pH,对肠内微生态失调做出
早期诊断 ,再用复方树舌对急性 UC大鼠进行治疗 ,
得到良好的疗效 ,为溃疡性结肠炎的治疗提供一条新
的思路。
1　材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　供试动物　Wistar大鼠 48只 ,雌雄各半 ,体
重 200 ～ 250 g,由佳木斯大学动物实验中心提供 。
1.1.2　药物及其制备　树舌 、黄芪 、白术等中药购于
佳木斯医药公司 ,符合药典标准。洗净 、温水浸泡 30
522 ChineseJournalofMicroecology, Jun.2009, Vol.21No.6
min,水煎 3次 ,浓缩至 1 ml含生药量 1 g水溶液 , 4
℃保存备用;丽珠肠乐:珠海丽珠集团丽珠制药厂;试
剂:冰乙酸用无菌蒸馏水配成 5%浓度 。
1.2　方法
1.2.1　动物分组　48只 Wistar大鼠随机分为 6组 ,第
1组为正常对照组 ,其余 5组造模后分为模型组 、自然恢
复组 、丽珠肠乐组 、树舌组 、树舌与丽珠肠乐联合组。
1.2.2　模型制造　除正常对照组外的 40只大鼠建
立结肠炎模型。禁食 24 h,乙醚麻醉 ,自肛门将导管
插入大鼠结肠内约 8 cm,灌入 8%的乙酸溶液 1.8
ml,作用 20s后 ,注入生理盐水 5 ml冲洗 3次 。造模
6 h后观察大鼠稀便发生率及死亡率。于造模 24 h
后处死模型组大鼠 ,检测模型建立是否成功。
1.2.3　给药方法　正常对照组和自然恢复组:生理
盐水每天早晚各灌胃 1次 ,每次 2ml,连续 12 d;树舌
组:备用的复方树舌液每天早晚各灌胃 1次 ,每次
2 ml,连续 12d;丽珠肠乐组:用生理盐水稀释成 2.5
亿个活菌 /ml,每天早晚各灌胃 1次 ,每次 2 ml,连续
12 d;树舌与丽珠肠乐联合组:复方树舌 、丽珠肠乐
1∶1使用 ,每天早晚各灌胃 1次 ,每次 2ml,连续 12d。
1.2.4　取材方法　12 d后 ,给药后 1 h,在乙醚麻醉
下将大鼠固定于解剖板上 ,常规消毒 ,正中切开腹腔:
找出回盲部 ,无菌采取盲肠内容物 0.2 g,分成 2份 ,
测定挥发性脂肪酸浓度和 pH;从肛门向上截取 8 cm
结肠 ,在水浴中沿肠系膜缘剪开 ,漂洗内容物 ,用透明
薄膜画出溃疡面积 ,取病变组织用中性甲醛固定 ,做
肠黏膜 HE染色 。
1.3　动物处理及标本检测
1.3.1　肉眼观察记录　用药后每日观察大鼠的精神
状态 、食欲 、腹泻及血便情况。
1.3.2　盲肠内容物挥发性脂肪酸浓度及 pH测定
将 2份标本匀浆 ,一份用于测定 pH,另一份用
25% H2SO4 1 ml酸化 , 使 pH<2, 4 ℃过夜 , 3500
r/min离心 ,去上清液后 ,加入等体积的无水乙醚 ,充
分振荡 ,萃取短链脂肪酸 ,萃取物 2 ml注入气相色谱
仪中 、按常规方法检测 。气相色谱仪主要工作条件:
毛细管色谱柱 2 m×0.3 m,柱温 140 ℃;注射温度
200 ℃,鉴定器温度 200 ℃,每个样品测 3次 ,通过标
准曲线按内标法计算含量 , 挥发性脂肪酸浓度以
微摩尔 /g盲肠内容物(湿重)表示。 pH通过盲肠内
容物加 1个体积新鲜煮沸并完全冷却的蒸馏水 ,匀
浆 ,将玻璃电极插入匀浆液中测定 ,并且在大鼠死后
10 min内测试完。
1.3.3　肠组织学评分及肠黏膜组织病理学检查　将
距肛门 8 cm的结肠组织剖开肉眼观察损伤情况 ,进
行大体形态学评分。肠道大体形态学评分标准为:
0分-无损伤;1分 -充血但没有溃疡;2分 -充血且肠壁
变厚但没有溃疡;3分-有一处溃疡但没有肠壁增厚;
4分-有两处或以上溃疡;5分 -有两处或两处以上大
溃疡和炎症或有一处溃疡沿肠纵轴超过 1 cm;6 ～ 10
分 -沿结肠纵轴损伤 >2 cm,每超过 1 cm增加 1分。
1.4　统计学处理　各组数据均采用软件处理 ,组间
比较采用方差分析 。
2　结果
2.1　一般状况观察　用药后每日观察腹泻及血便情
况 ,做记录。造模 2 d大鼠明显表现出溃疡的症状 ,
如:毛无光泽 ,畏寒倦怠 、食欲下降 ,大便稀泻并带有
脓液 , 有的带血性分泌物 。实验组动物在给药 3 d
后 ,上述症状比自然恢复组减轻 , 5 d后 , 进一步好
转 ,黏液血便发生率减少 , 10 d后给药组症状基本
恢复。
2.2　挥发性脂肪酸浓度及 pH　结果见表 1。
2.3　肠组织学评分及黏膜组织病理学检查　结果见
表 2。
表 1　挥发性脂肪酸浓度及 pH测定结果(IogN/g, x±s, n=42)
分组　　 乙酸　　 丙酸　　 丁酸　　 pH值　　
自然恢复组 21.14±3.76 0.79±0.52 13.70±4.21 　　6.6±0.14
树舌组 22.17±4.41＊ 0.97±0.64 14.94±4.79 　　6.4±0.21
丽珠肠乐组 22.33±4.69 10.60±0.28＊　 15.09±5.24 　　6.4±0.37＊
树舌 +丽珠组 22.04±3.92＊ 0.91±0.43 14.52±5.13 　　6.3±0.83＊
正常对照组 23.78±4.78 1.14±0.63 16.94±8.10 　　6.4±0.23
　　　　　　　　注:同正常对照组比较 , ＊P<0.05
表 2　肠组织学评分及黏膜组织病理学检查评分(IogN/g, x±s, n=42)
分组 大体形态评分 组织学评分
自然恢复组 6.25±1.39＊ 6.34±1.04＊
树舌组　　 2.47±3.65＊ 2.97±3.12＊
丽珠肠乐组 2.61±3.49＊ 2.96±3.84＊
　树舌 +丽珠组 2.03±1.17＊ 2.27±1.64＊
正常对照组 0.75±0.71　 1.23±0.83　
　　　　　　　　注:同正常对照组比较 , ＊P<0.05 (下转第 526页)
523中国微生态学杂志　2009年 6月第 21卷第 6期
Ⅰ类整合子在临床分布最广泛 ,它与 Th21转座
子家族相关 。 Ⅱ整合子与 Tn7转座子家族相关 ,其整
合酶基因有缺陷 ,编码的整合酶 IntⅠ 2约有 318个氨
基酸 ,与 IntⅠ 1有 46%的同源性。Ⅲ类整合子在耐碳
青霉烯类抗生素的黏质沙雷菌的质粒上发现 ,其编码
的整合酶 InrⅠ 3含有 320个氨基酸 , 与 IntⅠ 1有
61%的同源性[ 7] ,在本研究中未能检出 Ⅱ类和 Ⅲ类
整合子 。
本实验检测 Ⅰ类整合子阳性 34株(79%),高于
国内报道的 63%[ 2] ,这可能因区域差异有关 ,也可能
因我们收集临床分离株总数较少且病区较为集中 ,可
进一步加大样本量进行研究。
本实验显示 ,我院鲍曼不动杆菌携带的整合子主
要为Ⅰ类整合子 。从病区分布来看 ,某病区的阳性率
较高为 23%(9 /43),但是从时间上来看都呈散发分
布 ,未出现爆发流行的趋势 。
在本次研究中 ,携带Ⅰ类整合子的鲍曼不动杆菌
对 12种抗生素的耐药率和整合子检测阴性的菌株的
耐药率比较 , 经卡方检验 , 差异具有显著性 (P<
0.05)。 Ⅰ 、Ⅱ类整合子的扩增产物长度很相近 ,有
些时候在有非特异性杂带的情况下肉眼难以区分 ,在
多重 PCR电泳后 ,分别抽取单个 I类整合子阳性菌
株再进 Ⅱ类整合酶基因的单重 PCR,以进一步明确
PCR产物的特异性 ,结果表明我们合成的 Ⅰ 、Ⅱ类整
合酶的引物具有较强的特异性 。
在本课研究中我们还在整合子的高变区设计引
物 ,采用Ⅰ类整合子通用引物阳性的菌株进行扩增 ,
将 PCR产物运用 RFLP技术进行分型 ,结合 PCR产
物测序的结果对整合子高变区的耐药基因进行分类
和定位 。
在耐药性方面 ,检测的 43株鲍曼不动杆菌对 12
种抗生素均有不同程度的耐药 ,其中以亚胺培南抗菌
活性最强 。I类整合子阳性菌株仅对亚胺培南表现
较高的敏感(55.9%)。而 I类整合子阴性菌仅对红
霉素 、氯霉素 、氨苄西林高度耐药 ,耐药率达 70%以
上 ,而对其余抗生素较为敏感。
整合子可通过整合酶将耐药基因整合到细菌中 ,
使得细菌具有耐药性 ,甚至为多重耐药性 ,已经成为
耐药传播的一种重要方式 。相关研究表明鲍曼不动
杆菌不仅 blaTEM、blaOXA23群 、blaDC等 β-内酰胺基因携
带率高 ,而且 I类整合酶基因的携带率高 ,并且提示
靶分子标记基因当作二元数据进行运算后 ,其效果可
达到基因组脉冲场凝胶带电泳(PFGE)的效果 [ 8] ,因
此我们应当重视临床分离菌株的整合子的调查研究 ,
了解流行株的分子特征对于有效控制耐药菌株的增
加具有积极的意义 。
【参考文献】
[ 1]魏取好 , 蒋晓飞.细菌整合子研究进展 [ J] .中国抗生素杂志 ,
2008, 33(1):1-5.
[ 2]王睿 ,童卫杭.鲍曼不动杆菌整合子阳性与多重耐药的相关性究
[ J] .中国临床药理杂志 , 2007, 23(6):424-429.
[ 3]阳大庆 ,唐银.鲍曼不动杆菌 I类整合子系研究 [ J] .临床检验杂
志 , 2006, 24(5):338-340.
[ 4]严冰 ,盖俊魏 ,艾辉, 等.不动杆菌整合子基因及其耐药性关系的
研究 [ J] .中国卫生检验杂志 , 2008, 18(2):306-330.
[ 5]叶应妩 ,王毓三.全国临床检验操作规程 [ M].第 2版.南京:东南
大学出版社 , 1997:452-575.
[ 6]应春妹 ,翁文浩 , 汪雅萍 , 等.鲍曼不动杆菌整合子相关耐药基因
研究 [ J] .检验医学 , 2008, 23(1):34-37.
[ 7]杨仁国 ,吕晓菊.整合子系统与细菌多重耐药研究进展 [ J] .中国
抗生素杂志 , 2008, 33(4):189-202.
[ 8]蔡挺 ,张顺 ,陈玲.鲍氏不动杆菌耐药基因和整盒子 、转坐子遗传
标记及遗传标记及菌株亲源性研究 [ J] .中华医院感染学杂志 ,
2007, 17(10):1182-1184.
(上接第 523页)
3　讨论
UC是一种病因不明的自身免疫性疾病 ,目前有
关细菌感染与 UC的关系的研究主要集中在以下几
个方面:(1)细菌是否为 UC的感染因素;(2)细菌是
否为 UC的特异性致病菌;(3)肠内的正常菌群在 UC
发病中所起的作用 。 FABIA等人在 UC动物模型和
临床病人的研究中也发现 ,在乙酸性大鼠结肠炎和人
类 UC中 ,厌氧菌数量减少 ,是活动性结肠炎的普遍
特征 ,复方树舌中药具有微生态调节剂的作用 。镜下
观察:树舌组结肠黏膜充血肠壁变厚 ,但没有溃疡形
成;树舌 +丽珠肠乐组结肠黏膜充血但无溃疡;自然
恢复组结肠黏膜上皮缺失 ,腺体结构紊乱 ,浅表溃疡
形成 ,黏膜及黏膜下层水肿明显 ,隐窝脓肿形成 ,肠壁
增厚 ,有淋巴组织增生 ,大量中性粒细胞浸润 ,可见数
量不等的单个核细胞和嗜酸性粒细胞 ,杯状细胞减
少 ,腺管排列紊乱 ,正常组结肠黏膜上皮完整 、腺体排
列整齐未见糜烂及溃疡形成 。树舌 +丽珠肠乐组仅
有轻度炎性改变 ,树舌组 、丽珠肠乐组组织评分与自
然恢复组比较差异有显著性 。各治疗组经过治疗后
肠道优势菌群的数量有不同程度恢复 ,双歧杆菌 、乳
酸杆菌的数量逐渐回升 ,与自然恢复组比较差异有显
著性 ,以树舌 +丽珠肠乐组治疗效果最好 ,其原因是
肠道正常菌群可起到生物屏障作用 ,这种屏障也包括
化学屏障 ,如正常菌群的代谢产物 (乙酸 、丙酸 、乳
酸 、细菌素等)可阻止致病菌的定植与繁殖 ,发挥生
物拮抗作用。因此 ,从肠道黏膜保护角度出发治疗溃
疡 ,为溃疡的治疗提供了一种新的思路 ,寻找并开发
具有微生态调节剂作用的可用于治疗溃疡的药物。
【参考文献】
[ 1]全国慢性非感染肠道疾病学术研讨会.溃疡性结肠炎的诊断及疗
效标准 [ J] .中华消化杂志 , 1993, 13(5):354.
[ 2]邓首生.炎症性肠病 [ M] .北京:人民卫生出版社 , 1998:253.
[ 3]黎介寿.肠衰竭———概念 、营养支持与黏膜屏障维护 [ J] .肠外与
肠内营养 , 2004, 11(2):65-66.
[ 4]姜香菊.肠道菌群失调与多脏器功能衰竭 [ J] .中国微生态学杂
志 , 2008, 20(4):424-425.
526 ChineseJournalofMicroecology, Jun.2009, Vol.21No.6