全 文 :萱藻多糖的制备及抗凝血抗血栓活性研究△
滕洪明1,吕东泽2,戴淑芳2,剧锦哲1,李巧梅1,邹向阳1*
(1.大连医科大学生物技术系,辽宁 大连116044;2.大连医科大学基础医学院,辽宁 大连116044)
摘 要:目的 制备萱藻多糖并对家兔体外凝血及小鼠体内血栓形成的抑制作用进行研究。方法 采用热水浸
提-乙醇沉淀法制备萱藻多糖;检测家兔心脏动脉血活化部分凝血酶时间(APTT),凝血酶原时间(PT)和凝
血酶时间(TT)。以角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓模型,检测萱藻多糖体内抗血栓作用。结果 萱藻多糖可显著
延长家兔血浆APTT、PT和TT;对角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓具有显著的抑制作用(P<0.01)。结论 萱
藻多糖具有抗凝和抑制实验性血栓形成的作用。
关键词:萱藻;多糖;抗凝血活性;血栓形成
中图分类号:TQ460.6,R965 文献标识码:A 文章编号:1002-3461(2012)01-0025-04
Preparation of the polysaccharides from seaweed Scytosiphon lomentarius
and studies on its anticoagulant and antithrombotic activities
TENG Hong-ming1,LDong-ze2,DAI Shu-fang2,JJin-zhe1,
LI Qiao-mei 1,ZOU Xiang-yang1*
(1.Department of Biotechnology,Dalian Medical University,Dalian116044,China;
2.College of Basic Medicine,Dalian Medical University,Dalian116044,China)
Abstract:Objective To prepare the polysaccharides fromScytosiphon lomentarius(SLPS)and to investi-
gate its inhibiting blood coagulation and thrombosis activities.Methods Scytosiphon lomentarius poly-
saccharides were extracted by using hot water extraction and ethanol precipitation.The activated partial
thromboplastin time(APTT),prothrombin time(PT)and thrombin time(TT)in the rabbits were
tested by clotting model in vitro.Mouse model of thrombosis induced by injecting carrageenin was ap-
plied to detect the antithrombotic effects.Results The polysaccharides could significantly prolong
APTT,PT and TT,inhibit tail thrombosis induced by carrageenin in mice(P<0.01).Conclusion The
polysaccharides showed anticoagulant and antithrombotic effect in vivo and in vitro.
Key words:Scytosiphon lomentarius;polysaccharide;anticoagulant activity;thrombopoiesis
由血栓引起的心脑血管疾病,如急性心肌梗
死、脑卒中等血栓性疾病,严重危害着人类健康和
生命。从海洋生物体内寻找和开发抗凝血和抗血
栓活性物,具有广泛的应用前景。萱藻(Scytosi-
phon lomentarius)是生活在海洋中的一种广温性
褐藻,在辽宁、山东等沿海均有分布[1-2],萱藻富含
褐藻酸、岩藻甾醇、豆蔻酸、棕榈酸等,营养丰富,
消费量大,食用价值高[3]。本研究从大连沿海自
然生长的萱藻中分离、纯化萱藻多糖(Scytosiphon
lomentarius polysaccharides,SLPS),并 探 讨
SLPS抗凝血及对实验性血栓形成的影响。
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中国海洋药物杂志2012年2月第31卷第1期 Chin J Mar Drugs,2012February,Vol.31No.1
* △基金项目:辽宁省教育厅高等学校科研项目(No.2009A199);大连医科大学大学生科技创新基金项目(No.20100008)
*通讯作者:邹向阳,女,教授 E-mail:zouxiangyang@126.com
DOI:10.13400/j.cnki.cjmd.2012.01.007
1 材料与方法
1.1 实验动物
新西兰兔,体重2.5~3.5kg,雌雄不限;昆明
小鼠,清洁级,6~8周龄,体重(20±2)g,雌性,大
连医科大学SPF实验动物中心提供。
1.2 药品与试剂
角叉菜胶(Sigma公司);活化部分凝血活酶时
间测定(APTT)、血浆凝血酶原时间测定(PT)和
凝血酶时间(TT)试剂盒(上海太阳生物技术公
司);其他试剂为国产分析纯。
1.3 主要仪器设备
旋转蒸发仪(Thermo Fish);FD-1真空冷冻
干燥 机 (北 京 博 医 康 实 验 仪 器 有 限 公 司);
PLSC200-4血凝仪(北京普利生仪器中心)。
1.4 萱藻多糖的制备
萱藻采自大连黄海海域,经辽宁师范大学王
宏伟教授鉴定为Scytosiphon lomentarius。新鲜
藻体用蒸馏水洗净,55℃干燥后粉碎,按料液比
1∶30(W/V)加入蒸馏水,90℃(pH 8.0),浸提4
h,6层纱布过滤,藻渣按上述过程重复浸提1次,
合并2次滤液,减压浓缩至原体积1/5,3% 三氯
乙酸除蛋白,4 000r·min-1离心20min,上清液加
入95% 乙醇至终浓度70%,静置过夜,4 000r·
min-1离心20min,多糖沉淀以少量三蒸水复溶,对
蒸馏水透析2d,冷冻干燥得萱藻多糖 (SLPS),纯
度大于83% 。
1.5 家兔体外凝血时间测定
采集新西兰兔左心室动脉血,与抗凝剂9∶1
混合,轻度混匀,3 000r·min-1离心15min,收集
上层血浆。将待测血浆分成5份,每份血浆0.5
mL,分别加入等体积的生理盐水以及125、250、
500和1 000mg·L-1 SLPS溶液(生理盐水配
制),制备不同浓度SLPS混合血浆,按试剂盒说
明,血凝仪分别测定 APTT、PT、TT,每组均设6
个平行实验。
1.6 小鼠尾部血栓形成的测定
40只昆明小鼠随机分为5组,每组8只,分设
对照组,SLPS 3个剂量组(50,100和200mg·
kg-1),阿司匹林组(100mg·kg-1),腹腔注射,对
照组注同体积水,连续6d。第4天注射药物1h
后,各组小鼠腰背部皮下注射1%角叉菜胶(生理
盐水配制)0.2mL(100mg·kg-1),室温控制在
16℃,造模后,分别于48h和72h时间点观察并
记录小鼠尾部血栓发生情况,测量小鼠尾部长度
和尾部血栓长度,血栓形成长度占尾部总长度的
百分率,即小鼠尾部血栓形成相对平均长度(rela-
tive average thrombosis length,RATL)(%),计
算RATL抑制率(%)。
1.7 统计学分析
实验数据以珚x±s表示,应用SPSS10.0统计
软件,采用t检验和方差分析进行统计分析。
2 结果
2.1 SLPS对新西兰兔血浆体外凝血的影响
采用凝血仪分别测定萱藻多糖体外对家兔血
浆APTT、PT和TT的影响。结果显示,SLPS在
125~1 000mg·L-1剂量范围内,均可明显延长
APTT、PT和TT(P<0.05,表1)。
表1 萱藻多糖对兔APTT、PT和TT的影响(n=6,珚x±s)
Tab.1 Effects of SLPS on APTT,PT and TT(n=6,珚x±s)
Group APTT/s PT/s TT/s
NS
SLPS 125mg·L-1
SLPS 250mg·L-1
SLPS 500mg·L-1
SLPS 1000mg·L-1
23.37±3.95
32.62±0.70*
37.87±3.89*
47.30±1.13**
111.50±0.71**
7.7±0.14
8.1±0.22*
8.35±0.21**
8.48±0.29**
8.68±0.22**
11.53±0.25
14.0±0.17**
15.73±0.35**
19.65±0.1**
26.45±0.42**
注:与对照组比较,*P <0.05,**P <0.01
Note:*P <0.05,**P <0.01 vs control group
2.2 SLPS对角叉菜胶诱发小鼠尾部血栓形成的
影响
腹腔注射给药后,各实验组小鼠体重、行为和
状态未见明显异常。
注射角叉菜胶初期,对照组和50mg·kg-1组
部分个体尾部出现发红、淤青现象,至48h出现黑
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尾现象,72h时最为严重。各实验组血栓发生率
见表2,100,200mg·kg-1剂量的SLPS可明显降
低角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓发生率,有明显
保护作用(P<0.05)。
2.3 SLPS对角叉菜胶诱发小鼠尾部血栓长度的
影响
100mg·kg-1和200mg·kg-1组分别与对照
组比较,血栓相对长度(RATL)明显减少,淤青和
黑尾程度有明显改善,表明SLPS对角叉菜胶诱导
的小鼠尾部血栓形成有一定的保护作用 (表2,
图1)。
表2 萱藻多糖对角叉菜胶诱导小鼠血栓形成的影响(n=8,珚x±s)
Tab.2 Influence of SLPS on carrageenin-induced thrombosis in mice(n=8,珚x±s)
Group
Thrombosis rate
(%)
RATL
48h 72h
Inhibition ratio of
RATL(%)
(48h/72h)
Control 100 63.5±21.7 81.93±16.4 0
SLPS 50mg·kg-1 75 73.56±9.53 74.0±6.74 -15.84/9.68
SLPS 100mg·kg-1 25 28.04±5.19* 29.38±0.57* 55.84/64.14
SLPS 200mg·kg-1 12.5 11.36±2.14** 12.31±1.89** 82.11/84.98
Aspirin 100mg·kg-1 0 0 0 100
注:与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
Note:*P<0.05,**P<0.01 vs.control group
图1 各实验组小鼠尾部血栓情况
Fig.1 Thrombosis in mice tails
3 讨 论
凝血是机体重要的生理过程,因凝血异常和
血栓形成引起的心脑血管疾病严重危及生命和影
响生活质量。目前,国内外临床使用的主要抗凝
血和溶栓药物大多具有可致血小板减少、出血等
副作用。因此,寻找抗凝血作用适度、起效快、副
作用小的天然药物是研究的热点之一[4]。本研究
观察到,SLPS在125mg·L-1时即可显著延长家
兔APTT、PT和TT,表明SLPS对内源性和外源
性凝血途径均有明显的抑制作用。
本研究利用角叉菜胶建立小鼠尾部血栓模
型,该模型已证明是通过内皮细胞损害与局部炎
症引起[5],而对实验动物血小板数量和聚集性,以
及血液黏度无明显改变。方法简便、直观,可避免
动物死亡。本实验结果显示,SLPS可以显著抑制
角叉菜胶诱导的小鼠尾部血栓形成,明显改善淤
青和黑尾程度,对实验性血栓形成具有明显的抑
制作用。
随着人们对海洋多糖抗凝血、抗血栓、降血脂
及其他药理活性研究的不断深入,多糖已成为生
物医药和化学领域共同关注的热点[6-8]。硫酸多
糖因其具有强阴离子性,可表现出不同程度的抗
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凝血活性[9]。目前关于海藻多糖类物质的抗凝血
活性研究,仅见 Matsubara对松藻属长松藻(Co-
dium cylindricum)中分离的半乳聚糖硫酸酯抗凝
血活性的报道[10]。本研究首次对SLPS的抗凝血
和抗血栓作用进行研究。作为一种硫酸化多糖,
SLPS有望被开发成为一种抗血栓性疾病的海洋
药物。
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mol,2001,28(5):395.
(收稿日期:2011-07-25
櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮櫮
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本期封面为未知种名软体生物,图片由中国科学院上海药物研究所郭跃伟研究员提供。
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