全 文 ：食品研究与开发 2007.Vol.28.NO.08
酯酶(Esterase,EC3.1.1.1)是重要的酶制剂产品,
可催化酯类水解为羧酸和醇,也可催化酯交换、酯化、
醇解和酸解等合成反应,制备用化学法难以合成的手
性化合物,广泛应用于食品工业、医药行业、日用化工
业等领域[1-5]。
酯酶可分解转化合成呈香化合物,在食醋、酱油和
其他酿制食品的酿造中可以利用酯酶催化产生的酯类
来增进香味[6]。酯酶可以提高浓香型曲酒中的己酸乙酯、
乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等四大类酯的含量,提
高产品的优级比率[7-8]。美国利用酯酶催化产生的酯化
香味液进行黄油增香,意大利利用酯酶使干酪增香,日
本利用根霉产生的酯酶合成具有浓郁香的甘油酯等酯
类,酯酶在食品业具有广阔的应用前景[9]。
微生物酯酶是工业酯酶的重要来源,产酯酶真菌
主要是青霉、红曲霉、黑曲霉等[9-11]。裂褶菌(Schizo-
phyllu.commune)ZM37.8是本实验室筛选保存的一株
产酯酶真菌,作者对裂褶菌 ZM37.8酯酶进行分离纯
化,并进行了酶学性质研究,以期为该酯酶的工业化生
产提供实验基础。
作者简介:覃拥灵(1969-) ,男(壮) ,博士研究生,从事应用微生物学
研究。
*通信作者
覃拥灵 1,2,何海燕 1,2,陈桂光 2,李楠 2,梁智群 2,*
(1.河池学院化学与生命科学系,广西 宜州546300;2.广西大学生命科学与技术学院,广西 南宁530005)
裂褶菌(Schizophyllu.commune)酯酶的
分离纯化及酶学性质研究
摘 要:酯酶(esterase,EC3.1.1.1)在食品工业应用广泛。裂褶菌(Schizophyllumcommune)ZM37.8的发酵液经85%饱
和度的硫酸氨沉淀、DEAECellulose52处理后分离纯化得到一种酯酶,该酶分子量大小约为 41.2ku;最适反应温度
为 50℃,70℃保温 30min酶活保留 70%,有较好的热稳定性;最适作用 pH为 6.4,pH在 5.4～7.4之间较稳定,有较
好的耐酸性;Co2+、Cu2+、Zn2+、Li+、Hg2+对酯酶有强烈的抑制作用,而 Mn2+、Ca2+和 Fe3+对其的促进作用明显;该酯酶属于
无底物特异性的非特异性酯酶。酶学性质研究表明该酯酶在食品工业有良好的应用前景。
关键词:酯酶;裂褶菌;酶纯化;酶学特性
PURIFICATIONANDPROPERTIESOFSCHIZOPHYLLUMCOMMUEESTERASE
QINYong-ling1,2,HEHai-yan1,2,CHENGui-guang2,LINan2,LIANGZhi-qun2,*
(1.DepartermentofChemistryandLifeScience,HechiUniversity,Yizhou546300,Guangxi,China;
2.CollegeofLifeScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanni g530005,Guangxi,China)
Abstract:Esterase(est rase,EC3.1.1.1)areofgreatcommercialimportanceduetotheirusageinfoodindustry.
A esterase was separated from Schizophyllum commun ZM37.8 after steps of electrophoretic homogeneity by
successiveammoniumsulfatewith85%saturationprecipitation,DEAECellulose52ion-exchangechromatog-
raphy.BasedonSDS-PAGEanalysis,themolecularweightofthepurifiedesterasewascalculatedtobeapproxi
mately 41.2 ku in monomeric form. The pure enzyme had an optimumpH of 6. 4, it was stable between pH
5. 4-7.4;Theesterasehadanoptimumtemperatureof50℃,about70%oftheenzymeactivitywasretainedat
70℃for30min;EsteraseactivitywasstronglyinhibitedbyCo2+, Cu2+, Zn2+, Li+andHg2+, act vitywasincreased
byMn2+,Ca2+ ndFe3+.Theenzymewasnotaspecificityofthehydrolysissubstratesofesterase.Initialcharacteri-
zationofthepurifiedenzymesuggestedthatitisapotentialcandidateforfoodindustry.
Keywords:esterase;Schizophyllumcommune;purificationofenzyme;enzymeproperties
科学研究
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食品研究与开发2007.Vol.28.NO.08
1 材料与方法
1.1 菌种
裂褶菌(S.Commune)ZM37.8,广西大学生命科学
与技术学院食品发酵研究所筛选保存。
1.2 培养基
PDA培养基[12]。
种子培养基:蔗糖2%,蛋白胨0.2%,酵母浸膏0.2%,
(NH4)2SO40.5%,K2HPO40.1%,MgSO4·7H2O0.05%;
发酵培养基:蔗糖 2%,(NH4)2SO40.5%,K2HPO4
0.1%,MgSO4·7H2O0.05%,FeSO4·7H2O0.001%,NaCl
0.1%(自然pH值)。
以上培养基灭菌条件均为:0.1MPa,20min。
1.3 仪器及试剂
BACKMANJ2-21高速冷冻离心机(美国 Backman
公司);分析天平(瑞士梅特勒);HQL300A柜式恒温冷
冻摇床(中国科学院武汉科学仪器厂);320pHMeter
(Metlertoledo公司);UV-1601紫外分光光度计(日本
SHIMADZU公司);DEAECelulose52(Whatman公
司);蛋白质电泳仪(BI0-RAD公司);SynGene荧光化
学发光凝胶成像系统(Gene公司)。
8000～14400MW透析袋(美国BioShorp);丙烯酰
胺(博盛生物化工进口分装);N,N′-甲叉双丙烯酰胺
(Fluka公司);考马斯亮蓝 R-250(Fluka公司);N,N,
N′,N′-四甲基乙二胺(美国 Promega公司);#SM0431
低分子量质量标准蛋白(Fermentas公司);其他试剂均
为国产分析纯。
1.4 裂褶菌(S.commune)ZM37.8菌株培养条件
裂褶菌接种于种子培养基,种子液100mL/250mL
装瓶,在32℃,180r/min的条件下培养 24h;发酵液
150mL/500mL装瓶,按10%接种量把种子液接入发
酵培养基培养48h,发酵液6000r/min离心10min,收
集上清液即为粗酯酶液。
1.5 酯酶酶活测定方法
参照禹邦超多种形式酯酶总活力的混合底物分光
光度测定法进行测定[13]。
酶活力单位定义:每小时生成 lμmolα-NP(α-萘
酚)为1个活力单位(U)。
1.6 蛋白质浓度的测定
Braford检测法测定[14]。
2 实验结果
2.1 裂褶菌(S.commune)ZM37.8酯酶的分离、纯化
2.1.1 硫酸铵分级沉淀[15]
以初酶液的酶活为 100%计算相对酶活,在 85%
硫酸铵饱和度时,酯酶可沉淀90%以上,选用 85%硫
酸铵沉淀粗酶液,结果见表1。
2.1.2 DEAECelulose52纯化[16]
将经硫酸铵盐析沉淀分离的粗酶液经过 8000～
14400MW透析袋透析浓缩,加入预先用 pH7.3的
PBS缓冲液平衡的 DEAECelulose52(1.8×30cm)柱
中。用1mol/L的NaCl(溶解于pH7.3的PBS缓冲液中)
进行0mol/L～1mol/LNaCl梯度洗脱,流速 1.0mL/min,
5min收集一管,收集酶活性峰,然后透析浓缩。结果
(图 1)表明:图中蛋白质峰出现 4个,而酶活性峰只
出现一个,出现于第 57管与第 73管之间,与第 4个
蛋白质峰重合,可以看出酯酶与其它杂蛋白得到了有
效分离。
酯酶的纯化结果见表 2,10mL的粗酶液经纯化
后酶比活力达323.35U/mg。酶活性部分的活力回收为
50.22%,纯化倍数11.04倍,酶纯化后收得率较高。
2.2 SDS-PAGE电泳[17]
酯酶粗酶液纯化后,浓缩胶4%,分离胶浓度12%
表1 酯酶的硫酸铵分级沉淀
Table1 Purifciationofesteraseassayedbyammoniumsulfate
precipitation
65
51.68
70
63.36
75
78.82
80
87.34
85
92.27
硫酸铵饱和度
Saturationof(NH4)2SO4
酯酶相对酶活
Relativeactivityofesterase
90
93.85
%
图1 酯酶在DEAE-celulose52柱中梯度洗脱
Fig.1 ElutionpaternsofesteraseonDEAECelulose52column
(--◆--)A280吸收光(蛋白质含量)(--▲--)酶活力
表2 酯酶的分离纯化
Table2 PurificationofesterasefromAbsidiaglaucaHagem
总酶活/U
Total
activity/U
875.60
598.42
439.75
总蛋白/mg
Total
protein/mg
29.90
18.23
1.36
比活力/(U/mg)
Specificactivity/
(U/mg)
29.28
32.83
323.35
纯化倍数
Multipleof
purification
1
1.12
11.04
回收率/%
Recovery/
%
100
68.34
50.22
纯化步骤
Variousstages
ofpurification
粗酶液
蔗糖浓缩
DEAEC-52
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图3 酶促反应的最适温度
Fig.3 Theefectsofdiferenttemperatureonesteraseactivities
SDS-PAGE电泳。如图2所示,从DEAECelulose52洗
脱下来的酶在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得到单一条
带,经过 Gene公司 GeneTools软件分析,该酶大小约
为41.2ku。
2.3 酯酶酶促反应的最适温度
50℃为酶的最适反应温度,当温度为70℃时酶活
仍有56%,说明该酶对高温不敏感,结果见图3。
2.4 酯酶的热稳定性试验
以4℃保藏的酶液的酶活力为100%对照,酯酶
在 50℃下保温 30min酶活力保存 98%,在 55℃为
95%,70℃保温30min酶活保存70%,而温度为80℃
时酶活力保留50%,说明该酯酶有较好的热稳定性,
结果如图4。
2.5 酯酶作用最适pH试验
该酯酶最适作用pH为6.4,pH在6.2~7.2之间酶
活较高(见图5)。
2.6 酯酶的pH稳定性
酯酶在不同pH值广泛缓冲液中处理1h,然后测
定该酶活性,结果见图6。pH6.4时酶活不受影响,在
pH5.4～7.4之间酶活力保存 75%以上,pH8.2酶活力
保存35%,pH4.2酶活力保存56%,说明该酯酶有较
好的耐酸性,但耐碱性较差。
2.7 金属离子对酯酶酶活的影响
将 0.1mmol/L不同的无机盐溶液与酶液等量混
合,35℃保温30min后测定处理后酶的酶活力。从表3
图2 酶纯化各阶段的SDS-PAGE图
Fig.2 SDS-PAGEofesteraseatvariousstagesofpurification
M-Fermentas#SM0431低分子量质量标准蛋白;1-纯化后的酯酶
2-蔗糖透析浓缩后粗酶液。
图4 酯酶的热稳定性
Fig.4 Thethermalstabilityofesterase
图5 pH对酯酶活的影响
Fig.5 TheefectsofdiferentpHonesteraseactivities
图6 酯酶的酸碱稳定性
Fig.6 EfectofpHonthestabilityofesterase
ku
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可以看出,CO2+、Cu2+、Zn2+、Li+、Hg2+对酯酶有强烈的抑
制作用,而Mn2+、Ca2+和Fe3+对其的促进作用明显。
2.8 酯酶底物特异性试验
取2mL酶液与 lmmol/L各种酯的水溶液或乳化
液 10mL混匀放入反应器中,在 35℃下,震荡反应
15min后,立即放入冰浴中终止反应,并用 0.01mol/L
的氢氧化钠滴定所释放出的游离酸,同时以在沸水中
失活4min的酶作空白对照,依据酸碱摩尔当量计算
出水解率。
由表4可以看出,裂褶菌酯酶属于无底物特异性
的非特异性酯酶,对各种酯类有不同的水解率。对乙酸
酯类的水解率随着碳原子数目的增加而下降,以乙酸
乙酯的水解率最高,达72.6%,表现出很高的酶活。对
浓香型白酒主体香的复合香气己酸乙酯、乳酸乙酯、乙
酸乙酯、丁酸乙酯均有水解作用。
3 讨论
裂褶菌(S.commune)ZM37.8酯酶经过硫酸铵分级
沉淀,透析袋透析浓缩除盐,DEAEcelulose52离子交
换柱洗脱,收集酶活性峰经SDS-PAGE电泳分析,酯酶
得到有效分离,该酶大小约为41.2ku。该酯酶最适反应
温度为 50℃,该酶最适作用 pH为 6.4,pH在 6.2~7.2
之间较稳定,Li+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+对酯酶有强烈的
抑制作用,而Mn2+、Ca2+和Fe3+对其的促进作用明显。
该酯酶属于无底物特异性的非特异性酯酶,对己
酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯均有水解作用,
对高温不敏感,有较好的热稳定性和较好的耐酸性,有
利于工业化生产。浓香型白酒主体香是以己酸乙酯为
主的复合香气,己酸乙酯含量的高低及与乳酸乙酯、乙
酸乙酯、丁酸乙酯等微量成分的比例关系即决定酒质
的优劣[7,18-19],食品酿造中可以利用裂褶菌酯酶催化产
生的酯类来增进香味。
下一步的研究应对裂褶菌(S.commune)ZM37.8产
酯酶发酵条件进一步优化及放大,提高产酶量;进一步
研究裂褶菌酯酶作用模式和机理,尤其在底物特异性、
位置立体专一性、酶与底物的作用方式等酶学性质的
研究,以掌握其产酶特性,为工业化生产打下基础。
参考文献:
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收稿日期:2007-02-06
表3 金属离子对酯酶相对酶活力的影响
Table3 Efectofmetalionsonrelativeactivityofesterase
相对酶活/%
Relativeactivity/%
100
146.05
169.19
157.52
33.65
无机盐
Metalions
Cu2+
Zn2+
Li+
Hg2+
相对酶活/%
Relativeactivity/%
38.27
54.88
71.91
32.52
无机盐
Metalions
对照
Fe3+
Mn2+
Ca2+
Co2+
表4 裂褶菌(S.commune)酯酶底物特异性试验
Table4 ThespecificitysubstrateexperimentofS.commune
水解率Hydrolysisrates/%
72.6
61.5
43.6
25.8
60.7
38.4
35.9
59.6
酯类Easter
乙酸乙酯Ethylacetate
乙酸丙酯Propylacetate
乙酸丁酯Butylacetate
乙酸戊酯Amylacetate
乳酸乙酯Ethyllactate
己酸乙酯Ethylhexanoate
丁酸乙酯Ethylbutyrate
三醋酸甘油酯Tracetin
科学研究
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