全 文 ：第 2 卷 第 2 期
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03
海 洋 学 报
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条斑紫菜高纯度总 D N A 及其
质粒状 D N A 的提取
郭 宝 太 毕 玉 平 单 雷 李 广 存
(青岛海洋大学海洋生命学院 , 青岛 2 660 03) (山东省农业科学研究院生物技术中心 , 济南 25 01 00)
戴 继 勋
(青岛海洋大学海洋生命学院 , 青岛 2 66 00 3)
摘 要 提取条斑紫菜高纯度总 D N A 及其质粒状 D N A 的新方法 . 先用海螺酶处理
紫菜叶状体制备细胞 , 然后用 SD S 一 蛋 白酶 K 裂解细胞提取总 D N A , 再用玻璃粉浆
( g l a s s m i lk )对其纯化 , 经纯化后的总 D N A 能被 E e o R I , D r a l 与 H a e l 等限制酶完全酶
切 , 并在酶切图谱上形成明显的 D N A 带型 . 当用异硫氛酸肌 一 十二烷基肌氨酸钠裂
解紫菜细胞时 , 在总 D N A 提取物中直接发现有一条质粒状 D N A 带 ( 2 . 3 K b) , 即建
立 了一种极简便的质粒状 D N A 提取方法 .
关键词 条斑紫菜 细胞 总 D N A gl as s m i lk 完全酶切 质粒状 D N A
中图分类号 : Q 503
1 引言
由于藻胶 (多糖 )含量较高 , 紫菜 D N A 的提取尤其是高纯度 D N A 的获得一直比较困难 .
为了避免液氮破碎后多糖的严重干扰 , H on g 等川建立了一种用 iL cl 软化紫菜组织让 D N A 直
接透出细胞而无细胞裂解步骤的提取方法 , 但此法的 D N A 得率低 , 纯度也不高 . iK t ad e 等 2[]
建立了一个提取条斑紫菜高纯度且大分子量 D N A 的程序 , 其中包括液氮破碎 、 异硫氰酸肌 -
十二烷基肌氨酸钠裂解 、 sC CI 密度梯度离心及 C T A B 去除残余多糖等一系列步骤 . 用此程序
提取的 D N A 纯度高且分子量大 , 能满足多种分子生物学分析的要求 , 但该程序操作复杂 , 用
时长 , 花费昂贵 , 不是简便的常规方法 . s ih vij 等〔3〕在条斑紫菜质体 D N A 富集物中发现有质粒
状 D N A , 但提取方法复杂 、 得率低 , 直接影响了其研究 . 本研究拟建立能获得高纯度紫菜总
D N A 的简便可靠的提取方法及更简便的条斑紫菜质粒状 D N A 的提取方法 .
本文于 1 9 98 一 1 2一 2 6 收到 , 修改稿于 19 9 9 一 0 6 一 0 3 收到 .
第一作者简介 : 郭宝太 , 男 , 36 岁 , 副教授 , 博士 , 从事植物分子生物学研究
海洋学报 22卷
2材料和方法
2
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1 紫菜和试剂
条斑紫菜叶状体由 日照市海水育苗厂提供 , 洗净后晾至半干 , 一 20 ℃ 保存 , 随时取用 . 海
螺酶为青岛海洋大学产品 . SD S 、 蛋白酶 K 分别为 eS vr a 与 M er ck 产品 . 异硫氰酸肌及十二烷
基肌氨酸钠分别是 oB he ir n ge : 与 iS g m a 产品 . 限制性内切酶全部购 自 rP o m eg a 公司 . lG as s -
m ilk 由美国宾夕法尼亚州立大学 吕玉平博士赠送 .
2
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2 紫菜总 D N A 的提取
2
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1 紫菜细胞的大量制备
参照戴继勋等4[] 建立的方法并作改进 . 取出 2 9 冷冻保存的紫菜叶状体 , 剪成碎片 , 加人
适量酶液 ( 2% 海螺酶 , 2 m ol d/ m ” 葡萄糖 ) , 于 30 ℃ 酶解 2 h . 无菌水稀释酶解物 , 筛绢过滤 , 滤
液经 5 00 r , 10 ℃ 离心 5 m in( oS r va n R 2C 8 S 离心机 , G SA 转子 )收集细胞 . 无菌水悬浮 、 洗涤
细胞一次 , 离心后重新收集细胞 .
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2
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2 细胞的裂解与酚 、氯仿抽提
用 1 0 。m3 的 3 % S D S , 1 5 0 m m o l / dm3 E D T A , 5 0 m m o l / dm 3 T r i s 一 H C I , p H 8 . 0 , 0 . 2 mo l /
d耐 Na cl , 0 . 2% p一 琉基乙醇裂解液悬浮紫菜细胞 , 加蛋白酶 K 至终浓度为 30 滩 / c m 3 , 5
℃水浴 1 . s h , 中间搅拌几次 . 取出裂解物 , 降至室温后用等体积水饱和酚 、 酚 /氯仿 、 抓仿依次
抽提 . 用酚 、 氯仿各抽提一次 , 酚 /氯仿抽提 2 一 3 次至水相无色透明且水相与有机相的界面处
不再有沉淀为止 . 抽提时都用 5 534 转子 , 10 00 : , 10 ℃ 离心 8 m in .
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2
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3 总 D N A 的获得
在抽提后清澈的水相中加预冷的 0 . 6 倍体积的异丙醇 , 4 ℃ 静置 20 而 n . 12 0 0 : , 15 ℃ 离心
10 im
n 后弃上清 . 沉淀用 70 % 乙醇洗一次 , 室温晾干或热风吹干 . 加 3 e m3 兀 溶解沉淀即得总
核酸提取液 . 在总核酸提取液中加 NR ase A 至终浓度为 25 阔 csrn , 37 ℃消化 hl 去除 R N A . 将消
化物分至 1 . 5 e n 1 3 助ep n do fr 管中 , 用酚 、酬氯仿 、 氯仿各抽提一次 . 上清中加 0 . 1 倍体积的 3即1/ d时 N a Ac 与 0 . 6 倍体积的异丙醇 , 4 ℃放置 30 而 n . 于 13 o o r 离心 8 而 n 后弃上清 . 沉淀
用 70 % 乙醇洗两次 , 室温晾干或热风吹干后用无菌双蒸水溶解即得总 D N A 初提物 .
2
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3 总 D N A 的纯化
在 1 . 5 e m 3 E p p e n d o r f 管中加 s o m m 3 总 D N A 初提物 (约 1 拌g D N A ) 、 2 4 o m m 3 6 M 的 N a x
与 3 0 m m 3 g l a s s m i lk , 混匀后 4 ℃ 静置 1 0 m i n . 5 0 0 0 : 室温离心 1 m i n 后弃上清 . 沉淀用 2 0 0
m m 3 洗涤液 ( 5 0 % 乙醇 , 2 0 m m o l / d m 3 T r iS 一 H e l , p H 5 . 0 , 1 m m o l / d m 3 E D T A , 0 . 1 mo l / dm 3
N a CI )轻轻冲散并悬浮均匀 . 8 0 0 r 离心 1 im n 后 去上清 , 沉淀用同样条件再洗涤一次 . 结合
有 D N A 的 g l a s s m i l k 沉淀经晾干后用 1 5 m m 3 双蒸水悬浮均匀 , 6 5 ℃保温 5 一 1 0 m i n , 12 o o o r
离心 2 m in , 取出上清 , 沉淀用 10 m m ” 双蒸水再洗脱一次 , 合并两次的上清 . 取出的上清即为
纯化的 D N A 溶液 , 可直接用于酶切反应 . 每次纯化同时作 4 一 5 管 , 所有上清合并在一起 .
D N A 浓度较低时将上清浓缩后再用于酶切 .
2
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4 质粒状 D N A 的提取
细胞裂解液变为 : 4 m o l / dm 3 异硫氰酸肌 , 5 0 m m o l / dm 3 T r i s 一 H C I , p H 8 . 0 , z % 十二烷基
肌氨酸钠 , 0 . 2 % 日一琉基乙醇 . 其他提取步骤与提取总 D N A 时相同 .
2期 郭宝太等 : 条斑紫菜高纯度总 DN A 及其质粒状 D N A 的提取 9 1
E x t r a e ti o n o f P la s m i d
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