全 文 ：山东科学
SHANDONG SCIENCE
第 28 卷 第 1 期 2015 年 2 月出版
Vol． 28 No． 1 Feb． 2015
DOI:10． 3976 / j． issn． 1002 － 4026． 2015． 01． 002 【中药与天然活性产物】
收稿日期:2014-11-09
基金项目:2013 年科研院所技术开发研究专项(2013EG167229)
作者简介:仙云霞(1989 －)，女，硕士研究生，研究方向为中药与复方活性成分及质量控制研究。
* 通讯作者，于金倩(1987 －)，女，助理研究员，博士，研究方向为天然产物提取分离及标准样品制备。
核磁共振内标法测定覆盆子酮对照品的含量
仙云霞1，2，耿岩玲1，周洪雷2，王晓1，于金倩1*
(1． 山东省科学院中药过程控制研究中心，山东省分析测试中心，山东 济南 250014;
2．山东中医药大学，山东 济南 250014)
摘要:建立了用核磁共振内标法快速、准确地测定覆盆子酮对照品含量的方法。采用 Bruker公司 400 MHz核磁共振仪，
在以氘代 DMSO为溶剂、苯甲酸为内标、测定温度 25 ℃和扫描 32次条件下采集覆盆子酮和苯甲酸混合物的核磁共振氢
谱。以覆盆子酮中化学位移在 δ 6． 97 和苯甲酸中化学位移在 δ 7． 95的质子信号峰为定量峰，其峰面积比 y(As /Ar)与其
质量比 x(ms /mr)的线性回归方程为 y = 0． 197x + 0． 783，相关系数 r = 0． 997 0，含量测定重复性实验的 ＲSD 值为
0． 47% (n = 6)，稳定性的 ＲSD 值为 0． 58%，加样回收率的 ＲSD 值为 1． 18%。测得 3 批覆盆子酮的质量分数分别为
99． 53%，99． 46%和 99． 49%。结果表明，在没有对照品的情况下，核磁共振内标法测得对照品的质量分数略低于 HPLC
的面积归一化法，可用于覆盆子酮对照品的含量测定和质量控制，同时也能够为其他化学对照品的含量测定提供参考。
关键词:定量核磁共振;含量测定;覆盆子酮
中图分类号:Ｒ284． 1 文献标识码:A 文章编号:1002-4026(2015)01-0007-05
1 H-NMＲ spectroscopy based content determination of
4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone
XIAN Yun-xia1，2，GENG Yan-ling1，ZHOU Hong-lei2，WANG Xiao1，YU Jin-qian1*
(1． Process Control Center for Traditional Chinese Medicine，Shandong Analysis and Test Center，Shandong Academy of Sciences，
Jinan 250014，China;2． Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014，China)
Abstract∶ We established a rapid and accurate method for the content determination of 4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone
with quantitative nuclear magnetic resonance． We acquired 1H-NMＲ spectra of the mixture of 4-(p-hydroxyphenyl)-2-
butanone and benzoic acid at 25 ℃ with Bruker 400 MHz spectrometer scanning 32 times，DMSO as solution，and benzoic
acid as internal standard． Proton signal peaks at δ 6． 97 of 4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone and δ 7． 95 of benzoic acid
served as quantification peaks． Linear regression equation of y = 0． 197x + 0． 783 and correlation coefficient of 0． 997 were
obtained for peak areas ratio y(As /Ar)of 4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone andbenzoic acid and mass ratio x(ms /mr)．
ＲSD of 0． 47% (n = 6)，ＲSD of stability of 0． 58%，and ＲSD of recovery rate of 1． 18% were acquired for repeatable tests
of content determination． The contents of 3 batches of 4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone were 99． 53%，99． 46% and
99． 49%． Experimental results show that the concentration of quantitative nuclear magnetic resonance determined 4-(p-
hydroxyphenyl)-2-butanone isslightly lower than that by HPLC without reference substance． The method therefore can be
used for the content determination and quality control of 4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone． It can also provide references
山 东 科 学 2015 年
for content determination of other reference substances．
Key words∶ QNMＲ;content determination;4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone
覆盆子酮(4-对羟基苯基-2-丁酮;4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone)是一种具有覆盆子香气和幽雅果香香
韵的香料，GB 2760-86［1］将覆盆子酮规定为食品添加剂允许使用的食用香料，主要用以配制树莓、葡萄和草
莓等型香精，用于调制食品香料，具有增香、增甜作用，在口香糖、糖果、布丁和饮料中广泛应用。作为修饰
剂，覆盆子酮广泛用于日用香料、食品香料、日化香精和烟用香精中［2］，是目前国内外广泛应用的一种具有
幽雅果香的香料。另外，还具有美白和消炎的功效，广泛应用于化妆品的调配及医药中间体的合成［3］，而且
还用于染料［4］，此外在农业上是一种诱虫剂［5］，具有很大的经济价值。对其含量的测定与分析主要采用气
相色谱法与极谱法［6］，虽然采用色谱法进行含量测定在分离上具有一定的优势，但是由于残留的溶剂、无机
物等杂质与被测物质色谱响应值不同，造成了样品的绝对含量测定结果不准确。而且，采用以上方法测定含
量均需要对照品。
近年来，随着核磁共振波谱仪的普及，定量核磁共振(quantitative nuclear magnetic resonance，QNMＲ)技
术已成为一种日渐成熟的仪器分析方法，目前在化学、生物、食品、农业及医学等领域得到了较广泛的应
用［7］。随着超导高磁场的脉冲傅立叶变换核磁共振谱仪的应用，核磁共振定量分析方法在准确度、灵敏度
及分析速度等方面都得到了极大的提高，已经接近高效液相色谱的水平，而且核磁共振定量法需要的样品量
很少，扫描时间短，样品不需要预处理，测定过程非常方便。核磁共振定量分析法用于样品的含量测定已有
文献报道［8 － 12］，美国药典［13］、欧洲药典［14］和中国药典［15］已经将核磁共振定量法规定为某些药物的标准测
定方法［16］，但是有关采用此方法进行覆盆子酮含量测定的研究未见报道。本研究采用核磁共振内标法对覆
盆子酮对照品的含量进行测定，以期建立在没有对照品的情况下对覆盆子酮的含量测定和质量控制的方法，
并为其他化学对照品含量的测定方法提供参考。
1 实验部分
1． 1 仪器
Bruker 400 MHz超导核磁共振波谱仪。
1． 2 试剂
氘代 DMSO(美国 CIL公司，氘代度 ＞ 99． 9%)，苯甲酸(美国 Sigma 公司，批号 101253928，纯度99． 2%)，
覆盆子酮对照品。覆盆子酮和苯甲酸的结构见图 1。
图 1 覆盆子酮和苯甲酸的化学结构式
Fig． 1 Chemical structure of 4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone and benzoic acid
1． 3 实验条件
测定温度:25 ℃，FT size:131 072，谱宽:15 000． 9 Hz，环境湿度:35%，观察频率:400 MHz，采集时间:
3 s，累加次数:32。
1． 4 实验方法
根据文献［17］报道，分别精密称取适量覆盆子酮对照品和苯甲酸对照品，置于直径 5 mm的核磁共振样
品管中，加适量氘代 DMSO试剂震荡溶解，制成待测试样溶液。在上述实验条件下调整仪器参数，匀场、采
样，得到图谱后再进行相位和基线调整，对覆盆子酮和苯甲酸的定量峰分别进行积分，按照1H-NMＲ 内标法
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第 1 期 仙云霞，等:核磁共振内标法测定覆盆子酮对照品的含量
根据积分结果用以下公式计算样品的质量分数。
Ws(%)=
(As /ns)×Ms ×mr
(Ar /nr)×Mr ×ms
Wr
上述公式中，As 为被测样品定量峰的积分面积，ns 为被测样品定量峰包含的质子数，Ms 为被测样品的分子质
量，Ar 为内标物质定量峰的积分面积，nr 为内标物质定量峰包含的质子数，Mr 为内标物质的分子质量，mr 为
称取的内标物质质量，Wr 为内标物质的质量分数，ms 为样品的质量。
2 结果与讨论
2． 1 溶剂、内标和定量特征峰的选择
测试溶剂应选择对被测样品和内标物溶解性都非常好且不造成干扰的氘代试剂。本研究选择氘代
DMSO为测试溶剂，该溶剂对覆盆子酮和苯甲酸的溶解性都很好，且核磁共振氢谱上溶剂峰在 δ 2． 49，对其
他信号峰无干扰，不会影响含量测定结果。选择苯甲酸为内标物，从苯甲酸的核磁共振氢谱中可以看到苯甲
酸的 2 位和 6 位质子信号在 δ 7． 95，与其他信号完全分开，因此，可作为内标物。
在定量分析之前，已经通过核磁共振一维谱和二维谱对目标化合物的信号进行了全归属。在覆盆子酮
的核磁共振氢谱上可以看到，2 位和 6 位的质子信号化学位移在 δ 6． 97，与其他信号完全分开，因此，可作为
定量分析的特征峰。核磁共振氢谱法测定覆盆子酮含量的图谱见图 2。
图 2 核磁共振氢谱法测定覆盆子酮含量的图谱
Fig． 2 Determination of 4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanonecontent with 1H-NMＲ spectrum
2． 2 线性关系
按 1． 4 的实验方法制备 6 个不同浓度的样品溶液，测定1H-NMＲ谱，分别对覆盆子酮和苯甲酸特征信号
峰的峰面积进行积分，每个样品的积分面积取 3 次积分的平均值，结果见表 1。
表 1 覆盆子酮和苯甲酸的质量及峰面积积分值
Table 1 Mass and integral value of peak area of 4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone and benzoic acid
样品号 Ms /mg mr /mg As Ar
1 4． 0 3． 5 1． 001 5 1
2 5． 0 3． 5 1． 190 9 1
3 6． 0 3． 5 1． 347 8 1
4 7． 0 3． 5 1． 541 1 1
5 8． 0 3． 5 1． 761 6 1
6 9． 0 3． 5 2． 000 8 1
注:Ms:覆盆子酮质量;mr:苯甲酸的质量;As:覆盆子酮峰面积积分值;Ar:苯甲酸峰面积积分值。
以覆盆子酮和苯甲酸的积分面积比值 y对覆盆子酮和苯甲酸质量比值 x 做线性关系图，得回归方程为
y = 0． 197x + 0． 783，相关系数 r = 0． 997 0。结果表明，采用核磁共振内标法对覆盆子酮的含量进行测定，线
性关系良好。
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山 东 科 学 2015 年
2． 3 重复性实验
取 2． 2 的 2 号样品，在上述同一实验条件下重复测定 6 次，以覆盆子酮和苯甲酸定量特征峰的积分面积
比值计算，检测重复性，ＲSD值为 0． 47%。结果表明，此方法重复性良好。
2． 4 稳定性实验
取 2． 2 的 2 号样品，室温下放置，按 1． 4 的实验方法，分别于 0、4、6、8、10 h 后测定，检测稳定性，ＲSD值
为 0． 58%。实验结果表明，样品溶液在 10 h内稳定。
2． 5 加样回收率实验
分别取 6 份已知含量的覆盆子酮样品约 5 mg，精密称定，分别加入高、中、低 3 个浓度的覆盆子酮标准
品，加入 5 mg苯甲酸按 1． 4 的实验方法测定1H-NMＲ 谱，按回收率(%)=(测得含量-样品含量)/标准品添
加量，计算回收率，所得结果见表 2。
表 2 加样回收率实验(n = 6)
Table 2 Experiment of average recovery rate(n = 6)
样品含量 /mg 添加量 /mg 测得量 /mg 回收率 /% 平均回收率 /% ＲSD /%
5． 0 3． 0 8． 005 4 100． 18
5． 0 3． 0 8． 012 3 100． 41
5． 0 5． 0 9． 898 7 97． 97 99． 54 1． 18
5． 0 5． 0 9． 907 4 98． 15
5． 0 7． 0 12． 043 2 100． 62
5． 0 7． 0 11． 899 4 99． 89
2． 6 样品测定
按照上述实验条件和方法，测定 3 批覆盆子酮对照品(各取 8． 0 mg)和苯甲酸(3． 5 mg)特征峰的峰面
积，根据 1． 4 的计算公式计算出覆盆子酮对照品的绝对质量分数，同时采用高效液相色谱(HPLC)法对此 3
批覆盆子酮对照品的相对质量分数进行测定，结果见表 3。由表 3 中可以看到，采用核磁共振波谱法测得覆
盆子酮对照品的质量分数略低于 HPLC 峰面积归一化法。由于样品中含有一定量的水，HPLC 方法中的流
动相与水混溶，HPLC谱中无水峰出现，所以用面积归一化法测得的覆盆子酮的含量偏高，且 HPLC 方法实
验操作繁琐。而 QNMＲ方法称取样品的量为覆盆子酮和吸收水分的总量，实验结果显示的是覆盆子酮的绝
对含量，因而 QNMＲ内标法直接测得的覆盆子酮含量更为准确、可靠，操作更为简单、快速。
表 3 3 批覆盆子酮对照品含量测定结果(质量分数 /%)
Table 3 Determination result for the control content of 3 batches of 4-(p-hydroxyphenyl)-2-butanone
样品批号 NMＲ法测定结果 HPLC法测定结果
130601 99． 53 99． 71
130602 99． 46 99． 61
130603 99． 49 99． 65
2． 7 扫描次数的选择
将扫描次数设定为 4、8、16、32、64、128，对样品分别进行实验。结果表明，扫描次数越多，信号信噪比越
好，但是扫描次数的改变对样品和内标物积分面积的比值没有明显的影响，因此选择扫描次数为 32。
3 结果与讨论
实验结果表明，采用核磁共振波谱法对覆盆子酮含量进行测定，线性关系、重复性和稳定性均良好。此
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第 1 期 仙云霞，等:核磁共振内标法测定覆盆子酮对照品的含量
方法具有高效、简便和无需对照品等优点，含量测定和结构鉴定可同步完成，可以用于其他化学对照品含量
的测定。色谱定性分析依据色谱峰的保留时间，但保留值测定的重复性、可对比性是色谱分析方法仍需致力
解决的一大难题。核磁共振波谱主要依据化学位移、耦合常数和积分强度进行结构定性［18］，比色谱等经典
方法更具有优势。选择合适的、廉价的内标化合物，不需要样品纯品做参比标准，即可根据目标特征峰的积
分强度完成定量分析，在中药及药物分析中具有重要意义。但是核磁共振波谱不具有样品分离功能，不适合
组分复杂的样品分析，而且核磁共振氢谱的谱宽小，化学位移 δ 一般在 － 4 ～ 16 ppm 之间，在分析复杂组分
时信号易重叠，影响定性定量分析结果;同时，核磁共振灵敏度低，样品需要量大，对低含量目标物分析时，需
要引入合适的分离、萃取与富集等前处理技术［12］。因此核磁共振内标法在药物的定量分析中还有待进一步
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