全 文 ：菊花脑大孢子发生 、雌配子体与胚胎发育的研究
滕年军 , 陈发棣＊ , 马旭 , 侯喜林
(南京农业大学园艺学院 , 江苏 南京 210095)
摘要:利用常规石蜡制片 、 组织压片以及显微观察技术对菊属植物菊花脑 (Dendranthemanankingense)大孢子发生 、 雌
配子体及胚胎发育过程进行了研究。研究发现 , 雌蕊具有单子房 、 单胚珠 、 二裂状柱头 , 胚珠为倒生型;大孢子母细胞
经过减数分裂形成线形排列的 4个大孢子 , 其中珠孔端大孢子为功能大孢子 , 能够进一步发育成单核胚囊 , 而合点端的
3个大孢子在发育过程中逐渐解体;胚囊发育为单孢子待宵草型 , 单核胚囊经过两次连续分裂 , 形成四核成熟胚囊 , 成
熟胚囊珠孔端有 2个助细胞和 1个卵细胞 , 胚囊中央有 1个单核中央细胞;胚胎发育过程可分为球形胚 、 心形胚 、 鱼雷
胚和子叶胚 4个阶段;雌配子体和胚胎在发育过程中 , 败育频率分别高达 46%和 75%以上。结果表明 , 菊花脑功能大孢
子位于珠孔端和胚囊发育属于单孢子待宵草型是区别于大多数被子植物的重要生殖特征;雌配子体和胚胎发育过程中的
大量败育现象可能是菊花脑与栽培菊花种间杂交结实率低的一个重要原因。
关键词:菊花脑;雌配子体;胚胎
中图分类号:S682.1+1　　　文献标志码:A　　　文章编号:1000-2030 (2008)04-0032-05
Investigationonmegasporogenesis, megagametogenesisand
embryogenesisinDendranthemanankingense
TENGNian-jun, CHENFa-di＊ , MAXǜ, HOUXi-lin
(CollegeofHorticulture, NanjingAgriculturalUniversity, Nanjing210095, China)
Abstract:Megasporogenesis, megagametogenesisandembryogenesisinDendranthemanankingensewereinvestigatedusingparafin
section, atemporarymountmethodandmicroscopyinthecurrentstudy.Theresultsshowedthatthepistilhadtwostigmasandan
ovarythatcontainedoneanatropousovule.Themegasporocyteunderwentmeiosistoformalineartetradwithfourhaploidmega-
spores.Andthemegasporenearthemicropylecontinuedtodevelopintoafunctionalmegasporethatwoulddevelopintoamononu-
cleateembryosac, whereastheotherthreemegasporesnearthechalazagradualydegenerated.Thedevelopmentofembryosaccon-
formedtotheOenotheratype:themononucleateembryosacunderwenttwosuccessivedivisionstoformamatureembryosacwith
fourcels.Thematureembryosaconlyhadaneggandtwosynergidsnearthemicropyleandacentralcelinthecenter.Theem-
bryounderwentthestagesofglobularembryo, heartembryo, andtorpedoembryotodevelopintomaturecotyledonembryo.The
percentagesofabnormalitiesduringmegagametogenesisandembryogenesiswere46% and75%, respectively.Theseresultssug-
gestedthattworeproductivecharacteristicsinD.nankingense, i.e.thefunctionalmegasporewasnearthemicropyleandthedevelop-
mentofembryosacconformingtotheOenotheratype, wereimportantreproductivehallmarksthatweresignificantlydifferentfrom
thoseinmostangiosperms.Inaddition, thehighpercentageofabnormalitiesduringmegagametogenesisandembryogenesismaybe
themainfactorsresultinginlowseedsetininterspecificcrossbetweenD.nankingenseandotherspeciesinDendranthema.
Keywords:Dendranthemanankingense;femalegametophyte;embryo
菊花脑 (Dendranthemanankingense)为菊科菊属多年生宿根草本植物 , 为栽培菊花近缘种植物 , 原
产于中国 , 江苏 、上海 、 广东 、湖南 、吉林等省有野生种 , 我国南北各地均有少量栽培 , 以南京市栽培
历史较久[ 1-2] 。菊花脑是一种重要特色蔬菜 , 其叶片具有清热解毒 , 调中开胃 , 降血压等功效[ 3] ;更为
重要的是 , 由于其耐热 、 抗旱性强 , 因此在菊花杂交育种中经常作为亲本被采用。但已有研究表明菊花
脑与其他菊属植物进行种间杂交时 , 常存在一系列生殖障碍 , 难以获得杂交种子 , 所以将菊花脑优良基
因转到其他菊属植物中比较困难 [ 4-8] 。因此有必要从植物生殖生物学方面对菊花脑开展研究 , 以便了解
　　收稿日期:2008-01-11
　　基金项目:中国博士后科学基金资助项目 (20060400945);江苏省博士后科研资助计划项目 (0602043B);教育部新世纪优秀人才
支持计划项目 (NCET-06-0489)
　　作者简介:滕年军 , 博士。＊通讯作者:陈发棣 , 教授 , 主要从事花卉遗传育种研究 , E-mail:chenfd@njau.edu.cn。
　南京农业大学学报　2008, 31 (4):32-36JournalofNanjingAgriculturalUniversity
其杂交的生殖障碍所属类型及其发生的阶段。但迄今为止 , 关于菊花脑的生殖生物学研究国内外尚未见
报道。本文旨在通过对菊花脑部分生殖生物学特性的研究 , 以了解其大孢子发生 、 雌配子体和胚胎发育
等生殖生物学特征 , 阐明菊花脑有性生殖能力低以及其与其他菊属植物种间杂交结实率低的原因。研究
结果不仅将为今后采取有效措施提高菊花脑有性生殖能力和菊花脑与栽培菊花种间杂交效果提供一定的
理论基础 , 而且还可以丰富菊属植物生殖生物学资料。
1　材料与方法
菊花脑种植于南京农业大学 “中国菊花种质资源保存中心”, 于 2006年 10月中旬至 11月下旬 , 每
隔 3 d分 11次对花序进行采样 , 每次采 20个左右头状花序 , 用 FAA固定液 (V(70%乙醇)∶V(冰醋
酸)∶V(福尔马林) =90∶5∶5)固定 , 样品保存于 4 ℃冰箱中备用。常规石蜡制片技术制片 , 每次对
100 ～ 120个小花进行切片 , 制片 80 ～ 100张 , 先后切了 1 200多个小花 , 总共制片近 1 000张。切片厚
度 8 μm, 铁矾苏木精染色 , 显微镜 (ZeisAxioskop40)下观察并用数码相机 (AxiocamMRC)进行拍
照 [ 9-10] 。
另一部分样品用卡诺氏固定液 (V(冰醋酸)∶V(乙醇) =3∶1)固定 30 min后转入到 70%乙醇
中 , 然后将样品保存于 4℃冰箱备用 。在室温下利用 1mol· L-1 NaOH对样品处理 8h后 , 用蒸馏水洗
清样品 3次 , 然后将样品置于载玻片上 , 滴几滴 0.01%苯胺蓝溶液 (0.1 mol· L-1 K3PO4 +18%甘
油), 用盖玻片盖上 , 并对样品轻轻挤压 。样品置荧光显微镜 (ZeissAxioskop40)下进行观察 , 其中激
发光栅 (excitationfilter)为 BP395-440, 分色光栅 (chromaticbeamspliter)为 FT460, 阻光滤片
(barrierfilter)为 LP470, 并用数码相机进行拍照 [ 9 -10] 。
2　结果与分析
2.1　花部形态观察
菊花脑为头状花序 , 着生于枝顶端 , 聚集成圆锥状 。花序黄色 , 花序直径 1 ～ 1.5 cm, 由舌状花和
管状花组成 。边缘一轮舌状花为单性花 , 只有雌蕊;内部多轮管状花为两性花 , 管状花有四强雄蕊 , 一
枚雌蕊 , 柱头二裂 (图 1-1)。花期为 10月中旬至 11月中下旬 , 花序开花顺序由边缘向中心依次进行 。
当雌蕊柱头呈锐角型时 , 柱头表面有大量乳状突起 , 当突起表面具有大量黏液时 , 柱头具有可授性
(图 1-2)。
2.2　大孢子发生及雌配子体发育
菊花脑为单子房单胚珠 , 胚珠为倒生型 , 孢原细胞位于珠心表皮下方 。孢原细胞直接发育成大孢子
母细胞 , 与周围珠心细胞相比 , 大孢子母细胞体积较大 , 具有明显的细胞核 , 其细胞核体积也比周围细
胞的细胞核体积大 (图 1-3)。随后大孢子母细胞经减数第 1次分裂后形成二分体 (图 1-4), 二分体中
具有明显的 2个细胞核 , 并且细胞质浓厚 。接着二分体中 2个细胞核各进行一次分裂形成四分体 , 此时
四分体的体积明显变大 , 四分体中的 4个大孢子成线形排列 , 其中珠孔端大孢子为功能大孢子 , 而合点
端的 3个大孢子在发育过程中依次沿着合点向珠孔端方向逐渐解体 (图 1-5、 6), 只有珠孔端的大孢子
为功能大孢子 , 将继续发育成单核胚囊。
胚囊发育属于单孢子胚囊待宵草型。珠孔端功能大孢子体积纵向扩展 , 发育成单核胚囊 (图 1-7)。
单核胚囊的细胞核经过一次有丝分裂 , 形成二核胚囊 , 二核胚囊体积没有显著变大 (图 1-8)。接着二
核胚囊中的 2个细胞核各自进行一次有丝分裂形成四核胚囊 (图 1-9、 10), 与二核胚囊相比 , 四核胚
囊的体积显著增大。随后四核胚囊细胞化 , 3个细胞位于珠孔端 , 另 1个细胞移到细胞中央 , 此时的胚
囊为成熟胚囊。
2.3　胚胎发育
菊花脑精子与卵细胞受精后形成合子 , 合子经过多次有丝分裂 , 逐渐形成球形胚 (图 2-1), 其中
球形胚的胚柄部分固着在胚囊的珠孔端 , 以便从母体中吸收养分供自身发育所用 , 其中胚柄基部与珠孔
相连的一个细胞明显变大 (图 2-1中白色箭头所指)。随着球形胚细胞的进一步分裂 , 出现子叶原基 ,
球形胚发育成心形胚 (图 2-2、 3), 接着心形胚的细胞继续进行有丝分裂 , 但由于心形胚两角的细胞分
裂速度比胚其他部位细胞的分裂速度快 , 发育形成了鱼雷形胚 (图 2-4)。鱼雷形胚进一步发育 , 最终
·33·第 4期　　　　　　　　　　　滕年军等:菊花脑大孢子发生 、 雌配子体与胚胎发育的研究
形成成熟的子叶胚 (图 2-5、 6)。菊花脑从开始传粉 、合子分裂一直到发育形成子叶胚所需的时间大约
为 25d左右。
图 1　菊花脑雌蕊结构 、 大孢子发生与雌配子体发育过程
Fig.1　Pistilstructure, megasporogenesisandmegagametogenesisinDendranthemanankingense
1.雌蕊二裂柱头 Twostigmasofthepistil;2.柱头乳状突起 Papilae;3.大孢子母细胞 Megasporocyte;4.二分体的细胞核 Twonu-
cleiofthedyad; 5.四分体阶段 , 已经降解的合点端 2个大孢子 ( )和珠孔端的 2个大孢子 ( )Atthestageoftetrad, twodegenerated
megasporesnearthechalaza( ), andtwomegasporesnearthemicropyle( ); 6.四分体阶段 , 已经降解的合点端 3个大孢子 ( ), 珠
孔端的功能大孢子 ( )Atthestageoftetrad, threedegeneratedmegasporesnearthechalaza( ), andthefunctionalmegasporenearthemi-
cropyle( );7.单核胚囊细胞核 Thenucleusofthemononucleateembryosac;8.二核胚囊中 2个细胞核 Twonucleusofthemononucleate
embryosac; 9.成熟胚囊的助细胞核 ( )和卵细胞核 ( )Thematureembryosac:thenucleusofonesynergid( )andthenucleusof
theegg( ); 10.成熟胚囊的助细胞核 ( )和中央细胞核 ( )Thenucleusofanothersynergid( )andthenucleusofthecentralcell
( )
M表示珠孔 , C表示合点。 MindicatesmicropyleandCindicateschalaza.Thesameasfolows.
图 2　菊花脑胚胎发育过程及大孢子发生 、 雌配子体与胚胎发育中败育现象
Fig.2　Embryogenesisandtheabnormitiesduringmegasporogenesis, megagametogenesisandembryogenesisin
Dendranthemanankingense
1.球形胚 ( )和液泡化的胚柄细胞 ( )Globularembryo( )andthevacuolatedsuspensorycel( ); 2.心形胚 ( )The
heartembryo( ); 3.利用活体压片技术在荧光显微镜下所拍摄的心形胚 Thepictureofheartembryo, photographedunderfluorescencemi-
croscopyusingatemporarymountmethod;4.鱼雷胚 Torpedoembryo;5.子叶胚 ( )Cotyledonembryo( );6.在体视显微镜下拍摄的
子叶胚的立体结构 Thepictureofcotyledonembryo, photographedunderadissectingmicroscope; 7.已经降解的大孢子母细胞 ( )Thede-
generatedmegasporocyte( ); 8.四分体中的 4个大孢子的降解残留物 ( )Remainsoffourdegeneratedmegasporesinthetetrad( );9.
胚囊中的细胞已降解 Thedegeneratedembryosac; 10.正在降解的球形 ( )Thedegeneratingglobularembryo( )
·34· 　　　　　　　　　　　　　　南　京　农　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　第 31卷
2.4大孢子发生 、 雌配子体与胚胎发育中的败育现象
通过对 1 200多个小花近 1 000张组织切片的观察 (其中大孢子发生阶段大约 300张 , 雌配子体发
育阶段约 300张 , 胚胎发育大约 400张), 发现在大孢子发生 、 雌配子体与胚胎发育中均出现了各种败
育现象 , 但在这 3个发育过程 , 败育频率并不一致 。其中在大孢子发生过程中 , 败育频率比较低 , 大约
只有 12%, 败育现象主要表现为大孢子母细胞异常降解 (图 2-7)或四分体中的 4个大孢子全部降解
(图 2-8)。在雌配子体发育过程中 , 败育频率却高达 46%以上 , 败育现象主要表现为成熟胚囊中没有内
含物或胚囊中的细胞核异常降解 (图 2-9)。在胚胎发育过程中 , 败育频率累计高达 75%, 其中大部分
胚胎在胚胎发育早期由于胚中细胞异常降解而停止发育 (图 2-10)。
3　讨论
在被子植物中 , 大孢子母细胞经过减数分裂之后形成了线形排列四分体 , 但 4个大孢子也有成 T形
排列的情况 , 这是因为在合点端的二分体细胞横向分裂 , 而在珠孔端的二分体细胞垂直分裂的结果 。大
多数被子植物的四分体中 4个大孢子细胞呈线形排列[ 11-13] ;但在有的植物中 , 多数四分体中 4个大孢
子细胞呈线形排列 , 也有少部分四分体中 4个大孢子细胞呈 T形排列 , 如羊草[ 10, 14] 。在本研究中 , 四
分体中 4个大孢子细胞呈线形排列 , 没有观察到 T形排列的四分体 。四分体形成以后 , 4个大孢子中有
3个相继降解 , 只有 1个大孢子能够继续发育形成胚囊 , 该大孢子称之为功能大孢子[ 11, 13] 。通常四分体
合点端的大孢子为功能大孢子 , 能够继续发育形成单核胚囊 , 如小麦 、 水稻 、羊草 、百合等 [ 11] ;只有
在极少数植物中 , 四分体珠孔端的大孢子是有功能的 , 能够继续发育形成胚囊 , 而其余 3个大孢子则沿
着合点向珠孔端方向相继解体 , 如柳叶菜科中的大部分植物[ 11] 。在本研究中 , 我们发现菊花脑四分体
中的功能大孢子位于珠孔端 , 而不是位于合点端 , 这是菊花脑的一个重要生殖特征 , 有别于多数合点端
为功能大孢子的被子植物 。
被子植物胚囊发育类型有多种 , 如蓼型 、待宵草型 、 葱型 、 五福花型 、 白花丹型等[ 11-12] , 其中最
普遍的胚囊发育类型为蓼型。据报道被子植物中大约 80%的植物胚囊发育类型属于蓼型 [ 9, 12] , 常见的
蓼型胚囊发育类型植物有百合 、 小麦 、羊草等 [ 12-13] 。在本研究中 , 我们观察到菊花脑单核胚囊中细胞
核经过两次分裂形成四细胞成熟胚囊 , 其中珠孔端有 2个助细胞和 1个卵细胞 , 胚囊中央具有 1个单核
中央细胞。根据胡适宜[ 11]对被子植物胚囊发育类型的划分 , 菊花脑胚囊发育类型应该属于单核胚囊待
宵草型 。通常认为 , 被子植物同一个科中的所有物种的胚囊发育类型是一样的 , 如禾本科中所有的植物
胚囊发育类型均为蓼型[ 10, 12, 15] 。本研究表明菊花脑胚囊发育类型属于单孢子待宵草型 , 而菊科中有一种
植物除虫菊 (Chrysanthemumcinerariaefolium)的胚囊发育类型却不是单孢子待宵草型 , 其胚囊发育类型
有除虫菊型 Ⅰ和除虫菊型Ⅱ两种 [ 11] ;菊科中的另一种植物普通菊蒿 (Tanacetumvulgare)的胚囊发育基
本上是德鲁撒型 [ 11-12] ;此外 , 菊科中的金光菊属 (Rudbeckia)和天人菊属 (Gailardia)中的一些植物
胚囊发育却属于贝母型[ 11] 。因此 , 我们认为被子植物同一个科中的所有物种的胚囊发育类型并不都是
一样的 , 至少在菊科中植物的胚囊发育类型有很多种类 。
在本研究中 , 大孢子发生 、雌配子体与胚胎发育中均出现了不同程度的败育现象。其中在大孢子发
生阶段败育频率比较低 , 只有 12%左右 , 这属于正常的败育频率 , 因为大多数植物在此发育阶段的败
育频率一般为 5% ～ 15%[ 10] 。但从功能大孢子到成熟胚囊的发育过程中 , 胚囊败育频率却显著增加到
46%以上。而在胚胎发育过程中 , 累计败育频率竟高达 75%以上。根据本研究结果 , 我们可以初步估
算出菊花脑最高理论结实率:菊花脑在传粉受精之前 , 胚囊败育率为 46%, 也就是最多有 54%左右的
胚囊能够进行正常的双受精而形成合子;在胚胎发育过程中 , 最多有 25%左右合子能够发育成种子 ,
因此菊花脑的最高理论结实率为 13.5%, 比实际观察值 8%高出 5.5%, 这种差异的主要原因可能是
54%左右正常胚囊只有一部分完成了双受精形成合子。因此 , 我们认为菊花脑低的结实率可能主要归因
于传粉受精前大量胚囊败育和胚胎发育过程中大量胚胎异常降解或停止发育所致。此外 , 一部分正常胚
囊不能够进行正常双受精也可能是引起菊花脑结实率低的一个原因。所以 , 要阐明菊花脑结实率低的问
题 , 势必还需要进行小孢子发生 、雄配子体发育及传粉和受精生物学等方面的研究 。
致谢:本文得到了中国科学院植物研究所母锡金和林金星两位研究员的指导和帮助 , 特此致谢!
·35·第 4期　　　　　　　　　　　滕年军等:菊花脑大孢子发生 、 雌配子体与胚胎发育的研究
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