全 文 ：北方园艺 2011(01):133～ 136 ·生物技术·
第一作者简介:张启春(1986-), 男, 在读本科 ,现研究方向为园艺
生物技术。 E-mail:zhangqichunyu@126.com。
通讯作者:张国海(1962-),男,硕士,教授,现主要从事果树种资质
源方面的研究工作。E-mail:zgh ly@163.com。
基金项目:河南科技大学大学生研究训练计划资助项目(SRTP-
2010093)。
收稿日期:2010-10-25
野生茅莓快繁体系的初步建立
张启春 , 韩 　翔 , 赵 　阳 , 王 　楠 , 李云晓 , 张 国海
(河南科技大学 林学院,河南 洛阳 471003)
　　摘　要:以野生茅莓枝条为试材 ,运用组织培养技术 ,对野生茅莓植株再生进行研究。结果
表明:野生茅莓组织培养最佳取材季节是4月份 ,该时期外植体污染率最低;带有1个饱满腋芽的
半木质化茎段是组织培养的理想外植体;带腋芽茎段最佳灭菌方式为 75%乙醇 30 s+0.5%
NaClO 20 min;诱导侧芽的最适启动培养基为 MS +6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L +KT 0.5
mg/L+活性炭1.0 g/ L+蔗糖 30 g/L +琼脂 7.5 g/L;芽的最适增殖培养基为 MS +6-BA 1.0
mg/L+IBA 0.2 mg/L +活性炭 1.0 g/L +蔗糖 30 g/L +琼脂 7.5 g/L;最适生根培养基为
1/2 MS+NAA 0.5 mg/ L+活性炭1.0 g/L+蔗糖 30 g/ L+琼脂7.5 g/L。试管苗练苗移栽成活
率为76.7%。
关键词:野生;树莓;快繁;枝条
中图分类号:Q 949.751.8　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2011)01-0133-04
　　树莓(R.idaeus L.)是蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属
(Rubus L.)植物 ,为多年生落叶果树。全球共有 700余
种 ,我国有 194种88变种。树莓在国际上被誉为“黄金
浆果” ,可供食用 、药用和提取有效成分制作护肤品[ 1] 。
我国北自大兴安岭 ,南至海南岛 ,东至台湾 ,西至新疆均
有野生树莓分布。目前树莓组织培养技术研究主要集
中在国外引进品种上 ,对国内丰富的野生树莓资源却缺
乏足够的重视 ,而组织培养技术对野生树莓种质资源保
存和开发利用具有重要意义[ 1-7] 。现以树莓的野生种茅
莓为试材 ,对其快繁条件进行筛选 ,以期为建立野生树
莓的快繁体系和野生树莓资源的开发利用提供依据。
1　材料与方法
1.1　试验材料
试验材料为河南科技大学试验田内的野生茅莓 ,以
其带有饱满腋芽的健壮枝条为外植体。试验于 2009年
5月至 2010年 7月进行。
1.2　试验方法
1.2.1　外植体的表面消毒　将去除叶片枝条剪成 3 cm
左右的小段 ,流水冲洗1 h后 ,使用中性洗涤液仔细刷洗
茎段表面及腋芽 ,并冲洗干净。在无菌条件下 ,将材料
放入75%酒精中浸泡 30 s ,再转入NaClO溶液中消毒 ,
取出后用无菌水冲洗 5次 ,每次 3 min。将外植体剪成
1 cm 左右带有生长点的小段接种到启动培养基上 ,每个
培养瓶接种 1个外植体。
1.2.2　培养基和培养条件　启动培养 、增殖培养用 MS
作为基本培养基 ,生根培养使用 1/2MS作为基本培养
基 ,再附加蔗糖 30 g/ L、琼脂 7.5 g/L 、活性炭 1.0 g/L。
pH 6.0 ,温度 25℃,光照强度 2 000 lx ,光照时间 16 h。
接种40 d后统计各项观察指标。
1.2.3　不同方法消毒　在 4月 ,剪取半木质化带腋芽茎
段作为外植体。再用 0.1%、0.5%、1.0%的NaClO溶液
各消毒10、20、30 min。
1.2.4　不同类型外植体消毒　在 4月 ,分别选取茎尖 、
未木质化茎段 、半木质化茎段作外植体 ,再分别用0.5%
的NaClO溶液消毒 20 min。
1.2.5　不同取材季节外植体消毒　分别在 4 、6 、8 、10
月 ,剪取半木质化带腋芽茎段作外植体 ,再分别用0.5%
的NaClO溶液消毒 20 min。
1.2.6　启动培养　以半木质化枝条上带有1个饱满腋
芽的茎段为外植体接种到含有不同激素浓度配比的 MS
培养基上进行启动培养。
表1　　 启动培养基配方
启动培养基配方 6-BA/mg·L-1 NAA/mg·L-1 KT/ mg·L-1
1 0.1 0.1 —
2 0.5 0.1 —
3 2.0 0.1 —
4 0.5 0.1 0.1
5 0.5 0.1 0.5
6 0.5 0.1 2.0
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1.2.7　增殖培养　将新长出的健壮芽转接到含有不同
激素浓度配比的 MS培养基上进行增殖培养。
表 2　　 增殖培养基配方
增殖培养基配方 6-BA/mg·L-1 IBA/mg·L-1
1 0.5 0.1
2 0.5 0.2
3 0.5 0.5
4 1.0 0.1
5 1.0 0.2
6 1.0 0.5
7 2.0 0.1
8 2.0 0.2
9 2.0 0.5
1.2.8　生根培养　将新长出的健壮芽转接到含有不同
浓度NAA的 1/2MS培养基上进行生根培养 ,NAA 浓
度分别为0.1、0.2 、0.5 、1.0 、2.0 mg/L。
1.2.9　移栽　在组培室将培养瓶盖拧开练苗 3 d后 ,将
培养基洗掉 ,移栽到经过高压灭菌的培养土(蛭石∶腐
殖土=1∶1)中 ,共移栽 30株。在空气湿度 70%左右 、
温度25℃、光照 2 000 lx 条件下 ,每天光照16 h。
2　结果与分析
2.1　不同方法消毒对消毒效果的影响
从表3可知 ,NaClO浓度的增加和消毒时间的增
加 ,都会使外植体污染率降低 ,死亡率升高。用 0.1%的
NaClO溶液消毒 10 min ,污染率最高 ,死亡率最低。用
1.0%的NaClO溶液消毒 30 min ,污染率最低 ,死亡率最
高。综合考虑 ,用 0.5%NaClO溶液消毒 20 min ,外植
体存活率最高 ,是较理想的消毒处理方法。
表 3　　不同方法消毒对消毒效果的影响
NaClO浓度
/ %
消毒时间
/ min
污染率
/ %
死亡率
/ %
存活率
/ %
0.1 10 76.7 0 23.3
20 73.3 0 26.7
30 66.7 0 33.3
0.5 10 43.3 3.3 53.4
20 30.0 3.3 66.7
30 30.0 6.7 63.3
1.0 10 33.3 30.0 36.7
20 26.7 36.7 36.6
30 26.7 40.0 33.3
2.2　不同类型外植体对消毒效果的影响
从表4可知 ,从茎尖、未木质化茎段到半木质化茎
段随着生长时间增加污染率升高 ,死亡率降低 ,存活率
升高 ,生长状况变好。综合考虑 ,半木质化的带腋芽茎
段存活率最高 ,是组织培养的理想外植体材料。污染率
升高可能是生长时间长 ,外植体带菌多的缘故。死亡率
降低 ,可能是因为随着生长时间变长 ,木质化程度增加 ,
外植体能更好的抵御消毒液的伤害。由于木质化茎段
的腋芽逐渐退化 、死亡 ,不宜作为外植体使用 ,所以在这
步试验中没有使用完全木质化茎段。
表4　　不同类型外植体对消毒效果的影响
位置 木质化程度 芽生长状况 污染率/ % 死亡率/ % 存活率/ %
茎尖 未木质化 很慢且细弱 10.3 63.3 26.4
茎段 未木质化 很慢且细弱 16.5 43.3 40.2
茎段 半木质化 较快且健壮 30.0 3.3 66.7
2.3　不同取材季节对消毒效果的影响
从表5可知 ,在 0.5%的 NaClO消毒 20 min条件
下 ,季节变化对死亡率变化的影响不大。在 4月污染率
最低 ,可能是温度较低导致杂菌活力也较低 ,室外材料
带菌较少的缘故。而 6、8、10月污染率较高 ,这可能是在
高温季节细菌 、真菌大量繁殖 ,室外材料带菌较多的缘
故。综合考虑 ,在4月外植体存活率最高 ,因此4月左右
是选取外植体的理想时期。
表5　　不同取材季节对消毒效果的影响
月份 污染率/ % 死亡率/ % 存活率/ %
4 30.0 3.3 66.7
6 57.3 2.5 40.2
8 61.3 2.8 35.9
10 58.7 3.7 37.6
2.4　不同启动培养基配方对外植体芽萌发的影响
从表6可知 ,6-BA 浓度不高于 0.5 mg/L 的情况
下 ,对芽的萌发生长有促进作用 ,但浓度达到 2.0 mg/L
时 ,对芽的萌发生长作用由促进转为抑制。KT 可以明
显缩短芽开始萌动时间 ,不同浓度 KT 对缩短芽开始萌
动时间的影响变化不大 ,但当 KT 浓度达到 2.0 mg/L
时对芽的生长有抑制作用。6-BA 、NAA和 KT 对芽的
增殖没有明显的作用 ,这可能与选用的外植体已经含有
1个饱满腋芽有关。综合考虑 ,6-BA 0.5 mg/ L、NAA
0.1 mg/L 和KT 0.5 mg/ L是启动培养基的较理想激素
组合。
　表6　不同启动培养基配方对外植体芽萌发的影响
启动培养基配方 芽数/个
芽长
/cm
芽开始萌动时间
/ d 芽生长状况
1 1 1.5 15 d左右 健壮
2 1 3.0 15 d左右 健壮
3 1 2.5 15 d左右 苗细弱黄化
4 1 4.0 5 d左右 健壮
5 1 4.5 5 d左右 健壮
6 1 2.5 5 d左右 粗壮但黄化
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北方园艺 2011(01):133～ 136 ·生物技术·
2.5　不同增殖培养基配方对芽增殖的影响
从表7 可知 ,随着 6-BA 浓度增高 、6-BA 与 IBA的
比值越大 ,增殖系数也增大。当6-BA浓度达2.0 mg/ L、
分化系数在4.8以上时 ,增殖芽会出现细弱黄化的现象。
从增殖系数和生长状况考虑 , 6-BA 1.0 mg/L 、IBA
0.2 mg/ L是芽增殖培养基的较理想激素组合。
表 7　不同增殖培养基配方对芽增殖的影响
增殖培养基配方 增殖系数 生长状况
1 1.5 健壮
2 1.7 健壮
3 1.2 一般
4 3.7 健壮
5 4.1 健壮
6 3.4 一般
7 6.3 细弱
8 5.5 细弱
9 4.8 细弱黄化
2.6　不同浓度NAA对生根的影响
从表8可知 ,当 NAA 浓度不高于 0.5 mg/L 时 ,随
着浓度的升高 ,平均生根数增加 ,根系也较粗壮。但当
NAA浓度高于 0.5 mg/L 时 ,随着浓度的升高 ,平均生
根数减少 ,根系变得细小 ,须根数也很少。从生根数和
根系生长状况考虑 ,NAA生根培养适宜浓度为 0.5mg/ L。
表 8　　不同浓度NAA对生根的影响
NAA/mg·L-1 平均每株生根数/条 根系生长状况
0.1 2.3 粗壮
0.2 3.1 粗壮
0.5 4.2 粗壮
1.0 2.6 细小
2.0 1.7 细小
2.7　试管苗的移栽
经室内培养 20 d再移到室外继续培养 ,室外培养
20 d后统计总成活率为 76.7%。这可能是由于突然由
室内转到室外培养时 ,环境过渡太快 ,叶面蒸腾增加 ,根
系吸水不足 ,造成部分根系较弱的苗木萎蔫死亡。
3　结论与讨论
从污染率 、死亡率和存活率方面综合考虑 ,用 0.5%
的 NaClO溶液消毒 20 min是较理想的消毒方法 ,半木
质化的带饱满腋芽的茎段为野生茅莓组织培养的理想
外植体材料 ,4月左右是选取外植体的理想时期。试验
结论与王岳英[ 2]的相近。即使 4月剪取半木质化带腋芽茎
段 ,以0.5%NaClO处理 20 min存活率也仅有66.7%。
启动培养基以 MS +6-BA 0.5 mg/ L+NAA 0.1
mg/L+KT 0.5 mg/ L+活性炭1 g/ L+蔗糖 30 g/ L+
琼脂 7.5 g/L 为宜 ,5 d左右就可萌发 ,芽长达4.5 cm ,
叶绿色 ,生长健壮 ,是较理想的启动培养基。试验结论
与袁艺等[ 3] 的有一定的差别 ,可能是由于种类不同的缘
故。试验发现外植体所带腋芽越饱满则其萌发越快 ,故
该试验均选用带有饱满腋芽的外植体。
芽增殖的培养基以 MS +6-BA 1.0 mg/L +IBA
0.2 mg/L+活性炭1 g/L+蔗糖 30 g/L+琼脂 7.5 g/L
为宜 ,增殖系数可达到4.1且生长健壮 ,是较理想的芽增
殖培养基。试验结论与安伟等[ 4] 的相近。
生根培养基以 1/2 MS+NAA 0.5 mg/ L+活性炭
1 g/ L+蔗糖 30 g/ L+琼脂 7.5 g/L 为宜 ,生根系数可
达4.2且根系生长粗壮 ,是较理想的芽增殖培养基。试
验结论与王岳英等[ 2]的相近。
4　展望
树莓在栽培中一般采用扦插 、压条、分株和根蘖等
无性繁殖方法 ,但长期的田间无性繁殖 ,使病毒积累 ,危
害加重 ,导致产量下降 ,品质变劣 ,给生产造成重大的经
济损失。通过组织培养 ,可以对植株进行脱毒复壮 ,保
持植物的优良特性和性状 ,防止品种过快退化。因此 ,
对树莓的组织培养技术进行研究 ,可以迅速提供大量优
质苗木 ,促进树莓新品种的选育 ,推动树莓产业更快更
好的发展[ 8] 。希望该试验的结论对野生树莓资源的开
发利用能起到一定的参考作用。
参考文献
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Initial Establishment of Rapid Propagation of Wild Rubus parvifolius Linn
ZHANG Qi-chun , HAN Xiang , ZHAO Yang , WANG Nan , LI Yun-xiao , ZHANG Guo-hai
(Forestry College of Henan University of Science and Technology , Luoyang , Henan 471003)
Abstract:With the branch of wild Rubus parvi folius Linn.as test material , through tissue culture technology , plantlet
regeneration of wild Rubus parvi folius Linn.was studied.The results indicated that the optimal time of drawing
material for wild Rubus parvi folius Linn.tissue culture was April;during this period , the contamination rate of explant
was the lowest;the semi-lignified stem with an axillary bud was the ideal explant for tissue culture;the optimal
sterilizing treatment for the stem with an axillary bud was 75% alcohol 30 s +0.5%NaClO 20 min;The optimal
medium for starting training was MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.5 mg/L +active carbon 1.0 g/ L+
sucrose 30 g/L+agar 7.5 g/L;The optimal medium for bud proliferation was MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L+active
carbon 1.0 g/ L+sucrose 30 g/L+agar 7.5 g/L;The optimal medium for rooting was 1/2MS+NAA 0.5mg/ L+active carbon
1.0 g/L+sucrose 30 g/ L+agar 7.5 g/ L;76.7%plantlets survived after acclimatization and transplanted.
Key words:wild;raspberry;rapid propagation;branch
第一作者简介:刘丹(1984-),女, 在读硕士 ,现主要从事果树生物
技术研究工作。
通讯作者:高庆玉(1960-),男,博士,教授,现主要从事逆境生理及
果树栽培学教学与科研工作。E-mail:gaoqingyu@tom.com。
基金项目:国家公益性行业农业科研专项基金资助项目(ny-
hyzx07-028)。
收稿日期:2010-10-22
树莓果实总 RNA提取方法的比较研究
刘 　丹1 , 高 庆玉1 , 张 丙秀1 , 焦奎 宝2
(1.东北农业大学园艺学院 ,黑龙江哈尔滨 150030;2.黑龙江省农业科学院浆果所,黑龙江绥棱 152204)
　　摘　要:比较了SDS法和 Trizol法提取树莓果实总 RNA的效果。结果表明:Trizol法提取
的 RNA经电泳检测 ,未见条带 ,说明 Trizol 法并不适合富含多糖多酚的树莓。SDS 方法提取树
莓果实总 RNA完整性好 ,28S和 18S条带清晰 ,OD260/OD280值为 1.83 ,在 1.7 ～ 2.0之间 ,OD260/
OD230值为2.01。结果证明 ,SDS法提取的总 RNA可直接用于分子克隆等分子生物学实验。
关键词:树莓;总 RNA ;SDS法;Trizol法
中图分类号:S 663.2　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2011)01-0136-03
　　树莓(Rubus spp.Raspberry)为聚合果 ,果实柔软多
汁 ,色泽鲜艳 ,味酸甜而富芳香 ,其VE和 SOD的含量为
水果之最 ,属高钾低钠果品[ 1] ,有止渴 、除痰、发汗 、活血
等功效。树莓不仅适于鲜食和加工而且是重要的功能
及保健水果 ,在食用及药用等方面极具发展前途。随着
生物技术的进步和发展 ,人们对植物的许多生理特性进
行到了分子水平的研究 ,进行 Northern杂交分析 、cDNA
文库构建等分子生物学研究均需要高质量的 RNA[ 2] ,而
由于材料本身的内源 RNA 酶和外源 RNA酶的影响 ,
RNA的提取条件比 DNA 要苛刻得多。关于树莓果实
组织 RNA提取的研究未见报道。Trizol 是一种新型总
RNA抽提试剂 ,内含异硫氰酸胍等物质 ,能迅速破碎细
胞 ,抑制细胞释放出的核酸酶[ 3] ,具有步骤简单 、配制试
剂少等优点[ 4] ,是近年应用较多的植物 RNA 提取方法。
SDS法也是提取果实 RNA常用的方法之一 ,在果树组
织 RNA提取中应用较多。现采用SDS及 Trizol 法对树
莓果实 RNA的提取进行研究 ,旨在选择一种提取高质
量 RNA的方法 ,为后续分子试验奠定基础。
1　材料与方法
1.1　试验材料
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